English

• 1.   引 言

  结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)是肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性病变^[1]，是全球三大恶性肿瘤之一，且呈明显的逐年上升趋势^[2]。2015年，美国癌症协会的统计报告显示，美国男性和女性CRC的发病率和死亡率均位居恶性肿瘤的第3位^[3]。中国结直肠癌诊疗规范(2015版)数据显示, 我国2011年CRC的发病率和死亡率分别为23.03/10万和11.11/10万，城市地区远高于农村^[4]。该病起病隐匿，早期病变位于黏膜层及黏膜下层，多无明显的临床症状，易被忽视^[5]，且病情发展缓慢，直至中晚期才会出现明显临床症状，严重影响患者的治疗，降低患者的生存期。研究表明，大力开展CRC筛查和早期诊断工作，有助于降低CRC的发病率及死亡率^{[6, 7]}。目前，CRC的诊断方法包括非侵袭性的光学检查和侵袭性的形态学检查^[8]，如粪便排泄物检查、结肠镜检查、CT结肠成像检查、肿瘤分子标记物诊断等^{[9, 10]}。然而，这些诊断方法存在灵敏度低、特异性差、耐受性差、有出血和穿孔的危险、放射性危害等弊端^[6~8]。因此，寻求新型灵敏、准确安全的CRC诊断方法意义重大。

  近年来，随着美国“人类微生物组计划”(Human Microbiome Project, HMP)和欧盟“人类肠道元基因组计划”(Metagenomics of the Human Intestinal Tract, MetaHIT)的启动，肠道菌群与CRC的发病关系成为研究的热点。已有研究表明，肠道菌群失调是诱发CRC的关键因素，这可能与肠道菌群失调导致肠道慢性炎症有关^{[11, 12]}，慢性炎症不断刺激肠道粘膜上皮，通过诱导基因突变，阻止细胞凋亡并刺激血管新生和细胞增殖，最后导致癌变^[13]。目前，16S rRNA基因测序技术是研究肠道菌群的主要方法^[14]，如Zackular等^[15]采用16S rRNA测序技术构建基于肠道菌群研究的CRC筛查方法。然而，该方法费用较高，对粪便样品要求较高，前处理复杂自动化低，测序准确性受多因素影响(如核酸提取、引物的选择、PCR扩增等)^[16]。

  本研究选用肠道菌群最终代谢产物短链脂肪酸(Short-chain fatty acids, SCFAs)反映机体内肠道菌群的状况，构建一种简单、快速测定粪便中SCFAs的GC法，并应用于CRC患者与健康志愿者的粪便检测，科学评价方法的特异性和准确性，以期成为一种CRC的诊断方法。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  GC-2010型气相色谱仪(日本Shimadzu公司)，配有AOC-20i自动进样器；DB-FFAP毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm，美国Agilent公司)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)；XS205十万分之一天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；AL204万分之一天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；SCIENTZ 25-12超声仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

  乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、2-乙基丁酸(内标化合物)对照品(纯度≥99%，美国Sigma公司)；无水乙醇(天津市大茂化学试剂厂)；HCl(天津市津东天正精细化学试剂厂)。

  2.2.   样本资料

  本研究选取2014年12月~2015年1月期间在天津市人民医院收治的CRC患者作为研究对象，患者均已完成病理诊断并确诊为结直肠癌，术前(未给药及放化疗)收集患者粪便样品，立即冻于-80℃冰箱。患者年龄为54~79岁，中位数年龄为65岁；男性7例，女性5例；结肠癌4例，直肠癌8例；Duke分期：A期1例，B期5例，C期4例，D期2例；其中低分化腺癌4例，黏液腺癌2例，中分化腺癌6例，编号P1~P12。本研究经天津市人民医院医学伦理审查批准，粪便样本由张春泽医师收集；所有研究均获患者本人同意并签署知情同意书。

  13名健康志愿者粪便样本由本实验室科研人员提供，粪便样品收集后立即冻于-80℃冰箱，编号N1~N13。纳组标准：(1)既往无严重的消化系统疾病；(2)近期无消化系统不适或疾病；(3)近期无其他疾病、感染；(4)近期未服用过药物；(5)未处于妊娠、哺乳期，女性避开经期。研究经志愿者本人同意并签署知情同意书。

  2.3.   混合对照品溶液配制

  对照品储备液配制：准确称取适量乙酸、丙酸、丁酸对照品，分别以乙醇溶解并定容至25 mL；准确称取适量异丁酸、异戊酸、戊酸标准品，分别以乙醇溶解并定容至10 mL，制成乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸分别为5.577, 2.998, 1.998, 5.188, 2.024和2.193 mg/mL的单一对照品储备液，于4℃保存。

