English

• 谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成的三肽，是人体重要的内源性抗氧化剂^[1]。其分子中含有容易氧化的巯基，能够清除活性氧(reactive oxygen species，ROS)和其他自由基，同时能够与重金属离子和多种化学物质及其代谢产物结合，进而维持免疫系统的正常运作^[2]。人体血液中GSH的浓度过高可能导致阿尔茨海默病、沃纳综合征、帕金森病、癌症和心脏病等^[3-4]，而GSH缺乏则可能导致生长迟缓、脱发、嗜睡、银屑病、肝脏损伤以及肌肉和脂肪减少等症状^[5]。值得注意的是，GSH在肿瘤细胞中的含量比普通细胞高得多(2倍~10倍)，过表达的GSH作为抗氧化剂在光照下清除ROS，从而降低治疗效率，严重影响肿瘤的治疗进程^[6]。如何高选择性地快速检测GSH、监控活细胞中GSH水平的变化以及降低肿瘤细胞中GSH水平，对于解决相关临床问题至关重要^[7]。目前，GSH的检测以分光光度法^[8]、荧光法^[9]、电化学法^[10]、色谱法^[11]为主，分光光度法虽然操作简单、成本低、适合批量检测，但易受其他巯基化合物干扰，特异性差；荧光法灵敏度高、检测限(limit of detection，LOD)低，适合微量样品的检测，但荧光探针易受环境pH、温度的影响，选择性有限；电化学法响应快、可实时检测，依托巯基的氧化还原特性适合活体检测及在线监测，但其电极易污染、稳定性较差，抗干扰能力一般；高效液相色谱法(HPLC)特异性强、准确度高，可同时区分GSH、氧化型谷胱甘肽及硫醇类物质，但设备昂贵、前处理复杂、检测时间长、通量较低。因此，实时、快速、准确地检测GSH含量对于临床诊断、疾病治疗、病原体检测等意义重大。

  纳米级金属有机框架(nanoscale metal-organic framework，nMOF)材料是由金属离子或团簇与有机配体通过配位键有序组装成的多孔结构。该材料的特点在于其框架结构既刚性又可调，能够有效分隔配体和金属中心，同时具有高比表面积、易于功能化、生物相容性良好以及制备方法简便等特点，因此在制作化学传感器方面具有显著优势^[12]。纳米酶是兼具纳米材料独特理化性质与天然酶催化活性的仿生材料，在化学传感领域具有重要应用价值。其突破了天然酶易失活、成本高、制备难的瓶颈，具备高稳定性、可设计性强、催化活性可调、易于功能化修饰等优势，可模拟过氧化物酶、氧化酶、过氧化氢酶等多种酶活性。在化学传感中，纳米酶通过调控形貌、组成与表面修饰，能高效催化显色、荧光、电化学等信号反应，显著提升检测灵敏度与响应速度，实现对目标物的快速识别与定量分析。

  我们以四(4-羧基苯基)卟啉(tetrakis(4-carboxyphenyl)porphyrin，TCPP)为配体，通过改进的表面活性剂辅助方法成功合成了具有良好类过氧化物酶活性的Cu-TCPP-nMOF纳米酶，其可以催化酶底物(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺，TMB)发生颜色反应。此外，该纳米酶可作为GSH响应型比色纳米探针，实现对GSH的高灵敏检测、可视化检测。

  1.   实验部分

  1.1   试剂与仪器

  TCPP、TMB、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)、N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide，DMF)、GSH和过氧化氢(H₂O₂)均购于上海泰坦科技股份有限公司；磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)、三水合硝酸铜(Cu(NO₃)₂·3H₂O)均购于北京伊诺凯科技有限公司。

