English

• 癌症是全球主要致死性疾病之一，预计到2050年新发病例将达约3 500万例^[1]。传统放疗与化疗虽有效，但常伴随恶心、脱发、贫血及免疫抑制等严重副作用，亟需更高效且耐受性更好的治疗策略。硼中子俘获疗法(BNCT)是一种双靶向放射治疗技术，通过选择性富集含¹⁰B药物至癌细胞内，当¹⁰B捕获热中子后释放细胞尺度(5~9 μm)高能射线，实现精准杀伤癌细胞，但不损伤周围健康组织^[2]。BNCT在脑胶质瘤、头颈癌及黑色素瘤等浅表恶性肿瘤中显示出高精确度、低副作用及低复发率的优势。目前美国食品药品监督管理局(FDA)批准的硼药仅有对硼苯丙氨酸(BPA)和硫代十二硼烷二钠盐(BSH)^[3]，但其仍存在含硼量低、缺乏实时示踪及肿瘤靶向性不足等问题。二十面体碳硼烷(C₂B₁₀H₁₂)作为经典富硼簇，低毒性、生物相容性好，且具有独特电子性质和三维芳香性^[4-5]，是构建高效BNCT硼携带剂的理想选择^[6-10]，随着碳硼烷有机方法学的发展^[11-12]，各类碳硼烷衍生物层出不穷，其富硼特性也在一定程度上降低了硼携带剂使用剂量。

  金纳米簇(AuNCs)因其超小尺寸、低毒性、良好水溶性、可调光学性能及优异的本征荧光特性，已成为新兴的荧光探针材料，在分子成像、荧光化学传感、肿瘤成像以及生物分析等领域展现出广阔的应用前景，特别是硫醇与金构筑的金纳米簇，由于其光稳定性高以及表面易于功能化修饰，在生物医药领域的分子探针开发中显示出独特优势^[13-16]。已有研究表明，金纳米簇可通过被动的高通透性和滞留效应(EPR效应)在肿瘤组织中实现优先积累，同时通过表面修饰特定基团或多肽，可实现对特定肿瘤类型的主动靶向，从而提高成像信号的特异性和敏感性^[14]。然而，EPR效应受体内复杂生理环境影响，靶向效率存在不稳定性，主动靶向策略又受限于受体的组织特异性表达。为了提高纳米簇对癌细胞的靶向性，在纳米簇的构筑中引入葡萄糖基团是一种可行方案。葡萄糖代谢水平的异常变化是肿瘤发生与发展的重要特征，其速率与肿瘤的侵袭性密切相关^[17-19]。瓦尔堡效应(Warburg效应)表明，即使在有氧条件下，癌细胞仍通过有氧糖酵解代谢葡萄糖，这与正常细胞的代谢途径不同^[20-22]。近年来，癌细胞葡萄糖代谢水平升高的特点已被用于成像型探针设计等应用^[23-26]。如临床上，正电子发射断层成像(PET)利用放射性标记的葡萄糖类似物[¹⁸F]-2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖(FDG)实现肿瘤成像，其原理正是基于癌细胞对葡萄糖的高摄取能力^[27]。基于这一特性，将葡萄糖分子偶联于金纳米簇表面，可使纳米探针通过癌细胞过量摄入葡萄糖来实现肿瘤特异性靶向，同时利用葡萄糖代谢过程中引起的荧光变化，实现对肿瘤细胞代谢水平及侵袭性的定量评估，为肿瘤诊断、疗效监测及预后分析提供潜在工具。

  在此背景下，我们选择谷胱甘肽修饰的金纳米簇作为发光基团，通过调整纳米粒子的尺寸，达到大于800 nm的近红外成像，在其表面修饰巯基葡萄糖作为癌细胞靶向基团，同时加入巯基碳硼烷提供硼源，构筑集硼源供给、成像及癌细胞靶向功能于一体的“三位一体”新型BNCT硼携带剂(AuGSCB-Glu)(图 1)，构建一种兼具优良水溶性和乳腺癌靶向性的富硼纳米载体，力求在不依赖化疗或外科切除的情况下实现乳腺癌的有效治疗。此外，共聚焦显微镜监测表明硼载体在葡萄糖高表达的乳腺癌MCF-7细胞内可实现明亮的成像效果，并由ICP-MS量化分析癌细胞内的硼摄取含量，从而进行细胞水平的BNCT效果研究。研究表明，AuGSCB-Glu不仅可作为高效的荧光探针，还在细胞水平上达到了BNCT的要求，为丰富成像型硼携带剂的构建提供了新思路。