  内标溶液配制：准确称取适量2-乙基丁酸，以乙醇溶解并定容至25 mL，制成5.603 mg/mL内标储备液；准确移取内标储备液16.70 mL，加13.30 mL HCl，并用乙醇定容至1000 mL，即得内标溶液(93.6μg/mL)，于4℃保存。

  混合对照品溶液配制：取上述6个单一对照品储备液适量，加入2.5 mL纯水，100μL HCl、125μL内标储备液，用乙醇定容至10 mL，即得混合对照品储备液；用1% HCl-75%乙醇水溶液(含内标70μg/mL)倍比稀释得到混合对照品工作液。

  2.4.   样品处理方法

  取-80℃冻存的粪便样品，立即用粉碎机粉碎均匀，精密称取0.5 g，加入2.5 mL纯水，涡旋混匀，加入7.5 mL内标溶液，涡旋混匀，14000 r/min离心10 min，取上清液进样分析。

  2.5.   GC条件^[17]

  色谱柱：DB-FFAP(30 m×0.25 mm×0.25μm)；升温程序：初始温度50℃保持1 min，以10℃/min升至190℃；气化室温度：250℃；载气：高纯氮(N₂)，线速度：1.0 mL/min；分流比：50:1；溶剂延迟：7 min；FID检测器：温度：250℃；尾吹气(N₂)：30 mL/min，H₂：47.0 mL/min，Air：400 mL/min；进样量：5μL。

  2.6.   数据处理

  数据采用SIMCA 14软件(Umetrics, Umeå, Sweden)进行主成分分析(Principal component analysis, PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(Orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)。

  3.   结果与讨论

  3.1.   样品处理条件优化

  采用单变量分析法系统考察样品提取条件，包括提取溶剂(甲醇、乙醇)、提取溶剂比例(25%, 50%, 75%, 100%乙醇)、提取溶剂倍数(10, 20, 40倍)，HCl浓度(0%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%)，超声时间(0, 5和10 min)。最终确定采用1% HCl-75%乙醇溶液20倍量提取粪便时，SCFAs的总含量最高。

  SCFAs是碳链为1~6的有机酸^[18]，整体碳数与乙醇更接近，互溶性更好；粪便中SCFAs主要为乙酸、丙酸、丁酸^[17]，极性较大，故含水有机溶剂的提取效果比纯有机溶剂好；此外，SCFAs的酸性较强，在含水有机溶剂中易发生电离，使游离态SCFAs减少，在进行气相分析时，由于离子态SCFAs的沸点较高不易气化，不仅降低响应，而且还会污染甚至损坏色谱柱或仪器，因此需降低提取溶剂的pH值以抑制SCFAs的电离；SCFAs的挥发性较好，易损失，因此不宜采用超声或加热的方式提取。

  3.2.   方法评价

  将2.3节的混合对照品工作液按2.5节的条件测定(图 1A)，以化合物峰面积和内标峰面积比值(Y)对标准品浓度(x, μg/mL)进行线性回归。分别以信噪比3:1和10:1所对应的浓度为检出限和定量限，结果见表 1。结果表明，6个SCFAs在各自的线性范围内线性关系良好(R²=0.9999)；LOD为0.11~0.26μg/mL；LOQ为0.32~0.78μg/mL，表明方法灵敏度高。

  图 1

  

  图 1  混合标准品(A)、健康志愿者(B)、CRC患者(C)的色谱图

  Figure 1.  Representative gas chromatograms of mixed standards solution (A), health volunteer (B) and colorectal cancer (CRC) patient (C)

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  表 1

  

  表 1  短链脂肪酸的回归方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限结果

  Table 1.  Regression equation, correlation coefficient, linear range, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of the six short-chain fatty acids (SCFAs)

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  化合物 Compounds	回归方程 Regression equations	相关系数 Correlation coefficients (R2)	线性范围 Linearity ranges (μg/mL)	检测限 LOD (μg/mL)	定量限 LOQ (μg/mL)
  乙酸Acetic acid, AA	y=0.0050x+0.0084	0.9999	3.632~929.7	0.24	0.73
  丙酸Propionic acid, PA	y=0.0081x+0.0034	0.9999	1.561~399.6	0.26	0.78
  异丁酸Isobutyric acid, IBA	y=0.0111x－0.0012	0.9999	0.325~83.31	0.11	0.32
  丁酸Butyric acid, BA	y=0.0102x－0.0042	0.9999	2.383~610.1	0.20	0.60
  异戊酸Isovaleric acid, IVA	y=0.0129x-0.0024	0.9999	0.534~136.8	0.18	0.53
  戊酸Valeric acid, VA	y=0.0120x－0.0015	0.9999	0.476~121.9	0.16	0.48

