English

• 1.   引言

  真菌毒素是由产毒真菌在适宜的环境条件下产生的有毒代谢产物，已经发现400多种真菌毒素，其中毒性强的真菌毒素主要包括黄曲霉毒素B₁(Aflatoxin B₁，AFB₁)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)等^[1]。一些粮食在生长和贮存过程中，经常被多种真菌毒素污染，百奥明公司2012~2014年的调查研究发现^[2~4]，65%亚洲样本都含有至少一种真菌毒素，其中ZEN, DON及FB的阳性率均超过50%^[5]。多种真菌毒素存在毒性加和或者叠加效应^{[6, 7]}，对健康的危险系数增大，因此，有必要对多种真菌毒素同时进行检测。

  同时检测几种真菌毒素的方法已有报道，样品前处理多采用固液萃取结合固相萃取小柱(或多功能净化柱)^[8~11]的方法，但受样品基质效应影响较大，需结合串联质谱进行测定。与SPE净化相比，免疫亲和柱净化因其特异性高，净化彻底，不仅可结合高效液相色谱(HPLC)进行分析，也可以采用液相色谱-质谱(LC/MS)进行定量分析，因而引起色谱分析者的关注^{[12, 13]}。已报道的多种真菌毒素同时净化的方法中，大多直接使用商品化的多功能免疫亲和柱，如维康公司生产的六合一多功能真菌毒素免疫亲和柱或AOZ免疫亲和柱^[14~16]，而尚未见有关多合一真菌毒素免疫亲和柱制备的研究报道。基于上述问题，本研究开发一种三合一免疫亲和柱，将抗AFB₁、抗ZEN、抗DON 3种抗体同时偶联在rProtein A-琼脂糖凝胶上，样品经三合一免疫亲和柱，实现污染样品中3种毒素同时净化富集，HPLC同时检测，为研制其它多合一真菌毒素免疫亲和柱奠定了基础。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  Cintra 10e紫外-可见分光光度计(澳大利亚GBC科学仪器公司)；LC-20AT液相色谱仪(日本岛津公司)；HP-C₁₈柱(美国赛分科技有限公司)；HS-3垂直混匀器(宁波新芝生物科技有限公司)；ZKY-1001真空泵(上海嘉鹏科技有限公司)；砂芯漏斗(如东砂芯玻璃仪器厂)；934-AH玻璃纤维滤膜(直径11 cm，英国Whatman公司)。

  抗AFB₁单克隆抗体(蛋白含量14mg/mL，纯度28%)、抗ZEN单克隆抗体(蛋白含量28 mg/mL，纯度45%)、抗DON单克隆抗体(蛋白含量13.8 mg/mL，纯度48%)，本研究室制备；AFB₁, ZEN, DON液体标准品(纯度>98%，美国Sigma公司)；rProteinA-琼脂糖凝胶(平均粒径90μm，美国GE公司)；乙腈、甲醇(色谱纯，德国Merck公司)，其余试剂均为分析纯；实验用水均为超纯水；玉米粉、大麦及糙米均为市购；FAPAS质控样本(T04249，动物饲料，The food and environment research agency)。

  2.2.   实验方法

  2.2.3.   亲和柱的评价实验

  (1)非特异性吸附测定准确移取5 mL的AFB₁(4.6μg/L)、ZEN(16.3μg/L)、DON(151μg/L)的3种毒素测试工作液，以2秒1滴速度过Blank柱(即蛋白A-琼脂糖凝胶直接装柱，0.25 mL胶/支)，以20 mL水洗除杂，2.0 mL甲醇洗脱，收集流出液、去杂及洗脱液，按色谱条件分别测定每种毒素含量。按公式(1)分别计算每种毒素的非特异性吸附率(F)。

  1

  其中，m_流出为流出量(ng)，m_去杂为去杂量(ng)，m_总为过柱总量(ng)。

  (2)柱空白测定随机抽取同一批次的亲和柱3根，去除保护液，以10 mL超纯水淋洗2次，2 mL甲醇洗脱，HPLC分别测定洗脱液，考察在标准品出峰时间附近是否有本底干扰。

  (3)柱容量测定指每毫升免疫吸附剂对待测物的最大吸附量(ng/mL)。分别将3种毒素的单标和混标溶液(配制溶剂均为20%甲醇-水)过三合一免疫亲和柱(0.25 mL胶/3 mL柱)，收集流出液、10 mL水去杂和2 mL甲醇洗脱液，HPLC分别测定各毒素的浓度。