  图 1

  

  图 1.  硼簇修饰的金纳米簇用于BNCT的设计方案

  Figure 1.  Design of boron cluster modified gold nanoclusters for BNCT

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  1.   实验部分

  1.1   实验与仪器

  除特别说明外，所有反应均在氩气氛下通过标准Schlenk技术进行。有机溶剂为新鲜蒸馏或购自上海百灵威的超干溶剂，水为微孔净化系统制备的超纯水。化合物的表征数据均在以下仪器下按照正规测试步骤表征：化合物的NMR数据在Bruker DRX-400(298 K，DMSO-d₆，¹¹B NMR外标BF₃·Et₂O，δ=0)测得。IR光谱由Bruker Vector-22记录(固态，298 K)。UV-Vis吸收光谱在Shimadzu UV-2550上测定，荧光光谱由Hitachi F-4600获取(20 μmol·L^-1，298 K)。动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM，200 kV)表征均在298 K下测试。细胞成像由Leica TCS SP8 STED 3X超高分辨率共聚焦显微镜完成。实验中所用细胞购自中科院上海细胞资源中心。

  1.2   金纳米硼携带剂AuGSCB-Glu的制备

  参考已报道文献^[28-30]制备AuGSCB-Glu，步骤如图 2所示。在避光和剧烈搅拌条件下，将150 μL的1 mol·L^-1 HAuCl₄溶液加入到50 mL的2.4 mmol·L^-1谷胱甘肽溶液中。然后将混合物在90 ℃油浴中加热35 min。溶液颜色从透明变为淡黄色，表明形成了AuGS，将所得溶液冷却至室温，并在13 990 r·min^-1下离心20 min，以去除反应后的大聚集体。取上清液，向上清液水溶液中加入乙醇(V_水∶V_乙醇=1∶2，100 mL)，并在2 000 r·min^-1下离心15 s。AuGS从溶液中沉淀出来，而游离的GSH和金离子留在溶液中，去上清液，取沉淀。然后将沉淀物重新悬浮在100 mL水溶液[去离子水或磷酸盐缓冲溶液(PBS)]中，并在4 ℃下储存以供进一步实验(1.5 mmol·L^-1，100 mL)。

  图 2

  

  图 2.  硼簇修饰的金纳米簇的合成步骤流程图

  Figure 2.  Synthetic route to boron cluster-modified gold nanoclusters

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  为了制备葡萄糖碳硼烷基金纳米簇，将20 mL AuGS溶液(1.5 mmol·L^-1)中加入20 mL 1-硫代-β-D-葡萄糖钠盐水溶液(4.5 mmol·L^-1)和10 mL巯基碳硼烷甲醇溶液(4.5 mmol·L^-1)中。搅拌24 h后，过滤取上清液，将溶液加入乙醇(2倍体积的溶液，100 mL)中，然后以20 000 r·min^-1离心45 min。取沉淀，将AuGSCb-Glu的沉淀物重新分散在去离子水(20 mL)中。最后，将AuGSCb-Glu溶液储存在4 ℃下用于以下实验。

  1.3   金纳米硼携带剂AuGSCB-Glu的生物测试

  MCF-7细胞在含有10%特级胎牛血清(FBS，Gibco)和1%抗生素(100 U·mL^-1青霉素和100 μg·mL^-1链霉素，Vicente)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Gibco)中培养，培养条件为37 ℃、CO₂体积分数5%。

