超高效液相色谱-串联质谱法检测微氧生物脱氮菌群酰基高丝氨酸内酯信号分子

引用本文: 李玖龄, 孙凯, 孟佳, 沈吉敏, 齐虹, 江雷. 超高效液相色谱-串联质谱法检测微氧生物脱氮菌群酰基高丝氨酸内酯信号分子[J]. 分析化学, 2016, 44(8): 1165-1170. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.160103 shu

Citation: LI Jiu-Ling, SUN Kai, MENG Jia, SHEN Ji-Min, QI Hong, JIANG Lei. Detection of N-Acyl-homoserine Lactones Signal Molecules of Quorum Sensing Secreted by Denitrification Flora in Microaerobic Nitrogen Removal Processes by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2016, 44(8): 1165-1170. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.160103 shu

超高效液相色谱-串联质谱法检测微氧生物脱氮菌群酰基高丝氨酸内酯信号分子

李玖龄 ^1, ,
孙凯 ^1, ,
孟佳 ^1, ,
沈吉敏 ^1, ,
齐虹 ^1, ,
江雷 ^2,

1.
哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室, 哈尔滨 150090;
2.
中国科学院理化技术研究所, 北京 100101
基金项目:
本文系国家自然科学基金面上项目（No.51478141）资助

摘要: 为揭示处理低碳氮比废水的微氧活性污泥系统的生物脱氮机制，了解脱氮功能菌群的群体生长和代谢规律，建立了超高效液相色谱-串联质谱同时定量检测介导革兰氏阴性（G^-）细菌群体感应信号分子酰基高丝氨酸内酯（AHLs）的方法。取自升流式微氧活性污泥反应器的泥水混合物，使用乙酸乙酯液液萃取，旋转蒸干后以甲醇定容，经C₁₈色谱柱分离。以5 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）和甲醇为流动相进行梯度洗脱，采用多反应离子监测模式，使用配有电喷雾离子源的三重四极杆质谱进行检测。对9种AHLs的检测结果表明，在0.5～100 μg/L范围内呈现良好的线性关系，检出限为0.01～0.5 μg/L，回收率为62.5%～118.1%，相对标准偏差为2.9%～12.1%，分析时间为6.5 min。本方法具有快速、准确和精密等特点，可及时反映活性污泥功能菌群的生长状态和代谢活性，对了解生物脱氮系统的生物学机制和废水生物处理系统的运行调控具有重要意义。

关键词:

English

Detection of N-Acyl-homoserine Lactones Signal Molecules of Quorum Sensing Secreted by Denitrification Flora in Microaerobic Nitrogen Removal Processes by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

1.
State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, Harbin Institute of Technology, Harbin, 150090, China;
2.
Technical Institute of Physics and Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
Received Date: 17 February 2016
Revised Date: 24 May 2016
Fund Project:
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 51478141)

Abstract: Gram-negative (G^-) bacteria, such as denitrifying bacteria and anaerobic ammonia oxidation bacteria, are highly social organisms capable of sophisticated cooperative behavior mediated via quorum sensing. As signal molecules of the chemical communication, N-acyl-homoserine lactones (AHLs) can mediate the quorum sensing of the functional microbial population and regulate the population density. To understand the growth of functional microbial population and the mechanism for biological nitrogen removal in upflow microaerobic sludge reactors (UMSRs) treating organic wastewater with low ratio of chemical oxygen demand to total nitrogen, a method was established to simultaneously detect AHLs in the microaerobic processes. Water-sludge mixtures sampled from the UMSRs were pretreated in sequence by liquid-liquid extraction using ethyl acetate, rotary evaporation, constant volume with methanol, separation by C18 column. Gradient elution was carried out using 5 mmol/L ammonium acetate (containing 0.1% formic acid) and methanol as mobile phases. On the base of multiple reaction monitoring analysis, a triple quadrupole mass spectrometer with an electrospray ionization was introduced to detect the target compounds. Nine kinds of AHLs were used to evaluate the established method and the results showed that the detection limits were 0.01-0.5 μg/L and all of the AHLs presented excellent linearity with the concentration ranging from 0.5 to 100 μg/L. The recovery and relative standard deviation ranged from 62.5% to 118.1% and 2.9% to 12.1%, respectively. The analysis could be finished within 6.5 min. The rapid, accurate and precise method for detecting AHLs provided a new insight into the growth and metabolic activity of functional microbial population in the activated sludge processes to understand the mechanism of biological nitrogen removal, suggesting a good application in regulation and operation of wastewater biological treatment processes.

