English

• 1.   引言

  镉(Cd)是一种生物体非必需的有害微量元素，在正常环境中含量很低，但水生生物对镉的富集能力很强，尤其是滤食性的贝类，可富集10⁵~10⁶倍^[1]。由于镉易在生物体内蓄积且难代谢，因此，镉成为影响水产品食用安全的主要重金属，尤其对于具有高富集特性的贝类，如扇贝，在正常环境中也能积累高浓度的镉^[2~4]。镉在生物体内可以与蛋白质、有机酸等结合成有机镉形态存在，也可以离子态存在。环境学和毒理学研究结果证明，镉的毒性与其存在形态有关，离子态镉的毒性较高，结合态和有机态镉无毒或毒性非常微弱^[5]。若简单地仅采用镉的总含量、并以其离子态的毒性效应作为评价标准往往会高估其毒害效应，因此镉的形态差异成为影响具有镉富集特性的贝类等水产品食用安全性评价的关键因素，但有关水产品中镉形态的研究较少。

  现行Cd的检测方法是根据国标GB 5009.15-2014中规定的食品中镉的测定方法，将水产品中各种形态镉通过高温、强氧化剂(HNO₃和HClO₄)消解成离子态镉，该方法检测到的是水产品中镉的总量。研究水产品中镉的化学形态，并建立离子态镉的分析技术具有重要意义。在本研究组前期工作中^[6], 运用体积排阻高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(SEC-HPLC-ICP-MS)分析了海产贝类中Cd的有机形态，结果表明，贝类中的Cd主要以金属硫蛋白(MT)-Cd、谷胱甘肽(GSH)-Cd和半胱氨酸(Cys)-Cd等有机形态存在。李彬等^[7]采用凝胶色谱-高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱/电喷雾质谱分析了富镉蕨类植物根系中镉的总量及其形态分布。但是目前尚没有针对水产品中无机离子态镉的方法研究，国际ISO和CAC标准中均尚无测定水产品中镉离子的方法。本研究在前期Cd形态分析的基础上，进一步研究建立了水产品中离子态Cd的分析方法，并分析了我国主要海产贝类中离子态Cd的含量。本方法为科学评估水产品中镉的食用风险，保障我国水产品质量安全提供了参考。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  Series 200液相色谱仪(HPLC，美国Perkin-Elmer公司)：使用SERIES 200高压液相泵，配有自动进样器，配有保护柱CG5A(4×50 mm)和相同材质填料的CS5A(4×250 mm)阳离子交换色谱柱。Elan DRC II电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS，美国Perkin-Elmer公司)：配有动态反应池，进样系统，射频发生器，等离子体系统，Chromera形态分析全自动处理接口，离子透镜系统，四极杆，真空系统，检测器，气路控制系统。ICP-MS主要工作参数：射频功率(ICP RF Power): 1150 W，等离子体气流速:15 L/min，雾化气流速0.94 L/min，透镜电压7.00 V，辅助气流速1.2 L/min，检测器模拟级电压-1800 V，检测器脉冲级电压900 V，质量通带带宽0.25，采样时间7 min；浸提液为Tris缓冲体系：10 mmol/L Tris缓冲溶液，其中加入0.1 mol/L NaCl(pH 7.5)；流动相组成为50 mmol/L草酸，95 mmol/L LiOH，使用前经过0.45μm滤膜过滤并超声脱气。所用试剂均为优级纯，实验用水均为超纯水。所有容器使用前均以30% HNO₃浸泡过夜后以超纯水反复冲洗。

  Cd²⁺标准使用液：将1000μg/mL Cd²⁺标准溶液稀释为1.00μg/mL Cd²⁺的储备液，置4℃存放备用，由1.00μg/mL Cd²⁺储备液经浸提液稀释成1.0, 5.0, 10.0, 20.0和50.0 ng/mL的系列Cd²⁺标准使用液，现用现配。

  2.2.   样品处理

  扇贝、牡蛎、贻贝、文蛤、菲律宾蛤仔、四角蛤蜊等主要常见海产贝类购于本地农贸市场，解剖后用匀浆器匀浆，称取1.000～2.000 g置于50 mL塑料具塞刻度离心管中, 加入适量(m/v=1∶20)10 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(其中加入0.1 mol/L NaCl, pH 7.5)后，用均质机(德国IKA)混匀后，超声萃取40 min，4℃8000 r/min离心10 min，上清液用0.45μm的水系微孔滤膜过滤，移入进样瓶中，上机测定Cd²⁺的值。

  2.3.   样品中总Cd测定

  称取扇贝、牡蛎、菲律宾蛤仔等贝类样品2.000 g，加入5 mL HNO₃和2 mL H₂O₂，用微波消解仪消解，然后冷却至室温，用超纯水定容至50 mL，用电感耦合等离子体质谱法测定样品中总Cd含量。