  细胞毒性实验：根据生产商提供的方案，采用CCK8增殖试验评估化合物的体外细胞活力。将贴壁的MCF-7细胞接种到96孔板的孔中(每孔1×10³个细胞)，并与不同浓度的化合物培养24 h。然后，用新鲜培养基洗涤细胞，并向每个孔中加入CCK8试剂。在37 ℃下培养2 h后，使用酶标仪在450 nm波长下检测光密度(OD)值。

  细胞摄取实验：将MCF-7细胞培养在6孔板中，次日使其密度达到70%~80%。然后，将细胞分别与含有60 μmol·L^-1 AuGSCB-Glu的培养基培养不同时间。随后，用PBS洗涤细胞3次，通过胰蛋白酶消化收获细胞，用新鲜培养基洗涤后计数。最后，将3×10⁵个细胞重悬于500 μL浓硝酸(超痕量分析级，南京试剂，中国)中用于消化。用ICP-MS测定经不同浓度化合物培养的3×10⁵个细胞中的硼含量，共测定3次。ICP-MS测定过程如下：将消化后的样品用去离子水稀释至4 mL，并转移至聚丙烯管中。然后，通过蠕动泵和喷雾器将样品引入ICP-MS系统(Agilent 7700x，安捷伦科技公司，美国)。以¹¹B作为分析物测定硼含量。使用已知含量的硼标准溶液获得校准曲线。

  荧光成像实验：将约1×10⁶个MCF-7细胞铺板于共聚焦培养皿中。贴壁后，将细胞在细胞培养箱(37 ℃，CO₂体积分数5%)中与60 μmol·L^-1的AuGSCB-Glu培养不同时间(2、4、6、8、10、12、18、24、36和48 h)。去除旧培养基后，用冰冷的PBS仔细清洗细胞3次。使用SP8 STED 3X共聚焦显微镜进行荧光成像(AuGSCB-Glu：λ_ex=405 nm；λ_em=500~700 nm；Scale bar=50 μm)。

  中子测试实验(细胞活性实验)：所有细胞辐照实验均在厦门弘爱医院-纽博龙BNCT中心使用NeuPexTM Block-I AB-BNCT系统进行。将MCF-7细胞以每孔5×10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，并培养24 h。然后，在37 ℃的加湿培养箱中，将细胞暴露于120 μmol·L^-1的AuGSCB-Glu中24 h。去除含AuGSCB-Glu的培养基后，用PBS洗涤细胞，用胰蛋白酶分离细胞，再用PBS洗涤3次。将细胞转移至离心管中，进行吸收剂量为2 Gy的辐照(超热中子通量：8.015×10⁸ n·cm^-2·s^-1)。辐照后，将细胞以每孔200个细胞的密度重新接种于6孔板中用于集落形成实验，并以每孔1×10⁴个细胞的密度重新接种于96孔板中用于CCK8实验。细胞培养24、48和72 h，并在每个时间点根据制造商的说明通过CCK8实验测量细胞活力。

  中子测试实验(细胞克隆实验)：将照射完中子后的6孔板中的细胞在CO₂体积分数5%、37 ℃的条件下培养15 d。随后用甲醇固定，并用结晶紫(0.04%的水溶液)染色。对集落进行拍照并记录。

  2.   结果与讨论

  2.1   金纳米簇AuGSCB-Glu的表征

  首先，对AuGSCb-Glu进行核磁表征。如图 3所示，¹¹B NMR结果表明，AuGSCb-Glu的谱图中含有碳硼烷的特征峰，表明金纳米簇中成功修饰上碳硼烷基团(图 3a)。此外通过氢谱中各基团的特征峰分析，可观察到纳米颗粒中谷胱甘肽、巯基碳硼烷和巯基葡萄糖的特征峰，其中高纯度的碳硼烷含量也更有利于接下来对BNCT相关工作的研究(图 3b)。其次，通过测试AuGSCb-Glu的尺寸，使用DLS和TEM来验证纳米颗粒的形成。已报道的谷胱甘肽修饰的金纳米簇(AuGS)尺寸一般小于2.5 nm，小尺寸保证了金纳米簇具有更好的近红外成像效果。但测试结果表明，金纳米簇AuGSCb-Glu的平均直径为5~6 nm(图 3c和3d)，所以较大的尺寸可能会影响金纳米簇的荧光性质^[28]。