Key words:

Biological nitrogen removal
/ Signal molecule
/ N-Acyl-homoserine lactones
/ Ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

1. 引言

厌氧氨氧化是新发现的一种废水生物脱氮机制，具有经济高效等特点，得到了广泛关注^[1]。目前所发现的厌氧氨氧化细菌均为革兰氏阴性(G^-)细菌，一般具有荚膜或粘液层，生长缓慢，倍增时间长达10~30 d^{[2, 3]}。本课题组在进行低碳氮比(C/N)养猪废水处理研究中，发明了升流式微氧活性污泥处理装置(UMSR)，其化学需氧量、氨氮和总氮的去除效率分别为0.72, 0.76和0.94 kg/(m³·d)^{[4, 5]}。分析表明，UMSR的脱氮机制比较复杂，同时存在自养反硝化和异养反硝化作用，其中厌氧氨氧化是其重要脱氮机制之一。由于包括反硝化细菌和厌氧氨氧化细菌在内的脱氮菌群增殖缓慢，UMSR的启动和污泥驯化期长达155 d^[4]。在长期驯化中，厌氧氨氧化细菌在系统中得到逐步富集，当菌群数量达到一定程度时会出现快速增殖、系统处理效能迅速提升的现象，说明生物脱氮菌群可能存在群体感应系统^[6]。

许多细菌都能合成并释放具有信号功能的自诱导物质(Auto-inducer，AI)。环境中AI浓度随细菌密度的提高而增加，当达到某临界浓度时，能启动菌体中相关基因的表达，调控细菌的生物行为，如毒素及抗生素等次生代谢产物的生成、荚膜及孢子等特殊细胞结构的形成等^[7]，这种细菌适应环境的调节机制被定义为群体感应(Quorum sensing，QS)^[8]。介导G^-细菌群体感应的信号分子酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones, AHLs)，能够向细菌反馈周围环境中菌体的数量变化并直接调控细菌基因性状的表达^[9]。检测废水生物脱氮系统的AHLs，对解析生物脱氮机制及系统的调控运行均有重要意义。

目前，AHLs的检测方法分为微生物传感菌检测和物理化学检测两类方法。其中，微生物传感菌法采用对信号分子有敏感响应的微生物进行信号分子的检测。如McClean采用青紫色素杆菌(Chromobacterium violaceum)作为生物传感菌构建了突变菌株CV026，通过培养过程中的紫色素积累情况检测被试样品中的AHLs，但对酰基侧链长于10个碳原子的AHLs分子灵敏度极低，同时无法检测所有的3-羟基AHLs^{[10, 11]}。而物理化学检测法中，气相或液相色谱与质谱串联的方法比较常见，但大都存在检测时间长、测量精度低、操作复杂等不足^[12]。目前尚未有关于超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定微氧生物脱氮菌群中信号分子的研究报道^[12-15]。本实验以UMSR系统的泥水混合物为样品，探讨了以UPLC-MS/MS测定G^-菌群AHLs的方法，在提高检测精度和灵敏度基础上，实现对复杂菌群低浓度信号分子的快速检测和定量分析，为生物脱氮系统的脱氮机制研究和调控运行提供依据。

2. 实验部分

2.1. 仪器与试剂

Aquity超高效液相色谱(UPLC)串联质谱联用仪(Xevo TQ MS，Waters公司); RE-52型旋转蒸发仪(上海光学仪器厂); TG16-WS型台式高速离心机(湖南湘仪实验仪器有限公司); HZQ-C型往复式恒温振荡摇床(哈尔滨东联有限公司); Milli-Q超纯水机(Millipore公司); MS104TS电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。乙酸乙酯(色谱纯)、甲醇(色谱纯)和乙酸铵(纯度>99%)购于百灵威公司。C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C14-HSL, 3-oxo-C8-HSL, 3-oxo-C10-HSL, 3-oxo-C12-HSL和3-oxo-C14-HSL等9种AHLs信号分子的标准品均为色谱纯(纯度≥98%，购于Sigma公司)，分别用甲醇配制成200 mg/L的标准液，于-20℃储存。