  实验所用仪器主要包括透射电子显微镜(TEM，日本JEOL JEM-2100F，工作电压为200 kV)、傅里叶变换红外光谱仪(岛津FTIR-8400S，KBr压片，扫描范围为4 000~400 cm^-1)、双光束紫外可见分光光度计(北京普析T9，扫描范围为200~800 nm)、高速离心机(贝克曼，Avanti J-15/15R，最高转速为12 000 r·min^-1)及超纯水制备仪(优普UPT-Ⅱ型，超纯水电阻率为18.25 MΩ·cm)。

  1.2   Cu-TCPP-nMOF的制备

  通过改进的文献^[13]方法制备Cu-TCPP-nMOF纳米探针。将20 mg TCPP和0.5 g PVP溶解在含有16 mL DMF的玻璃小瓶中，然后加入4 mL Cu(NO₃)₂的DMF溶液(25 mg·mL^-1)，持续搅拌2 min。随后将混合液置于超声波清洗仪中超声10 min，再转移至烘箱中80 ℃加热24 h。加热完毕后，在8 000 r·min^-1的转速下离心10 min，收集管壁附着的棕色材料，即得到Cu-TCPP-nMOF，将其分散在DMF中备用。

  1.3   GSH的检测

  将50 μL TMB(16 mmol·L^-1)、10 μL H₂O₂(100 mmol·L^-1)和20 μL 1 mg·mL^-1 Cu-TCPP-nMOF加入到930 μL pH为5.5的磷酸盐缓冲液中，再加入不同体积的GSH(0.1 mmol·L^-1)，观察溶液颜色变化(最终溶液中GSH的浓度梯度为10、15、20、30、45、60、80、100 μmol·L^-1)。用紫外可见分光光度计测定溶液在650 nm处的吸光度。

  1.4   实际样品的测定

  尿液样品来源于年龄范围为25~30岁的3名健康受试者。取上述样品5.0 mL，经0.22 μm注射过滤器过滤后离心10 min，收集清液后使用磷酸盐缓冲液稀释并定容至100 mL。取上述溶液930 μL，依次加入50 μL TMB(16 mmol·L^-1)、10 μL H₂O₂(100 mmol·L^-1)和20 μL Cu-TCPP-nMOF(1 mg·mL^-1)后进行UV-Vis吸收光谱测试。加标回收实验采用标准加入法在尿液样品中加入3种浓度梯度(低、中、高)的目标组分进行回收率测试。用0.1 mmol·L^-1的GSH溶液加标尿液样品，进行UV-Vis吸收光谱测试。

  2.   结果与讨论

  2.1   纳米材料的表征

  通过改进的表面活性剂辅助方法得到了Cu-TCPP-nMOF，合成路线如图 1a所示。引入高分子表面活性剂PVP可以帮助nMOF通过各向异性生长为二维结构，合成过程简单方便。为了研究该纳米材料的结构特征，利用TEM对其结构进行表征，如图 1b所示。从图中可以看出，Cu-TCPP-nMOF具有均匀的类球形结构。从插图中可以看出其平均尺寸约为50 nm，说明nMOF材料成功合成。

  图 1

  

  图 1.  Cu-TCPP-nMOF的(a) 合成路线图和(b) TEM图

  Figure 1.  (a) Synthesis route diagram and (b) TEM image of Cu-TCPP-nMOF

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  通过FTIR对Cu-TCPP-nMOF表面的官能团进行了分析，如图 2a所示。可以看出，TCPP的原始吡咯环内N—H面内弯曲振动的吸收峰位于965 cm^-1，当与Cu²⁺成功结合后，这个吸收峰移动到了999 cm^-1，转变为Cu-TCPP-nMOF的N—Cu伸缩振动吸收峰。同时，Cu-TCPP-nMOF中羧基的C=O和O—H伸缩振动峰与TCPP吸收峰一致，进一步验证了Cu²⁺确实在TCPP的中心位置进行了配位。图 2b为Cu-TCPP-nMOF和TCPP的UV-Vis吸收光谱，其中TCPP具有大环共轭结构，其在416 nm处出现了强烈的吸收，并在可见光范围内有4个能量较低的Q带吸收峰。当与Cu²⁺结合后，Cu-TCPP-nMOF的强吸收峰从416 nm移动到了425 nm，并且Q带吸收峰强度减少，表明Cu²⁺离子在TCPP的卟啉中心发生了配位^[13]。