  3.   结果与讨论

  3.1.   Cd²⁺分离与检测

  阳离子交换色谱主要分析金属阳离子。由于重金属和过渡元素对阳离子交换树脂有较强的亲和力，需要高离子强度的淋洗液才能洗脱，因此需在流动相中将金属离子转变为配合物，如加入络合剂到流动相中形成络合平衡。一些有机弱酸如柠檬酸、草酸、酒石酸和吡啶-2、6-二羧酸等与金属离子形成阳离子或中性配合物。改变淋洗液的pH值可以使过渡金属分离最佳化。而弱的有机酸只有在解离情况下才可以作为络合剂，因此提高淋洗液的pH值会增加弱酸解离，从而使金属离子形成配合物洗脱出来，由于Li⁺对固定相的亲和力低，因此采用LiOH提高pH值。根据Dionex提供的技术报告(Technical Note27)以及经进一步方法验证，本实验确定分离Cd²⁺的最佳流动相组成为50 mmol/L草酸+95 mmol/L LiOH。从图 1可见，该分离条件下Cd²⁺的分离良好，无杂峰干扰，能够满足对样品中Cd²⁺的分离要求。

  图 1

  

  图 1  扇贝提取液中Cd²⁺分离色谱图

  Figure 1.  Chromatogram of Cd²⁺ in the extract of scallop

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  为保持样品中Cd的形态不发生转化，参考文献[6]，本研究选取Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.5)为提取剂。另外，许多研究表明，用流动相做提取剂可以保持进样溶液的组成、pH和离子强度与流动相一致，避免系统峰对测定的干扰^[8]。但是本实验采用的流动相草酸是一种络合剂，能够与Cd²⁺络合形成配合物，因此，不适合提取本实验样品中的Cd²⁺。

  将Cd²⁺标准溶液用浸提液逐级稀释成1，5，10，20和50 ng/mL的系列标准工作液，Cd²⁺的保留时间为4.95 min. Cd²⁺系列标准溶液的色谱图见图 2。用外标法确定Cd²⁺保留时间及分离度脉冲强度，以浓度为横坐标(x)，脉冲强度积分为纵坐标(y)，拟合计算得到Cd²⁺的标准曲线方程式及相关系数。线性方程式为y=1523.6x+2856.2, 相关系数R=0.999。

  图 2

  

  图 2  HPLC-ICP-MS分析Cd²⁺标准系列溶液谱图

  Figure 2.  Chromatogram of Cd²⁺ standard solutions by HPLC-ICP-MS

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  3.2.   回收率实验

  在确定上述检测方法后，以菲律宾蛤仔、贻贝为测试对象，进行加标回收率和精密度测定，以考察方法的准确度和重现性。测定结果见表 1。试样中Cd²⁺添加回收率>84.6%，RSD为3.2%~6.5%，表明方法的准确度能满足样品的检测要求。

  表 1

  

  表 1  菲律宾蛤仔和贻贝中Cd²⁺加标回收率

  Table 1.  Standard addition recovery of Cd²⁺ in Rudilapes philippinarum and Mgtilus edulis (n=5)

  下载: 导出CSV

  样品 Sample	Cd2+本底值 Cd2+Background (mg/kg)	添加量 Spiked (mg/kg)	Cd2+回收率 Recovery (%)	精密度 RSD (%，n=5)
  菲律宾蛤仔 R. philippinarum	0．0209	0.050	86.2±4.2	4.9
  		0.10	84.6±2.7	3.12
  贻贝 M. edulis	0．128	0.10	92.3±5.2	5.6
  		0.20	96.0±6.2	6.5

  3.3.   实际样品分析

  运用本方法分析贝类样品中无机离子态镉(Cd²⁺)的含量，并且分析了离子态镉含量占总镉含量的百分比。从表 2可见，栉孔扇贝中总镉含量最高，最高为6.38 mg/kg，但离子态镉含量约占总镉的16.4%，为1.05 mg/kg。所以，扇贝中大部分镉以有机结合态形式存在，与文献[6]的结论一致。菲律宾蛤仔、文蛤和四角蛤蜊中总镉含量较低，离子态镉含量占总镉的30%以上。总Cd含量高的样品中无机离子态Cd所占的百分比普遍高于总Cd含量低的样品。本研究结论进一步表明, 对贝类开展镉的风险评估需要结合镉的形态分析才会更准确。

  表 2

  