  图 3

  

  图 3.  金纳米簇AuGSCB-Glu的(a) ¹¹B NMR谱图、(b) ¹H NMR谱图; (c) 粒径分布(DLS, 溶剂: DMSO/H₂O, 体积比1∶99)和(d) TEM图(溶剂: DMSO/H₂O, 体积比1∶99)

  Figure 3.  (a) ¹¹B NMR spectrum, (b) ¹H NMR spectrum, (c) particle size distribution (DLS, DMSO/H₂O, volume ratio 1∶99), and (d) TEM image (DMSO/H₂O, volume ratio 1∶99) of AuGSCB-Glu

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  接下来，对金纳米簇AuGSCB-Glu进行进一步表征，以检查上述分子的设计。从红外光谱图中可以看出，巯基峰消失，含碳硼烷的化合物在2 537 cm^-1左右出现B—H的振动峰，在3 426和3 297 cm^-1左右出现谷胱甘肽中的氨基和葡萄糖中羟基的振动峰。之后，对合成的AuGS、AuGSCB-Glu进行光物理性质表征。从其水溶液的紫外可见吸收光谱图(图 4b)中可以看出，金纳米簇AuGS和AuGSCB-Glu的吸收带比较相似，也与文献报道相似^[29]。而金纳米簇AuGS和AuGSCB-Glu的光致发光(PL)光谱显示(图 4c和4d)，在405 nm波长激发下，金纳米簇AuGS的光物理性质与文献报道的相似，在600和800 nm处存在强发射峰，但进一步修饰葡萄糖和碳硼烷(AuGSCB-Glu)后，800 nm处的近红外发射消失，最强发射峰发生了一定的蓝移，仅在558 nm处存在发射。这可能与金纳米簇的尺寸变化有关，随着尺寸的变大，光物理性质产生了相应的变化，该变化趋势也与已报道文献相似^[28]。光物理性质表明，本研究设计合成的金纳米簇AuGSCB-Glu也具有成像示踪的功能，为之后的细胞成像实验奠定基础。

  图 4

  

  图 4.  (a) 金纳米簇AuGSCB-Glu的红外光谱; 金纳米簇AuGS和AuGSCB-Glu的(b) UV-Vis吸收光谱和(c、d) 荧光光谱(λ_ex=405 nm, 20 μmol·L^-1, PBS, 298 K)

  Figure 4.  (a) IR spectrum of gold nanoclusters AuGSCB-Glu; (b) UV-Vis absorption spectra and (c, d) fluorescence spectra of gold nanoclusters AuGS and AuGSCB-Glu (λ_ex=405 nm, 20 μmol·L^-1, PBS, 298 K)

  Inset: images of the gold nanoclusters

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  2.2   金纳米硼携带剂的生物活性

  由于BNCT对硼携带剂的细胞毒性要求较低，因此通过CCK8测定AuGSCB-Glu对乳腺癌细胞(MCF-7)的细胞毒性。如图 5所示，在24 h收集的毒性数据显示，即使硼携带剂浓度高达120 μmol·L^-1时，对MCF-7细胞仍然表现出可忽略的细胞毒性作用。这些结果表明，碳硼烷部分不仅提供了高硼含量，而且不会增加细胞毒性。因此，金纳米簇AuGSCB-Glu可用于进一步的生物成像应用。随后，通过超分辨激光共聚焦对MCF-7细胞中AuGSCB-Glu的摄取进行初步检查(图 6)，来监测细胞在不同时间段的细胞摄取。将细胞分别与含有AuGSCB-Glu(60 μmol·L^-1)的培养基培养48 h，使用显微镜拍摄样品。显微镜图像显示AuGSCB-Glu可以转运到癌症细胞的细胞质中，并在收集的10个时间点(2、4、6、8、10、12、18、24、36、48 h)的成像结果显示，在细胞内仍然具有明亮的荧光成像结果。其次，通过ICP-MS进一步评估了MCF-7细胞对AuGSCB-Glu的硼含量摄取(表 1)。AuGSCB-Glu的硼含量(在10⁶个细胞中)在24 h时达到(500±16) ng。从结果来看，纳米型化合物可以更快、更有效地进入癌细胞，这可能归因于纳米团簇中含有谷胱甘肽和葡萄糖这两类癌细胞靶向基团，另外，碳硼烷也具有很好的穿透细胞膜的能力。