  图 2

  

  图 2.  TCPP和Cu-TCPP-nMOF的(a) FTIR谱图和(b) UV-Vis吸收光谱图

  Figure 2.  (a) FTIR spectra and (b) UV-Vis absorption spectra of TCPP and Cu-TCPP-nMOF

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  2.2   类酶活性

  由于Cu-TCPP-nMOF的金属节点具有氧化还原催化特性，因此Cu-TCPP-nMOF具有一定的纳米酶活性。进一步对其类过氧化物酶活性进行了研究，如图 3所示，Cu-TCPP-nMOF可以催化TMB+H₂O₂体系发生反应，使溶液颜色变蓝，如插图a所示。这主要是因为该纳米材料能够催化H₂O₂产生·OH，进而氧化TMB，从而产生蓝色的氧化态TMB^[14]。同时溶液在650 nm处出现了较强的UV-Vis吸收峰，属于氧化态TMB。此外，进行了对照实验，如插图b~d所示，体系中并没有生成蓝色的氧化态TMB，进一步证明该纳米材料具有良好的类过氧化物酶活性。

  图 3

  

  图 3.  不同反应体系在930 μL pH为5.5的磷酸盐缓冲液中的UV-Vis吸收光谱

  Figure 3.  UV-Vis absorption spectra of different reaction systems in 930 μL phosphate buffered solution at the pH of 5.5

  Inset: the solution colors of the corresponding systems; (a) 50 μL 16 mmol·L^-1 TMB+20 μL 1 mg·mL^-1 Cu-TCPP-nMOF+10 μL 100 mmol·L^-1 H₂O₂; (b) 50 μL 16 mmol·L^-1 TMB+10 μL 100 mmol·L^-1 H₂O₂; (c) 50 μL 16 mmol·L^-1 TMB; (d) 50 μL 16 mmol·L^-1 TMB+20 μL 1 mg·mL^-1 Cu-TCPP-nMOF.

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  Cu-TCPP-nMOF具有良好的类过氧化物酶活性，在一定条件下可以催化TMB+H₂O₂反应体系，因此我们对该催化体系在不同pH(4.5~8.5)的磷酸盐缓冲液中进行了类过氧化物酶催化活性研究，如图 4所示。在偏酸性条件下，Cu-TCPP-nMOF表现出良好的类过氧化物酶活性，当pH超过6.5后没有类过氧化物酶活性。由此判断，在pH为5.5时体系的颜色最深，在650 nm处具有最大的UV-Vis吸收峰强度，说明该条件下Cu-TCPP-nMOF表现出最佳的类过氧化物酶活性。

  图 4

  

  图 4.  50 μL 16 mmol·L^-1 TMB+20 μL 1 mg·mL^-1 Cu-TCPP-nMOF+10 μL 100 mmol·L^-1 H₂O₂体系在930 μL不同pH的磷酸盐缓冲液中的UV-Vis吸收光谱

  Figure 4.  UV-Vis absorption spectra of 50 μL 16 mmol·L^-1 TMB+20 μL 1 mg·mL^-1 Cu-TCPP-nMOF+10 μL 100 mmol·L^-1 H₂O₂ system in 930 μL phosphate buffered solution under different pH values

  Inset: the pH values from left to right were 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, and 8.5.