2.2. 样品前处理

研究样品为泥水混合物，取自本实验室用于处理低C/N比养猪废水的UMSR^{[4, 5]}。将100 mL样品置于30℃摇床中振荡30 min后，12000 r/min离心7 min，收集50 mL上清液。用等量乙酸乙酯对上清液萃取3次^[12]，收集上层有机相，经含有适量无水硫酸钠的过滤柱除水后，旋转蒸干，用甲醇定容至5 mL。取1 mL经0.22μm滤膜过滤后，用于UPLC-MS/MS检测分析。

2.3. 实验方法

2.3.2. 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)；多反应离子监测(MRM)；正离子扫描模式；毛细管电压：3.0 kV；毛细管温度：375℃；锥孔电压：30 V；载气：氮气，流速600 L/h；碰撞气：氩气，流速0.15 mL/min。

2.3.1. 色谱条件

BEH C₁₈色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7μm; Waters公司); 分析时间6.5 min；柱温35℃；流速200μL/min；进样体积10μL；流动相: A为含有0.1%(V/V)甲酸和5 mmol/L乙酸铵的甲醇溶液，B为含有0.1%(V/V)甲酸和5 mmol/L乙酸铵溶液。梯度洗脱条件: 0~1.0 min，50%~60% A；1.0~2.5 min，60%~80% A；2.5~6.0 min，80%~100% A；6.0~6.1 min，100%~50% A；6.1~6.5 min，50% A。

3. 结果与讨论

3.1. 色谱条件的优化

采用BEH C₁₈色谱柱，以甲醇作为有机流动相，可获得较好的分离效果和分辨率。同时，在流动相中适量加入乙酸铵可提高离子化效率，获得更好的峰形，而甲酸的加入进一步提高了检测的灵敏度, 降低了检出限^[16]。经梯度洗脱，9种AHLs信号分子依次出峰时间如表 1所示，其色谱图如图 1所示。

表 1

表 1 9种酰基高丝氨酸内酯信号分子出峰时间

Table 1. Retention time of 9 kinds of n-acyl-homoserine lactones (AHLs)

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化合物 Compounds	分子式 Molecular formula	保留时间 Retention time (min)
碳四高丝氨酸内酯N-Butanoyl-L-homoserine lactone, C4-HSL	C₈H₁₃NO₃	0.80
碳六高丝氨酸内酯N-Hexanoyl-L-homoserine lactone, C6-HSL	C₁₀H₁₇NO₃	1.34
氧代碳八高丝氨酸内酯N-3-oxo-Octanoyl-DL-homoserine lactone, 3-oxo-C8-HSL	C₁₂H₁₉NO₄	1.54
碳八高丝氨酸内酯N-Octanoyl-L-homoserine lactone, C8-HSL	C₁₂H₂₁NO₃	2.75
氧代碳十高丝氨酸内酯N-3-oxo-Decanoyl-DL-homoserine lactone, 3-oxo-C10-HSL	C₁₄H₂₃NO₄	2.95
碳十高丝氨酸内酯N-Decanoyl-L-homoserine lactone, C10-HSL	C₁₄H₂₅NO₃	3.77
氧代碳十二高丝氨酸内酯N-3-oxo-Dodecanoyl-DL-homoserine lactone, 3-oxo-C12-HSL	C₁₆H₂₇NO₄	3.88
氧代碳十四高丝氨酸内酯N-3-oxo-Tetradecanoyl-L-homoserine lactone, 3-oxo-C14-HSL	C₁₈H₃₁NO₄	4.63
碳十四高丝氨酸内酯N-Tetradecanoyl-DL-homoserine lactone, C14-HSL	C₁₈H₃₃NO₃	5.31

图 1

图 1 9种AHLs信号分子标准溶液(A)和实际样品(B)的色谱图

Figure 1. Chromatograms of 9 kinds of AHLs in standard solution (A) and real sample (B)

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3.2. 质谱条件的优化

使用配置了正离子ESI的三重四极杆质谱，在m/z 50~350范围内对各物质进行扫描，确定9种AHLs信号分子的分子离子峰(见图 2)，采用MRM模式优化定量分析条件，调节并获得了最优的锥孔电压、碰撞能量、母离子、子离子等参数，结果见表 2。