  2

  其中，m_实测为实测柱容量(ng)，C_洗脱为洗脱液浓度(ng/mL)，V_洗脱为洗脱液体积(mL)，V_胶为胶体积(0.25 mL)。

  其中，m_理论为理论柱容量(ng)，m_单抗为有效单抗量(ng)，M_毒素和M_单抗分别为毒素和单抗的摩尔质量(g/mol)。抗体有效利用率(P)按下式计算：

  4

  其中，m_实测和m_理论分别为实测柱容量和理论柱容量(ng)。

  2.2.4.   样本净化过程

  准确称取5.0 g样本，加入1.0 g NaCl，再加入25 mL 80%甲醇-水(V/V)，振荡30 min，过滤。取10 mL滤液，加入30 mL PBST(含0.1%吐温-20的PBS溶液)，混匀后取10 mL上样，20 mL水去杂，最后用2 mL甲醇洗脱，过0.22μm有机相滤膜后，HPLC分别测定各毒素浓度。

  2.2.1.   亲和柱的制备

  将3 mL AFB₁单抗、2.5 mL ZEN单抗和18 mL DON单抗预先混匀，加入至处理好的rProtein A-琼脂熔凝胶中，其它反应步骤参考文献[17]。反应结束后装柱，即0.125 mL胶/支(1 mL柱)，0.25 mL胶/支(3 mL柱)，4℃沉降过夜后，将上筛板及上下堵头塞好，2~8℃保存。

  2.2.2.   HPLC测定条件

  色谱柱HP-C₁₈柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，进样量20μL，流速0.8 mL/min。其中AFB₁流动相为45%甲醇-水(V/V)，采用柱后光化学衍生系统，荧光检测器的激发波长360 nm，发射波长440 nm；ZEN流动相为60%乙腈-水(V/V)，荧光检测器的激发波长274 nm，发射波长440 nm；DON流动相为16%乙腈-水(V/V)，紫外检测波长220 nm。上述色谱条件下，分别考察3种毒素的线性范围、检出限及定量限。

  3.   结果与讨论

  3.1.   方法的各项参数

  分别配制3种毒素系列标准溶液进行测试，绘制标准工作曲线，方法的各项参数见表 1。

  表 1

  

  表 1  3种毒素的回归方程、线性相关系数、线性范围及检出限、定量限

  Table 1.  Regression equation, corelation coeffient, linear range LOD and LOQ of 3 mycotoxins

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  名称 Name	回归方程 Regression equation	线性相关系数 Correlation coeffient (R2)	线性范围 Linear range (μg/L)	检出限 LOD (μg/L)	定量限 LOQ (μg/L)
  黄曲霉素B1 AFB1	y=81710x	0.9998	0.14~9.9	0.05	0.165
  玉米赤霉烯酮ZEN	y=536.5x	0.9996	8.0~128	3	10
  脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON	y=50.90x	0.9996	126~2014	30	100
  AFB 1 : Aflatoxin B1; ZEN: Zearalenone; DON: Deoxynivalenol.

  3.2.   亲和柱评价结果

  3.3.   亲和柱应用条件优化

  3.2.3.   柱容量测定

  柱容量测定结果见表 2。无论单标还是混标溶液过柱，流出量与柱容量的总和与过柱总量基本一致(AFB₁总量为400 ng、ZEN总量为1000 ng、DON总量为2500 ng)。数据表明，3种毒素同时存在，每种毒素与对应的单抗结合时，互不干扰。制备的三合一免疫亲和柱的柱容量分别为：AFB₁ 298 ng/0.25 mL胶，ZEN 916 ng/0.25 mL胶，DON 2326 ng/0.25 mL胶。混合单抗偶联前后电泳实验结果见图 2，没有发现单抗的轻链和重链残留，有效单抗偶联率为100%，通过2.2.3节公式(2)~(4)计算，3种毒素单抗的利用率分别为49.3%, 54.2%和40.0%。其中AFB₁单抗的利用率与前期研究一致^[16]，说明相同偶联条件下，该浓度单抗的利用率相同。

  表 2

  

  表 2  单标和混标上样柱容量比较

  Table 2.  Comparison of column capacity between single and mixed standard (n=3)