  按2.4节制备供试品溶液，按2.5节的条件测定，连续进样6次考察日内精密度，连续测试3天考察日间精密度；平行制备6份供试品溶液，每份样品平行测定2次，考察重复性；制备一份供试品溶液，分别于0，1，2，3，4，5和6 h测定，考察供试品溶液短期稳定性，第7和14天重新制备并测定供试品溶液，考察粪便样品长期稳定性；准确称取粪便样品0.25 g，加入与样品中含量相当的6个SCFAs对照品储备液，按2.4节平行制备6份，按2.5节平行测定2次，进行加样回收实验，结果见表 2。结果表明，所有实验的RSD＜5.7%(除异戊酸长期稳定性)，表明本方法准确、稳定、重复性好；供试品溶液在室温放置6 h稳定；粪便样品在-80℃存放14天稳定。

  表 2

  

  表 2  6个SCFAs的日内、日间精密度，重复性，稳定性和加标回收实验结果

  Table 2.  Intra-and inter-day precisions, repeatability, stability and recovery of the 6 SCFAs

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  化合物 Compounds	日内精密度 Intra-day RSD (%, n=6)	日间精密度 Inter-day RSD (%, n=5)	重复性 Repeatability (n=6)			稳定性 Stability (RSD，%)			平均回收率 Recovery (n=6)
  			平均含量 Mean (μg/g)	RSD (%)		短期 Short-term	长期 Long-term		回收率 Recovery (%)	RSD (%)
  AA	1.0	2．1	3293	2.4		3.3	2.2		98.7	4.4
  PA	1.6	2.4	1486	2.2		4.0	3.4		102.0	4.0
  IBA	3.6	4.7	140	2.6		3.9	2.8		106.3	2.6
  BA	0.9	2.2	2609	2.1		2.0	2.8		104.2	3.8
  IVA	0.8	5.7	262	3.1		0.5	6.5		98.0	2.8
  VA	1.3	3.0	240	1.8		1.1	1.2		100.2	4.6

  3.3.   样品分析

  采用本方法测定13名健康志愿者(图 1B)和12名CRC患者(图 1C)的粪便样品，结果见表 3，志愿者粪便中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸的平均含量分别为3710, 1582, 166, 1992, 301和226μg/g，CRC患者的分别为3357, 1668, 227, 1293, 369和273μg/g。结果表明，与健康志愿者相比，CRC患者粪便中乙酸、丁酸降低较为明显，其余SCFAs变化较小，其中丁酸的含量降低尤为明显，约为健康志愿者的65%。这可能是由于CRC患者肠道中产生SCFAs的有益菌较正常人少，同时，丁酸是大肠上皮细胞的主要能量物质^[19]，肠道发生癌化时，丁酸的消耗量明显增加。

  表 3

  

  表 3  健康志愿者和CRC患者粪便中SCFAs测定结果(μg/g, x±SD, n=3)

  Table 3.  Results of SCFAs in feces from health volunteers and colorectal cancer (CRC) patients (μg/g, x±SD, n=3)

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  样品 Sample	AA	PA	IBA	BA	IVA	VA
  N1	2186±122	1246±69	290±10	2049±115	572±37	393±26
  N2	4364±69	1818±30	181±9	2472±82	278±4	272±6
  N3	3301±16	1494±17	140±5	2588±11	262±11	238±5
  N4	4512±242	1932±120	323±19	1279±87	660±37	37.8±2.1
  N5	3666±388	1105±113	220±18	2362±260	382±38	468±50
  N6	2679±60	815±28	267±3	1200±34	586±1	280±9
  N7	3598±52	1897±51	41.5±2.1	1718±92	69.2±3.2	94.5±5.8
  N8	2589±281	1264±142	213±26	1425±175	346±36	292±41
  N9	3447±186	1312±83	145±10	1488±76	235±12	198±10
  N10	5133±85	2089±31	111±1	2536±33	145±3	180±3
  N11	3707±14	1272±8	102±1	2483±15	179±2	182±2
  N12	4364±118	2870±100	99.0±3.5	1731±48	163±5	242±9
  N13	4686±53	1457±30	23.0±1.4	2544±33	31.1±0.9	65.5±0.8
  P1	6010±28	4162±33	569±13	2964±75	1044±24	1228±25
  P2	6955±262	2665±150	425±21	3680±170	711±37	448±22
  P3	5714±190	3591±115	58.2±0.9	2477±72	61.4±0.5	187±4
  P4	1567±67	842±35	168±3	536±21	232±8	153±6
  P5	2736±190	1421±90	118±8	919±59	193±13	140±4
  P6	2616±30	1578±14	150±6	436±8	152±2	36.7±1.7
  P7	1977±43	1428±20	212±2	597±11	324±1	60.2±0.9
  P8	1258±28	42.7±3.1	49.0±4.0	192±6	104±2	2.4±0.1
  P9	1778±15	639±8	89.4±0.5	697±6	119±2	129±2
  P10	5730±68	1729±26	570±8	1495±21	971±13	492±5
  P11	2417±101	1230±53	189±7	1080±40	352±15	247±10
  P12	1525±24	685±15	120±3	443±7	166±1	153±2