表 2

表 2 9种AHLs信号分子的多反应离子监测模式质谱条件

Table 2. MRM parameters of 9 kinds of AHLs standards

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化合物 Compounds	母离子 Parent ion (m/z)	子离子 Daughter ion (m/z)	锥孔电压 Cone voltage (V)	碰撞能量 Collision energy (eV)
C4-HSL	172.0	102.0^*, 71.0	22	10
C6-HSL	200.1	102.0^*, 99.0	20	10
3-oxo-C8-HSL	242.0	102.0^*, 141.0	22	12
C8-HSL	228.0	102.0^*, 127.0	22	12
3-oxo-C10-HSL	270.3	102.0^*, 169.1	22	15
C10-HSL	256.0	102.0^*, 155.0	22	12
3-oxo-C12-HSL	298.0	102.0^*, 197.0	22	12
3-oxo-C14-HSL	326.4	102.0^*, 225.2	22	12
C14-HSL	312.0	102.0^*, 211.0	13	15
定量离子(Quantitative ion)。

图 2

图 2 9种AHLs信号分子的离子质谱图

Figure 2. Mass spectra of 9 kinds of AHLs standards

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3.3. 样品前处理方法的优化

由于AHLs为内酯类有机物，因此采用有机溶剂乙酸乙酯对其进行萃取。取自UMSR的泥水混合物经离心处理，上清液为水样，底层浓缩物与残余上清液的混合物为污泥样品。取等量水样和污泥样品各100 mL，分别按2.2节所述方法进行前处理，用UPLC-MS/MS进行分析检测(图 3)。结果表明，各AHLs信号分子在水样中的浓度普遍高于污泥样品，与文献[17]结果一致。选用水样作为检测物，能够获得较污泥样品更强的检测信号和灵敏度，从而能更为清晰地反映出生物脱氮系统的AHLs分布。因此，在后续研究中均选用泥水混合物的离心上清液作为检测样品。

图 3

图 3 水样和泥样中9种AHLs信号分子的浓度

Figure 3. Concentration of 9 kinds of AHLs signal molecules in water samples and sludge samples

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3.4. 线性关系与检出限

用甲醇配制9种信号分子的混合标准液，设置7个质量浓度梯度，各信号分子的浓度为0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 20.0, 50.0和100.0μg/L。以质量浓度为横坐标，定量离子m/z 102对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线(表 3)。结果表明，在0.5~100μg/L范围内，9种AHLs的浓度与其对应的峰面积均有很好的线性关系和相关系数，检出限为0.01μg/L(除C4-HSL和C14-HSL为0.05μg/L外)，定量限为0.5μg/L (除C6-HSL和C14-HSL为1.0μg/L外)，均优于高效液相色谱-串联质谱法^[18]。

表 3

表 3 9种AHLs信号分子的线性方程、回归系数、检出限和定量限

Table 3. Linear equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of 9 AHLs compounds

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化合物 Compound	线性方程 Linear equation	回归系数 Correlation coefficient (R²)	检出限 LOD (μg/L)	定量限 LOQ (μg/L)
C4-HSL	y＝425.58x+1587.4	0.9999	0.05	0.5
C6-HSL	y＝700.33x－2019.2	0.9998	0.01	1.0
3-oxo-C8-HSL	y＝2253.4x+41330	0.9948	0.01	0.5
C8-HSL	y＝1242.1x+11030	0.9996	0.01	0.5
3-oxo-C10-HSL	y＝2452x+70192	0.9969	0.01	0.5
C10-HSL	y＝958.47x+33589	0.9950	0.01	0.5
3-oxo-C12-HSL	y＝1139.2x+28423	0.9978	0.01	0.5
3-oxo-C14-HSL	y＝2413.4x+26780	0.9990	0.01	0.5
C14-HSL	y＝153.54x+3589	0.9973	0.05	1.0