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  名称 Name	单标过柱柱容量(ng，0.25 mL胶) Column capacities of signal standard (ng, 0.25 mL gel)					流出量 Outflow (ng)	混标过柱柱容量(ng，0.25 mL胶) Column capacities of mixed standard (ng, 0.25 mL gel)					流出量 Outflow (ng)
  	柱1 Column 1	柱2 Column 2	柱3 Column 3	平均值 Average	RSD (%)		柱1 Column 1	柱2 Column 2	柱3 Column 3	平均值 Average	RSD (%)
  AFB1	288	292	297	292	1.5	98	304	292	297	298	2.0	86
  ZEN	901	885	893	893	0.9	312	936	888	924	916	2.7	299
  DON	2496	2360	2218	2358	5.9	608	2220	2460	2299	2326	5.3	597

  图 2

  

  图 2  三合一单抗偶联上清蛋白SDS-PAGE图

  Figure 2.  SDS-PAGE electrophoretogram of coupling supernatant for anti-AFB₁-ZEN-DON McAb

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  3.2.4.   柱效测定结果

  在低于柱容量水平上测定标准品的回收率。分别取不同体积AFB₁/ZEN/DON混标溶液(配制溶剂为20%甲醇-水)，过三合一免疫亲和柱(0.125 mL胶/1 mL柱，3支平行)，其余步骤同柱容量测定。计算不同上样量时亲和柱对每种毒素的平均回收率。

  AFB₁上样量分别为25, 75和125 ng时，平均回收率在94.4%~101.3%之间(RSD≤3.1%)；ZEN上样量分别为71, 213和355 ng时，平均回收率在95.2%~98.1%之间(RSD≤3.4%)；DON上样量分别为170, 510和850 ng时，平均回收率在92.9%~101.2%之间(RSD≤2.5%)；回收率情况较好，同时发现, 此时3种毒素浓度过柱并未流穿，对柱效测定无影响，且过柱量约为柱容量(0.125 mL胶中AFB₁, ZEN和DON的柱容量分别为148, 453和1171 ng)的80%时，回收率令人满意。

  3.2.5.   亲和柱稳定性实验

  将制备的三合一亲和柱于2~8℃保存，每隔一个月测定一次柱容量，考察柱容量的变化。前3个月柱容量几乎没有变化，3个月后开始缓慢降低，保存12个月后，柱容量比初始柱容量下降约15%~20%。

  3.2.1.   非特异性吸附

  指亲和柱被过量上样时，样品中的待测物除可与特异性抗体结合外，还可与琼脂糖基质或杂蛋白发生非特异性吸附作用，通常用非特异性吸附率来表示，因为无法在亲和柱上直接测定待测物的非特异性吸附量，所以考察Blank柱(以蛋白A-琼脂糖凝胶直接装柱)对待测物的吸附作用。结果表明，蛋白A-琼脂糖凝胶载体对AFB₁、ZEN、DON的非特异性吸附率分别为0, 4.9%和8.5%，洗脱量几乎为0，且均小于非特异性吸附量，说明凝胶载体对于小分子有一定截留，其中AFB₁和ZEN非常低，但DON非特异性吸附略高，可能是因为去杂或者洗脱量，低于HPLC检出限50μg/L无法被检测到，从而导致非特异性高。

  3.2.2.   柱空白测定

  由图 1可见，AFB₁亲和柱(目标峰a在7.93 min)和ZEN亲和柱(目标峰a在9.29 min)，柱空白洗脱液(b, c, d)无测定干扰。但是DON亲和柱(目标峰a在14.82 min)，柱空白(b, c, d)显示在目标峰位置有类似物出现，平均峰面积1276，相当于25.07μg/L。对于测定1000μg/kg样本，经国标方法处理后测定浓度在50μg/L，柱空白本底相当于5%的水平。

  图 1

  

  图 1  三合一亲和柱柱空白及3种毒素标准色谱图(a为标准品；b, c, d均为柱空白)

  Figure 1.  Chromatograms of three-in-one affinity column blank and three toxin standards (a. standard; b, c and d are column blank).

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  3.2.6.   不同批次稳定性测试

  随机抽取不同批次生产的三合一亲和柱各5支，测定FAPAS样品(T04249QC，动物饲料)，计算每批平均测定值及相对标准偏差(RSD)。3批次亲和柱测定结果(表 3)表明，总平均值与靶心值的相对偏差4.5%~8.7%，低于一般平行称样相对偏差15%的要求。同时说明了不同批次免疫亲和柱在样品前处理中表现出良好的稳定性。

  表 3

  

  表 3  三合一免疫亲和柱测定FAPAS质控样本(n=5)

  Table 3.  Determination results of food analysis performance assessment scheme (FAPAS) quality control sample (n=5)