  3.4.   统计分析

  3.4.2.   正交偏最小二乘法判别分析

  将PCA分析后的8名患者和13名志愿者进行OPLS-DA分析，并进行方差分析(CV-ANOVA)。结果显示该模型的R²X(cum)=0.561，R²Y(cum)=0.779，Q²(cum)=0.708，CV-ANOVA p=0.000356566，证实该模型具有较高的解释率和预测率。如图 2B所示，两组样本点在OPLS-DA的得分图上得到很好地区分，表明所建OPLS-DA模型能将CRC患者和健康志愿者正确区分。此外，为了避免模型的过拟合，确保模型的可靠性，本文采用PLS-DA模型进行置换测试。经200次测试，结果如图 2C所示，R²和Q²的验证结果均小于真实模型结果，且Q²的截距小于0，表明该模型有效、可靠，可应用于CRC患者的区分。

  结合协方差p^[1]，相关系数p(corr)，变量投射重要性(Variable importance in projection, VIP)筛选CRC的诊断标志物。判别标准：|p^[1]|>0.2^[20]，|p[corr]|>0.5^[21]，VIP>1.0^[22]。如图 2D所示，乙酸、丙酸、特别是丁酸可作为CRC潜在的诊断标志物。

  3.4.1.   主成分分析

  将3.3节的测定结果作为输入变量进行PCA分析。由图 2A可知，主成分1(PC1)和PC2的累计贡献率为87.2%，其中，PC1=64.1%，PC2=23.1%，Q²(cum)=0.626，表明模式质量良好。如PCA得分图(Score plot)所示，13名健康志愿者和12名CRC患者聚成3类：其中，13名健康志愿者集中分布于得分图中部，提示健康志愿者SCFAs的含量相近；8名CRC患者集中分布于健康志愿者左侧，其SCFAs的含量较低；此外，4名CRC患者位于健康志愿者右侧，且呈离散分布，SCFAs含量均高于健康志愿者。结合病例及电话回访，得知得分图左侧8名患者日常/入院前饮食、作息习惯较为正常，而得分图右侧4名患者，在入院前，有2名患者因腹泻服用活菌制剂，1名患者素爱饮用酸奶，1名患者平时多食用膳食纤维类食物，从而导致该4名患者粪便中SCFAs的量较高甚至超过健康志愿者。本研究旨在构建“基于肠道微生物代谢产物的结直肠癌诊断方法”，需排除特殊干扰因素，故进一步将左侧8名患者和13名志愿者进行正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，探索结直肠癌潜在的诊断标志物。

  图 2

  

  图 2  健康志愿者和CRC患者的主成分分析得分图(A)、正交偏最小二乘法判别分析得分图(B)、置换测试图(C)、OPLS-DA散点图

  Figure 2.  Principal component analysis (PCA) score plot (A), orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) score plot (B), permutation test (C), and OPLS-DA scatter plot (D) of health volunteers and CRC patients

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  4.   结 论

  基于肠道微生物代谢产物，构建一种快速诊断CRC的方法。采用GC法测定粪便中的SCFAs，通过多元统计分析，确定乙酸、丙酸，尤其是丁酸可作为CRC诊断的潜在标志物。本方法简单、灵敏，可用于CRC的快速诊断。

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  Figure 1  Representative gas chromatograms of mixed standards solution (A), health volunteer (B) and colorectal cancer (CRC) patient (C)

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  Figure 2  Principal component analysis (PCA) score plot (A), orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) score plot (B), permutation test (C), and OPLS-DA scatter plot (D) of health volunteers and CRC patients