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  2.3   比色检测GSH

  由于Cu-TCPP-nMOF具有良好的类过氧化物酶活性，可以催化TMB+H₂O₂体系产生明显的蓝色变化。在该变色体系中逐渐加入不同浓度的GSH后，体系蓝色逐渐变淡，直至消失(图 5a插图)。GSH诱导了Cu-TCPP-nMOF的分解，抑制了Cu-TCPP-nMOF的类酶催化活性，导致蓝色逐渐变淡并最终变为浅黄色。这主要是由于Cu-TCPP-nMOF会被GSH分解成游离的TCPP和Cu^+[15-16]。同时，随着体系中GSH浓度的增加，溶液在650 nm处的吸光度也逐渐降低(图 5a)。GSH浓度与650 nm处的吸光度之间存在线性关系，如图 5b所示。在10~60 μmol·L^-1的线性范围内，拟合得到的直线方程为y=-0.009 3x+0.819 7，相关系数R²为0.993 2。根据LOD计算公式：LOD=3σ/s(σ表示20组空白样品的标准偏差，s代表拟合直线的斜率)，得到GSH的LOD为1.20 μmol·L^-1。因此，Cu-TCPP-nMOF可以作为比色检测GSH的纳米探针，为细胞内GSH含量的快速、简便、即时检测提供了重要参考。

  图 5

  

  图 5.  (a) 不同浓度GSH加入到反应体系后溶液的UV-Vis吸收光谱; (b) GSH浓度与溶液吸光度之间的线性关系

  Figure 5.  (a) UV-Vis absorption spectra of the solutions after adding different concentrations of GSH to the reaction system; (b) Linear relationship between GSH concentration and the absorbance of the solution

  The concentration gradient of GSH in the system from left to right was 10, 15, 20, 30, 45, 60, 80, and 100 μmol·L^-1.

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  抗干扰能力是评价检测方法的一个非常重要的指标。为研究Cu-TCPP-nMOF检测方法在GSH检测体系中的选择性，选取抗坏血酸(AA)、多巴胺(DA)、尿酸(UA)、半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)、K⁺和Na⁺等人体中可能存在干扰的物质进行选择性研究。如图 6a所示，当向该体系中加入250 μL 0.1 mmol·L^-1 GSH后(此时体系中GSH浓度为80 μmol·L^-1)，溶液在650 nm处的UV-Vis吸收峰明显降低；而加入10倍于GSH体积的其他干扰物时，650 nm处的吸收峰基本没变化；从图 6b的柱状图中也可清楚看到，只有加入GSH后吸收峰降低得最明显，强度降低74%，进一步表明该GSH检测方法具有良好的抗干扰能力。

  图 6

  

  图 6.  (a) GSH和不同干扰物质加入到Cu-TCPP-nMOF反应体系后溶液的UV-Vis吸收光谱及(b) 650 nm处对应的吸光度柱状图

  Figure 6.  (a) UV-Vis absorption spectra of the solutions after adding GSH and different interfering substances to the Cu-TCPP-nMOF reaction system and (b) the corresponding absorbance bar chart of the solutions at 650 nm

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  将该纳米探针与其他已报道的GSH纳米探针进行比较，结果如表 1所示^[17-21]。Cu-TCPP-nMOF纳米探针虽然在GSH检测的线性范围以及LOD方面性能低于目前已报道的纳米探针，但相较其他使用贵金属的纳米探针等，该纳米探针成本低廉，且其LOD能够满足患者体内GSH的测定，具有一定的应用潜力。

  表 1

  

  表 1  Cu-TCPP-nMOF纳米探针与已报道的GSH比色检测纳米探针之间的对比

  Table 1.  Comparison of the Cu-TCPP-nMOF nanoprobe with the previous reports of the colorimetric detection nanoprobes of GSH

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  Nanoprobe	Linear range/(μmol·L-1)	LOD/(μmol·L-1)	Ref.
  Cu2-xSe	2-100	1.73	[17]
  Chitosan-loaded PdNPs	1-100	0.46	[18]
  AuNPs@Cu-porphyrin MOF	1-300	0.1	[19]
  Cytidine-gold nanoclusters	0-400	10	[20]
  Al doping Prussian blue	1-20	0.17	[21]
  Cu-TCPP-nMOF	10-60	1.20	This work