3.5. 方法的准确度和精密度

向UMSR出水中分别添加5，10和50μg/L的混合标准液，按照2.2节处理，对低、中、高3个加标水平各平行测量3次，根据峰面积计算回收率，结果如表 4。

表 4

表 4 目标物的回收率与相对标准偏差

Table 4. Spiked recoveries and relative standard deviations of 9 AHLs compounds

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化合物 Compounds	加标水平Spiked Level
	5μg/L		10μg/L		50μg/L
	回收率 Recovery (%)	相对标准偏差 RSD (%，n＝3)	回收率 Recovery (%)	相对标准偏差 RSD (%，n＝3)	回收率 Recovery (%)	相对标准偏差 RSD (%，n＝3)
C4-HSL	69.5	12.1	63.2	10.2	64.6	11.5
C6-HSL	85.4	6.6	109.4	7.1	88.7	5.9
3-oxo-C8-HSL	113.9	8.5	104.8	4.7	103.6	5.6
C8-HSL	105.5	4.9	115.6	7.3	102.1	4.3
3-oxo-C10-HSL	62.5	11.3	61.1	10.5	63.5	8.7
C10-HSL	106.6	5.6	109.6	3.4	94.4	2.9
3-oxo-C12-HSL	118.1	10.7	107.2	8.3	109.9	6.7
3-oxo-C14-HSL	70.5	9.7	68.2	10.2	65.2	11.1
C14-HSL	91.3	3.0	114.3	6.3	100.9	3.2

3.6. 实际样品的分析

从两个正在运行的UMSR内采集泥水混合液，利用前述开发的UPLC-MS/MS法对其AHLs信号分子进行检测。其中，样品a和样品b分别取自带有填料的和无填料的UMSR，其它运行参数一致：32℃，水力停留时间(HRT) 8 h，出水回流比45。样品b和样品c的区别是无填料UMSR中的生物量(活性污泥浓度，以总固体含量MLSS计)不同，分别为3.5和4.1 g/L。如图 4所示，样品b中各信号分子浓度普遍大于样品a和样品c。分析认为，在较高的出水回流比条件下，有填料的UMSR中的活性污泥，主要以生物膜的方式固着在填料表面，更新速率较慢^{[19, 20]}。而无填料的UMSR中的活性污泥，以悬浮状态存在，生长旺盛^{[21, 22]}。更强的代谢活性，是无填料UMSR中G^-菌群信号分子浓度显著高于生物膜UMSR的主要原因。而在环境条件相同的条件下，微生物群体数量越多^[7-9]，但由图 4可知，具有较低生物量的样品b的AHLS浓度普遍高于样品C。该结果表明，反应器中的菌群结构及其代谢活性会随着反应器的运行发生变化^[4]。

图 4

图 4 生物膜UMSR(样品a)和悬浮污泥UMSR在生物量分别为3.5 g/L(样品b)和4.1 g/L(样品c)下的AHLs的浓度

Figure 4. Concentration of 9 AHLs in the biofilm upflow microaerobic sludge reactor (UMSR) (sample a), and in the suspended sludge UMSR at biomass of 3.5 g/L (sample b) and 4.1 g/L (sample c), respectively

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4. 结论

建立了超高效液相色谱-串联质谱法，可同时快速准确地检测生物脱氮处理系统活性污泥中G^-菌群的9种AHLs信号分子。分析时间6.5 min，检出限为0.01~0.5μg/L。本方法为及时掌握活性污泥功能菌群的生长状态和代谢活性提供了一种快捷途径，也为其它活性污泥系统G^-菌群AHLs信号分子的检测提供了技术支撑。

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Figure 1 Chromatograms of 9 kinds of AHLs in standard solution (A) and real sample (B)

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Figure 2 Mass spectra of 9 kinds of AHLs standards

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Figure 3 Concentration of 9 kinds of AHLs signal molecules in water samples and sludge samples

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Figure 4 Concentration of 9 AHLs in the biofilm upflow microaerobic sludge reactor (UMSR) (sample a), and in the suspended sludge UMSR at biomass of 3.5 g/L (sample b) and 4.1 g/L (sample c), respectively

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Table 1. Retention time of 9 kinds of n-acyl-homoserine lactones (AHLs)