  表 2  贝类样品中无机离子态Cd²⁺和总Cd含量

  Table 2.  Cd²⁺ and total cadmium content in shellfish

  下载: 导出CSV

  贝类样品 Shellfish		无机离子态 Cd2+ (mg/kg)	总Cd含量 Total Cd(mg/kg)	Cd2+占总Cd百分比 Percentage of Cd2+ in total Cd(%)
  菲律宾蛤仔 R. philippinarum	1	0.055	0.15	37.8
  	2	0.058	0.13	44.6
  	3	0.043	0.18	23.3
  	4	0.042	0.15	27.0
  贻贝 M. edulis	1	0.13	0.78	16.3
  	2	0.15	0.50	29.8
  	3	0.21	0.96	21.9
  牡蛎 Oyster	1	0.47	2.16	21.9
  	2	0.39	1.84	21.5
  	3	0.44	2.24	19.6
  文蛤 Meretrix meretrix	1	0.081	0.20	39.9
  	2	0.067	0.16	40.9
  栉孔扇贝 Chlamys farreri	1	0.77	2.73	28.2
  	2	0.85	4.06	20.9
  	3	1.05	6.38	16.4
  四角蛤蜊 Mactra veneriformis	1	0.049	0.13	36.6
  	2	0.050	0.15	33.3
  	3	0.062	0.17	36.2
  	4	0.066	0.17	37.7

  4.   结论

  在前期贝类中有机态Cd分析研究^[6]基础上，建立了高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)法分析贝类中无机态离子镉(Cd²⁺)的提取、分离和分析方法。本方法准确度、灵敏度较高，满足分析检测要求。运用本方法研究了我国几种常见海产贝类中无机离子Cd²⁺的含量，发现对于高含量镉的贝类如扇贝中无机离子态Cd²⁺的百分比较低，与前期研究^[6]结论一致。

• 1. [1]

     Pigeot J,Miramand P,Guyot T,Sauriau P G,Fichet D,Le Moine O,Huet V.Mar.Ecol.Prog.Ser.,2006,307:101-114

  2. [2]

     Bustamante P,Miramand P.Sci.Total Environ.,2005,337:59-73

  3. [3]

     Bustamante P,Miramand P.Chemosphere,2004,57(10):1355-1362

  4. [4]

     Pan K,Wang W X.Aquat.Toxicol.,2008,90:253-260

  5. [5]

     ZHAO Yan-Fang,NING Jin-Song,ZHAI Yu-Xiu,SHANG De-Rong.Journal of Fisheries of China,2011,35(3):405-409赵艳芳,宁劲松,翟毓秀,尚德荣.水产学报,2011,35(3):405-409

  6. [6]

     ZHAO Yan-Fang,NING Jin-Song,ZHAI Yu-Xiu,SHANG De-Rong.Chinese J.Anal.Chem.,2012,40(5):681-686赵艳芳,宁劲松,尚德荣,翟毓秀.分析化学,2012,40(5):681-686

  7. [7]

     LI Bin,LIU Li,WANG Qiu-Quan,HUANG Ben-Li.Spectroscopy and Spectral Analysis,2010,30(4):1096-1100李彬,刘丽,王秋泉,黄本立.光谱学与光谱分析,2010,30(4):1096-1100

  8. [8]

     Shang D R,Zhao Y F,Zhai Y X,Ning J S,Ding H Y,Sheng X F.Chinese Sci.Bull.,2013,58(35):4437-4442

• 

  Figure 1  Chromatogram of Cd²⁺ in the extract of scallop

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  Figure 2  Chromatogram of Cd²⁺ standard solutions by HPLC-ICP-MS

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  Table 1.  Standard addition recovery of Cd²⁺ in Rudilapes philippinarum and Mgtilus edulis (n=5)

  样品 Sample	Cd2+本底值 Cd2+Background (mg/kg)	添加量 Spiked (mg/kg)	Cd2+回收率 Recovery (%)	精密度 RSD (%，n=5)
  菲律宾蛤仔 R. philippinarum	0．0209	0.050	86.2±4.2	4.9
  		0.10	84.6±2.7	3.12
  贻贝 M. edulis	0．128	0.10	92.3±5.2	5.6
  		0.20	96.0±6.2	6.5

  下载: 导出CSV

  Table 2.  Cd²⁺ and total cadmium content in shellfish

  贝类样品 Shellfish		无机离子态 Cd2+ (mg/kg)	总Cd含量 Total Cd(mg/kg)	Cd2+占总Cd百分比 Percentage of Cd2+ in total Cd(%)
  菲律宾蛤仔 R. philippinarum	1	0.055	0.15	37.8
  	2	0.058	0.13	44.6
  	3	0.043	0.18	23.3
  	4	0.042	0.15	27.0
  贻贝 M. edulis	1	0.13	0.78	16.3
  	2	0.15	0.50	29.8
  	3	0.21	0.96	21.9
  牡蛎 Oyster	1	0.47	2.16	21.9
  	2	0.39	1.84	21.5
  	3	0.44	2.24	19.6
  文蛤 Meretrix meretrix	1	0.081	0.20	39.9
  	2	0.067	0.16	40.9
  栉孔扇贝 Chlamys farreri	1	0.77	2.73	28.2
  	2	0.85	4.06	20.9
  	3	1.05	6.38	16.4
  四角蛤蜊 Mactra veneriformis	1	0.049	0.13	36.6
  	2	0.050	0.15	33.3
  	3	0.062	0.17	36.2
  	4	0.066	0.17	37.7

  下载: 导出CSV
•