  2.4   实际样品检测

  为了验证Cu-TCPP-nMOF纳米探针的比色检测方法在实际应用中的实用性，将其应用于人体尿液样品中GSH的检测，并进行了加标回收率实验，每个样品进行了3次测定，结果如表 2所示。从表中可以看出，在3个尿液样品中均未检测到GSH，主要原因是GSH在健康人体尿液中的含量较低。从加标回收实验结果来看，该方法受到尿液样品中复杂成分的影响较小，加标回收率较满意，相对标准偏差较低。值得一提的是，癌症患者体内的GSH含量明显高于健康受试者(通常高2倍~10倍)^[22]，因此该方法在患者体内GSH的含量检测方面具有一定的潜力。

  表 2

  

  表 2  尿液样品中GSH的测定以及加标回收结果统计

  Table 2.  Determination of GSH in urine samples and the statistical results of the recovery

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  Urine	Detected concentration/ (μmol·L-1)	Added concentration/ (μmol·L-1)	Total detected concentration/(μmol·L-1)	Recovery/%	Relative standard deviation/%
  Sample 1	—	15.0	13.6	90.7	3.4
  		30.0	28.4	94.7	2.8
  		45.0	45.9	102.0	2.2
  Sample 2	—	15.0	15.9	106.0	2.9
  		30.0	31.7	105.7	1.8
  		45.0	47.0	104.4	2.5
  Sample 3	—	15.0	13.8	92.0	3.6
  		30.0	29.1	97.0	2.7
  		45.0	45.6	101.3	2.0

  3.   结论

  通过改进的表面活性剂辅助方法成功合成GSH响应型Cu-TCPP-nMOF纳米探针，并建立了GSH比色检测方法，实现了GSH的快速、灵敏检测。结构表征结果表明，该纳米探针利用PVP辅助剂来促进nMOF各向异性生长为二维结构。红外光谱结果表明，Cu²⁺成功配位于TCPP的卟啉中心。由于Cu-TCPP-nMOF纳米探针优良的类过氧化物酶活性，其能够催化TMB+H₂O₂体系产生明显的蓝色变化，GSH检测的线性范围为10~60 μmol·L^-1，LOD可以达到1.20 μmol·L^-1，尿液样品加标回收结果表明该方法受到尿液样品中复杂成分的影响较小，有望用于癌症患者体内GSH含量的检测，为癌症早期筛查、预后评估及个体化治疗提供简便、高效的工具。另一方面，在肿瘤细胞中，过表达的GSH能够降低基于ROS的治疗效率，严重影响肿瘤的治疗进程。因此，降低肿瘤细胞的GSH水平是攻克肿瘤难题的一个关键方向。Cu-TCPP-nMOF不仅可以通过循环氧化机制消耗肿瘤细胞中的GSH，而且其具有变价金属的类酶活性，能够基于Russell机制的自发重组反应选择性生成单线态氧^[23]。利用这些特性，Cu-TCPP-nMOF可以高效专一性地破坏肿瘤中过表达的GSH，为癌症治疗策略的发展提供有意义的启发和指导。

  
  
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      王超. 纳米材料在克服肿瘤化疗缺陷中的探索与应用[D]. 合肥: 中国科学技术大学, 2019: 4-10.WANG C. Research and application of nanomaterials in overcoming the defects of tumor chemotherapy[D]. Hefei: University of Science and Technology of China, 2019: 4-10

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  图 1  Cu-TCPP-nMOF的(a) 合成路线图和(b) TEM图

  Figure 1  (a) Synthesis route diagram and (b) TEM image of Cu-TCPP-nMOF

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  图 2  TCPP和Cu-TCPP-nMOF的(a) FTIR谱图和(b) UV-Vis吸收光谱图

  Figure 2  (a) FTIR spectra and (b) UV-Vis absorption spectra of TCPP and Cu-TCPP-nMOF