化合物 Compounds	分子式 Molecular formula	保留时间 Retention time (min)
碳四高丝氨酸内酯N-Butanoyl-L-homoserine lactone, C4-HSL	C₈H₁₃NO₃	0.80
碳六高丝氨酸内酯N-Hexanoyl-L-homoserine lactone, C6-HSL	C₁₀H₁₇NO₃	1.34
氧代碳八高丝氨酸内酯N-3-oxo-Octanoyl-DL-homoserine lactone, 3-oxo-C8-HSL	C₁₂H₁₉NO₄	1.54
碳八高丝氨酸内酯N-Octanoyl-L-homoserine lactone, C8-HSL	C₁₂H₂₁NO₃	2.75
氧代碳十高丝氨酸内酯N-3-oxo-Decanoyl-DL-homoserine lactone, 3-oxo-C10-HSL	C₁₄H₂₃NO₄	2.95
碳十高丝氨酸内酯N-Decanoyl-L-homoserine lactone, C10-HSL	C₁₄H₂₅NO₃	3.77
氧代碳十二高丝氨酸内酯N-3-oxo-Dodecanoyl-DL-homoserine lactone, 3-oxo-C12-HSL	C₁₆H₂₇NO₄	3.88
氧代碳十四高丝氨酸内酯N-3-oxo-Tetradecanoyl-L-homoserine lactone, 3-oxo-C14-HSL	C₁₈H₃₁NO₄	4.63
碳十四高丝氨酸内酯N-Tetradecanoyl-DL-homoserine lactone, C14-HSL	C₁₈H₃₃NO₃	5.31

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Table 2. MRM parameters of 9 kinds of AHLs standards

化合物 Compounds	母离子 Parent ion (m/z)	子离子 Daughter ion (m/z)	锥孔电压 Cone voltage (V)	碰撞能量 Collision energy (eV)
C4-HSL	172.0	102.0^*, 71.0	22	10
C6-HSL	200.1	102.0^*, 99.0	20	10
3-oxo-C8-HSL	242.0	102.0^*, 141.0	22	12
C8-HSL	228.0	102.0^*, 127.0	22	12
3-oxo-C10-HSL	270.3	102.0^*, 169.1	22	15
C10-HSL	256.0	102.0^*, 155.0	22	12
3-oxo-C12-HSL	298.0	102.0^*, 197.0	22	12
3-oxo-C14-HSL	326.4	102.0^*, 225.2	22	12
C14-HSL	312.0	102.0^*, 211.0	13	15
定量离子(Quantitative ion)。

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Table 3. Linear equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of 9 AHLs compounds

化合物 Compound	线性方程 Linear equation	回归系数 Correlation coefficient (R²)	检出限 LOD (μg/L)	定量限 LOQ (μg/L)
C4-HSL	y＝425.58x+1587.4	0.9999	0.05	0.5
C6-HSL	y＝700.33x－2019.2	0.9998	0.01	1.0
3-oxo-C8-HSL	y＝2253.4x+41330	0.9948	0.01	0.5
C8-HSL	y＝1242.1x+11030	0.9996	0.01	0.5
3-oxo-C10-HSL	y＝2452x+70192	0.9969	0.01	0.5
C10-HSL	y＝958.47x+33589	0.9950	0.01	0.5
3-oxo-C12-HSL	y＝1139.2x+28423	0.9978	0.01	0.5
3-oxo-C14-HSL	y＝2413.4x+26780	0.9990	0.01	0.5
C14-HSL	y＝153.54x+3589	0.9973	0.05	1.0

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Table 4. Spiked recoveries and relative standard deviations of 9 AHLs compounds

化合物 Compounds	加标水平Spiked Level
	5μg/L		10μg/L		50μg/L
	回收率 Recovery (%)	相对标准偏差 RSD (%，n＝3)	回收率 Recovery (%)	相对标准偏差 RSD (%，n＝3)	回收率 Recovery (%)	相对标准偏差 RSD (%，n＝3)
C4-HSL	69.5	12.1	63.2	10.2	64.6	11.5
C6-HSL	85.4	6.6	109.4	7.1	88.7	5.9
3-oxo-C8-HSL	113.9	8.5	104.8	4.7	103.6	5.6
C8-HSL	105.5	4.9	115.6	7.3	102.1	4.3
3-oxo-C10-HSL	62.5	11.3	61.1	10.5	63.5	8.7
C10-HSL	106.6	5.6	109.6	3.4	94.4	2.9
3-oxo-C12-HSL	118.1	10.7	107.2	8.3	109.9	6.7
3-oxo-C14-HSL	70.5	9.7	68.2	10.2	65.2	11.1
C14-HSL	91.3	3.0	114.3	6.3	100.9	3.2

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

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沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142