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  名称 Name	范围 Range (μg/kg)	靶心值 Target value (μg/kg)	批次1平均值 Average 1 (μg/kg)	批次2平均值 Average 2 (μg/kg)	批次3平均值 Average 3 (μg/kg)	总平均值 Total average (μg/kg)	相对误差 Relative error (%)
  AFB1	6.7~17.2	12	10.2	10.4	11.1	10.6	4.5
  ZEN	82~206	144	154	138	130	141	8.7
  DON	781~1496	1139	1004	1180	1085	1090	8.1

  3.3.3.   稀释缓冲液的选择

  Stroka等^[19]已报道抗体对有机溶剂的敏感性是IAC净化过程的一个重要因素。另有研究报道单抗对甲醇和乙腈的耐受力是不同的^[20]，单抗对相同浓度的甲醇比同浓度的乙腈耐受力要强，因此选择高浓度的甲醇作为提取溶剂；同时，增加稀释倍数是获得良好回收率的关键，分别以水、PBS、PBST将不同样液加标稀释4倍后过柱，比较不同稀释液的加标回收率。结果见表 5(RSD≤6.5%)，采用水稀释时，两种样品中的3种毒素的平均加标回收率大于70%；采用PBS稀释时，略优于水稀释，PBST进行稀释后的测定回收率明显比这两种稀释液高。表面活性剂吐温-20有利于液体的增溶与分散，因此小分子抗原分散的均匀性可能有利于抗体的结合，且消除了分子间的作用力，使得脂溶性及蛋白等杂质分子更易流穿。

  表 5

  

  表 5  不同缓冲液稀释的加标回收率

  Table 5.  Recovery for different diluted buffers (%, n=3)

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  名称 Name	玉米粉 Maize flour				玉米CP粉 Corn gluten meal
  	水稀释 Diluted with water	PBS稀释 Diluted with PBS	PBST稀释 Diluted with PBST		水稀释 Diluted with water	PBS稀释 Diluted with PBS	PBST稀释 Diluted with PBST
  AFB1	76.3	81.3	93.6		77.0	82.0	90.7
  ZEN	81.0	86.0	92.4		61.7	69.0	88.0
  DON	84.0	92.4	93.7		76.0	78.4	95.8

  3.3.2.   洗脱溶剂量的确定

  对每毫升甲醇洗脱液进行3种毒素的监测发现，第1 mL甲醇洗脱液中AFB₁和DON洗脱率达90%，但是ZEN还有近33%尚未洗脱。第2 mL甲醇洗脱液的洗脱量与第1 mL的洗脱量之和近100%，第3 mL甲醇洗脱液的监测结果基本为0。考虑到增加洗脱液体积会引起样品的稀释，降低检测灵敏度，选择2 mL纯甲醇洗脱较为合适。

  3.3.1.   提取溶剂的确定

  3种毒素中AFB₁和ZEN易溶于有机溶剂，而DON易溶于水和有机溶剂，选择高浓度有机溶剂能兼顾3种毒素的溶出情况。表 4结果显示，80%甲醇提取3种毒素回收率均在90%以上；而90%乙腈-水提取的回收率都在117.5%~125.1%之间，这与Stroka等^[18]的报道类似，导致假阳性结果可能是因为乙腈溶液容易吸附到食品上导致失水造成的。

  表 4

  

  表 4  不同提取溶剂的回收率比较

  Table 4.  Comparison of recoveries for different extraction solvents (n=3)

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  名称 Name	AFB1			ZEN			DON
  	回收率 Recovery (%)	RSD (%)		回收率 Recovery (%)	RSD (%)		回收率 Recovery (%)	RSD (%)
  70% Methanol-H2O	87.4	3.1		75.8	5.3		84.2	3.5
  80% Methanol-H2O	94.1	2.6		90.7	3.2		91.4	4.4
  90% Acetonitrile-H2O	122.4	2.4		125.1	2.8		117.5	3.9

  4.   结论

  以rProtein A-琼脂糖凝胶为配基定向偶联抗AFB₁、抗ZEN、抗DON的3种单抗，成功制备了三合一免疫亲和柱。经不同批次三合一亲和柱净化后, FAPAS质控样本的测定结果接近靶心值。针对多种真菌毒素污染的样品，采用多合一亲和柱可实现一次称量、提取和净化，满足多种真菌毒素同时检测的需求。低非特异性吸附是洗脱效率和样本回收率的保证^[20]。利用甲醇洗脱空白柱，本底无杂峰干扰，对ZEN和DON有一定的吸附作用，对DON有非特异性吸附，可能是因为去杂或者洗脱量，低于HPLC检出限而无法被检测到，导致非特异性高。ZEN的非特异性吸附可能与未活化凝胶载体有关，而龚燕等^[17]报道的柱空白略有不同。龚燕等^[17]研究的柱空白凝胶是偶联过程中无单抗存在的情况下，制备得到空白柱，而本研究是直接以未处理的rProtein A-琼脂糖凝胶制备空白柱，可能存在非亲水性基团作用，导致ZEN的非特异性吸附。

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• 

  Figure 1  Chromatograms of three-in-one affinity column blank and three toxin standards (a. standard; b, c and d are column blank).