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  图 3  不同反应体系在930 μL pH为5.5的磷酸盐缓冲液中的UV-Vis吸收光谱

  Figure 3  UV-Vis absorption spectra of different reaction systems in 930 μL phosphate buffered solution at the pH of 5.5

  Inset: the solution colors of the corresponding systems; (a) 50 μL 16 mmol·L^-1 TMB+20 μL 1 mg·mL^-1 Cu-TCPP-nMOF+10 μL 100 mmol·L^-1 H₂O₂; (b) 50 μL 16 mmol·L^-1 TMB+10 μL 100 mmol·L^-1 H₂O₂; (c) 50 μL 16 mmol·L^-1 TMB; (d) 50 μL 16 mmol·L^-1 TMB+20 μL 1 mg·mL^-1 Cu-TCPP-nMOF.

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  图 4  50 μL 16 mmol·L^-1 TMB+20 μL 1 mg·mL^-1 Cu-TCPP-nMOF+10 μL 100 mmol·L^-1 H₂O₂体系在930 μL不同pH的磷酸盐缓冲液中的UV-Vis吸收光谱

  Figure 4  UV-Vis absorption spectra of 50 μL 16 mmol·L^-1 TMB+20 μL 1 mg·mL^-1 Cu-TCPP-nMOF+10 μL 100 mmol·L^-1 H₂O₂ system in 930 μL phosphate buffered solution under different pH values

  Inset: the pH values from left to right were 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, and 8.5.

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  图 5  (a) 不同浓度GSH加入到反应体系后溶液的UV-Vis吸收光谱; (b) GSH浓度与溶液吸光度之间的线性关系

  Figure 5  (a) UV-Vis absorption spectra of the solutions after adding different concentrations of GSH to the reaction system; (b) Linear relationship between GSH concentration and the absorbance of the solution

  The concentration gradient of GSH in the system from left to right was 10, 15, 20, 30, 45, 60, 80, and 100 μmol·L^-1.

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  图 6  (a) GSH和不同干扰物质加入到Cu-TCPP-nMOF反应体系后溶液的UV-Vis吸收光谱及(b) 650 nm处对应的吸光度柱状图

  Figure 6  (a) UV-Vis absorption spectra of the solutions after adding GSH and different interfering substances to the Cu-TCPP-nMOF reaction system and (b) the corresponding absorbance bar chart of the solutions at 650 nm

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  表 1  Cu-TCPP-nMOF纳米探针与已报道的GSH比色检测纳米探针之间的对比

  Table 1.  Comparison of the Cu-TCPP-nMOF nanoprobe with the previous reports of the colorimetric detection nanoprobes of GSH

  Nanoprobe	Linear range/(μmol·L-1)	LOD/(μmol·L-1)	Ref.
  Cu2-xSe	2-100	1.73	[17]
  Chitosan-loaded PdNPs	1-100	0.46	[18]
  AuNPs@Cu-porphyrin MOF	1-300	0.1	[19]
  Cytidine-gold nanoclusters	0-400	10	[20]
  Al doping Prussian blue	1-20	0.17	[21]
  Cu-TCPP-nMOF	10-60	1.20	This work

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  表 2  尿液样品中GSH的测定以及加标回收结果统计

  Table 2.  Determination of GSH in urine samples and the statistical results of the recovery

  Urine	Detected concentration/ (μmol·L-1)	Added concentration/ (μmol·L-1)	Total detected concentration/(μmol·L-1)	Recovery/%	Relative standard deviation/%
  Sample 1	—	15.0	13.6	90.7	3.4
  		30.0	28.4	94.7	2.8
  		45.0	45.9	102.0	2.2
  Sample 2	—	15.0	15.9	106.0	2.9
  		30.0	31.7	105.7	1.8
  		45.0	47.0	104.4	2.5
  Sample 3	—	15.0	13.8	92.0	3.6
  		30.0	29.1	97.0	2.7
  		45.0	45.6	101.3	2.0

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