  图 5

  

  图 5.  金纳米簇AuGSCB-Glu在乳腺癌MCF-7细胞中24 h时的细胞毒性测试结果

  Figure 5.  Cytotoxicity test results of gold nanoclusters AuGSCB-Glu on breast cancer MCF-7 cells after 24 h

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  图 6

  

  图 6.  金纳米簇AuGSCB-Glu(60 μmol·L^-1)与MCF-7细胞共同培养48 h期间拍摄的共聚焦显微镜图像

  Figure 6.  Confocal microscopy images during the 48-hour incubation of gold nanoclusters AuGSCB-Glu (60 μmol·L^-1) with MCF-7 cells

  AuGSCB-Glu: λ_ex=405 nm, λ_em=500-700 nm; Scale bar=50 μm.

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  表 1

  

  表 1  MCF-7细胞与金纳米簇AuGSCB-Glu(60 μmol·L^-1)培养后在不同时间点时, 在10⁶个细胞内的硼含量摄取

  Table 1.  Intracellular boron uptake in 10⁶ MCF-7 cells after incubation with gold nanoclusters AuGSCB-Glu (60 μmol·L^-1) at different time points

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  Time / h	Boron content / ng
  6	368±18
  12	412±20
  18	469±16
  24	500±16
  36	482±20
  48	452±16

  2.3   金纳米硼携带剂中子照射效果

  细胞和活体实验为中子照射实验打下了基础。我们对设计合成的金纳米簇复合物进行细胞水平的中子照射实验，研究其在细胞水平的中子照射效果。将样品分为3组，每组采集9个样品。分组情况分别是无任何操作组(空白)、仅中子照射组、加入120 μmol·L^-1化合物并进行中子照射组。将需要中子照射的18个样品放置在中子照射盘里，样品分布情况如图 7a所示。在吸收剂量为2 Gy的中子辐射下，照射后的细胞再培养72 h的细胞活性结果表明，与空白对照和仅照射中子的对照组相比，共培养120 μmol·L^-1化合物24、48、72 h后照射中子的实验组，细胞活性均明显降低，表明中子照射对癌细胞有显著杀伤效果(图 7b)。其次，通过细胞克隆实验研究中子照射对癌细胞的繁殖能力的影响，选择第3组加入化合物及中子照射的癌细胞，培养在6孔板中，在培养15 d后观察细胞克隆情况。结果表明癌细胞克隆数随着硼携带剂的加入而显著降低(图 7c)。细胞实验结果表明中子照射可抑制癌细胞的活性和繁殖力。

  图 7

  

  图 7.  (a) 化合物在中子照射盘上的分布示意图; (b) 化合物在2 Gy剂量中子辐射后统计的72 h内的关键时间点细胞活性数据; (c) 照射中子组15 d后的细胞克隆数据

  Figure 7.  (a) Schematic diagram of the distribution of the compound on the neutron irradiation disk; (b) Cell viability data at key time points within 72 h after neutron irradiation at a dose of 2 Gy; (c) Cell colony data after 15 d of irradiation in the neutron group

  In panel c, Control 1: no treatment group; Control 2: neutron irradiation only group; AuCSCB-Glu group: after co-incubation of cells with 120 μmol·L^-1 compound, the cells were exposed to 2 Gy neutron irradiation and subsequently cultured for 15 d to allow colony formation.