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  Table 1.  Regression equation, correlation coefficient, linear range, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of the six short-chain fatty acids (SCFAs)

  化合物 Compounds	回归方程 Regression equations	相关系数 Correlation coefficients (R2)	线性范围 Linearity ranges (μg/mL)	检测限 LOD (μg/mL)	定量限 LOQ (μg/mL)
  乙酸Acetic acid, AA	y=0.0050x+0.0084	0.9999	3.632~929.7	0.24	0.73
  丙酸Propionic acid, PA	y=0.0081x+0.0034	0.9999	1.561~399.6	0.26	0.78
  异丁酸Isobutyric acid, IBA	y=0.0111x－0.0012	0.9999	0.325~83.31	0.11	0.32
  丁酸Butyric acid, BA	y=0.0102x－0.0042	0.9999	2.383~610.1	0.20	0.60
  异戊酸Isovaleric acid, IVA	y=0.0129x-0.0024	0.9999	0.534~136.8	0.18	0.53
  戊酸Valeric acid, VA	y=0.0120x－0.0015	0.9999	0.476~121.9	0.16	0.48

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  Table 2.  Intra-and inter-day precisions, repeatability, stability and recovery of the 6 SCFAs

  化合物 Compounds	日内精密度 Intra-day RSD (%, n=6)	日间精密度 Inter-day RSD (%, n=5)	重复性 Repeatability (n=6)			稳定性 Stability (RSD，%)			平均回收率 Recovery (n=6)
  			平均含量 Mean (μg/g)	RSD (%)		短期 Short-term	长期 Long-term		回收率 Recovery (%)	RSD (%)
  AA	1.0	2．1	3293	2.4		3.3	2.2		98.7	4.4
  PA	1.6	2.4	1486	2.2		4.0	3.4		102.0	4.0
  IBA	3.6	4.7	140	2.6		3.9	2.8		106.3	2.6
  BA	0.9	2.2	2609	2.1		2.0	2.8		104.2	3.8
  IVA	0.8	5.7	262	3.1		0.5	6.5		98.0	2.8
  VA	1.3	3.0	240	1.8		1.1	1.2		100.2	4.6

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  Table 3.  Results of SCFAs in feces from health volunteers and colorectal cancer (CRC) patients (μg/g, x±SD, n=3)

  样品 Sample	AA	PA	IBA	BA	IVA	VA
  N1	2186±122	1246±69	290±10	2049±115	572±37	393±26
  N2	4364±69	1818±30	181±9	2472±82	278±4	272±6
  N3	3301±16	1494±17	140±5	2588±11	262±11	238±5
  N4	4512±242	1932±120	323±19	1279±87	660±37	37.8±2.1
  N5	3666±388	1105±113	220±18	2362±260	382±38	468±50
  N6	2679±60	815±28	267±3	1200±34	586±1	280±9
  N7	3598±52	1897±51	41.5±2.1	1718±92	69.2±3.2	94.5±5.8
  N8	2589±281	1264±142	213±26	1425±175	346±36	292±41
  N9	3447±186	1312±83	145±10	1488±76	235±12	198±10
  N10	5133±85	2089±31	111±1	2536±33	145±3	180±3
  N11	3707±14	1272±8	102±1	2483±15	179±2	182±2
  N12	4364±118	2870±100	99.0±3.5	1731±48	163±5	242±9
  N13	4686±53	1457±30	23.0±1.4	2544±33	31.1±0.9	65.5±0.8
  P1	6010±28	4162±33	569±13	2964±75	1044±24	1228±25
  P2	6955±262	2665±150	425±21	3680±170	711±37	448±22
  P3	5714±190	3591±115	58.2±0.9	2477±72	61.4±0.5	187±4
  P4	1567±67	842±35	168±3	536±21	232±8	153±6
  P5	2736±190	1421±90	118±8	919±59	193±13	140±4
  P6	2616±30	1578±14	150±6	436±8	152±2	36.7±1.7
  P7	1977±43	1428±20	212±2	597±11	324±1	60.2±0.9
  P8	1258±28	42.7±3.1	49.0±4.0	192±6	104±2	2.4±0.1
  P9	1778±15	639±8	89.4±0.5	697±6	119±2	129±2
  P10	5730±68	1729±26	570±8	1495±21	971±13	492±5
  P11	2417±101	1230±53	189±7	1080±40	352±15	247±10
  P12	1525±24	685±15	120±3	443±7	166±1	153±2

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