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  Figure 2  SDS-PAGE electrophoretogram of coupling supernatant for anti-AFB₁-ZEN-DON McAb

  1.偶联后上清液(稀释10倍); 2和3混合单抗偶联前(稀释20倍); 4.偶联后上清液(稀释6倍)。

  1.Supernate after coupling (Diluted 10 times); 2 and 3. MixedMcAb before coupling (Diluted 20 times); 4. Supernate after coupling (Diluted 6 times)

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  Table 1.  Regression equation, corelation coeffient, linear range LOD and LOQ of 3 mycotoxins

  名称 Name	回归方程 Regression equation	线性相关系数 Correlation coeffient (R2)	线性范围 Linear range (μg/L)	检出限 LOD (μg/L)	定量限 LOQ (μg/L)
  黄曲霉素B1 AFB1	y=81710x	0.9998	0.14~9.9	0.05	0.165
  玉米赤霉烯酮ZEN	y=536.5x	0.9996	8.0~128	3	10
  脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON	y=50.90x	0.9996	126~2014	30	100
  AFB 1 : Aflatoxin B1; ZEN: Zearalenone; DON: Deoxynivalenol.

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  Table 2.  Comparison of column capacity between single and mixed standard (n=3)

  名称 Name	单标过柱柱容量(ng，0.25 mL胶) Column capacities of signal standard (ng, 0.25 mL gel)					流出量 Outflow (ng)	混标过柱柱容量(ng，0.25 mL胶) Column capacities of mixed standard (ng, 0.25 mL gel)					流出量 Outflow (ng)
  	柱1 Column 1	柱2 Column 2	柱3 Column 3	平均值 Average	RSD (%)		柱1 Column 1	柱2 Column 2	柱3 Column 3	平均值 Average	RSD (%)
  AFB1	288	292	297	292	1.5	98	304	292	297	298	2.0	86
  ZEN	901	885	893	893	0.9	312	936	888	924	916	2.7	299
  DON	2496	2360	2218	2358	5.9	608	2220	2460	2299	2326	5.3	597

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  Table 3.  Determination results of food analysis performance assessment scheme (FAPAS) quality control sample (n=5)

  名称 Name	范围 Range (μg/kg)	靶心值 Target value (μg/kg)	批次1平均值 Average 1 (μg/kg)	批次2平均值 Average 2 (μg/kg)	批次3平均值 Average 3 (μg/kg)	总平均值 Total average (μg/kg)	相对误差 Relative error (%)
  AFB1	6.7~17.2	12	10.2	10.4	11.1	10.6	4.5
  ZEN	82~206	144	154	138	130	141	8.7
  DON	781~1496	1139	1004	1180	1085	1090	8.1

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  Table 4.  Comparison of recoveries for different extraction solvents (n=3)

  名称 Name	AFB1			ZEN			DON
  	回收率 Recovery (%)	RSD (%)		回收率 Recovery (%)	RSD (%)		回收率 Recovery (%)	RSD (%)
  70% Methanol-H2O	87.4	3.1		75.8	5.3		84.2	3.5
  80% Methanol-H2O	94.1	2.6		90.7	3.2		91.4	4.4
  90% Acetonitrile-H2O	122.4	2.4		125.1	2.8		117.5	3.9

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  Table 5.  Recovery for different diluted buffers (%, n=3)

  名称 Name	玉米粉 Maize flour				玉米CP粉 Corn gluten meal
  	水稀释 Diluted with water	PBS稀释 Diluted with PBS	PBST稀释 Diluted with PBST		水稀释 Diluted with water	PBS稀释 Diluted with PBS	PBST稀释 Diluted with PBST
  AFB1	76.3	81.3	93.6		77.0	82.0	90.7
  ZEN	81.0	86.0	92.4		61.7	69.0	88.0
  DON	84.0	92.4	93.7		76.0	78.4	95.8

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