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  3.   结论

  本研究设计合成了新型的硼簇基金纳米颗粒，硼簇基的引入使金纳米颗粒在具有示踪功能及对癌细胞的靶向性的基础上，具有了应用于硼中子俘获疗法的潜能。在硼携带剂的构筑中，硼簇提供硼源作为药效团，谷胱甘肽修饰的金纳米簇作为成像基团，葡萄糖作为靶向基团，使该类分子集示踪，靶向和药效于一体，构筑了“三位一体”的新型硼携带剂。生物测试结果也表明了该类硼携带剂具有低毒性和出色的细胞成像功能，并在细胞水平的硼含量摄取达到了BNCT的标准，后期的中子照射实验也证明该类硼携带剂具有明显的抑制细胞活性及繁殖的能力。该类硼携带剂在一定程度上改善了已获批硼药无法实时追踪成像的缺陷，达到通过可视化成像来监测药物靶向输运效果及解决到达靶点的量化问题，具有重要的研究价值和意义。

  
  
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  图 1  硼簇修饰的金纳米簇用于BNCT的设计方案

  Figure 1  Design of boron cluster modified gold nanoclusters for BNCT

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  图 2  硼簇修饰的金纳米簇的合成步骤流程图

  Figure 2  Synthetic route to boron cluster-modified gold nanoclusters

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  图 3  金纳米簇AuGSCB-Glu的(a) ¹¹B NMR谱图、(b) ¹H NMR谱图; (c) 粒径分布(DLS, 溶剂: DMSO/H₂O, 体积比1∶99)和(d) TEM图(溶剂: DMSO/H₂O, 体积比1∶99)

  Figure 3  (a) ¹¹B NMR spectrum, (b) ¹H NMR spectrum, (c) particle size distribution (DLS, DMSO/H₂O, volume ratio 1∶99), and (d) TEM image (DMSO/H₂O, volume ratio 1∶99) of AuGSCB-Glu

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  图 4  (a) 金纳米簇AuGSCB-Glu的红外光谱; 金纳米簇AuGS和AuGSCB-Glu的(b) UV-Vis吸收光谱和(c、d) 荧光光谱(λ_ex=405 nm, 20 μmol·L^-1, PBS, 298 K)

  Figure 4  (a) IR spectrum of gold nanoclusters AuGSCB-Glu; (b) UV-Vis absorption spectra and (c, d) fluorescence spectra of gold nanoclusters AuGS and AuGSCB-Glu (λ_ex=405 nm, 20 μmol·L^-1, PBS, 298 K)

  Inset: images of the gold nanoclusters

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  图 5  金纳米簇AuGSCB-Glu在乳腺癌MCF-7细胞中24 h时的细胞毒性测试结果

  Figure 5  Cytotoxicity test results of gold nanoclusters AuGSCB-Glu on breast cancer MCF-7 cells after 24 h

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  图 6  金纳米簇AuGSCB-Glu(60 μmol·L^-1)与MCF-7细胞共同培养48 h期间拍摄的共聚焦显微镜图像

  Figure 6  Confocal microscopy images during the 48-hour incubation of gold nanoclusters AuGSCB-Glu (60 μmol·L^-1) with MCF-7 cells

  AuGSCB-Glu: λ_ex=405 nm, λ_em=500-700 nm; Scale bar=50 μm.

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  图 7  (a) 化合物在中子照射盘上的分布示意图; (b) 化合物在2 Gy剂量中子辐射后统计的72 h内的关键时间点细胞活性数据; (c) 照射中子组15 d后的细胞克隆数据

  Figure 7  (a) Schematic diagram of the distribution of the compound on the neutron irradiation disk; (b) Cell viability data at key time points within 72 h after neutron irradiation at a dose of 2 Gy; (c) Cell colony data after 15 d of irradiation in the neutron group

  In panel c, Control 1: no treatment group; Control 2: neutron irradiation only group; AuCSCB-Glu group: after co-incubation of cells with 120 μmol·L^-1 compound, the cells were exposed to 2 Gy neutron irradiation and subsequently cultured for 15 d to allow colony formation.

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  表 1  MCF-7细胞与金纳米簇AuGSCB-Glu(60 μmol·L^-1)培养后在不同时间点时, 在10⁶个细胞内的硼含量摄取

  Table 1.  Intracellular boron uptake in 10⁶ MCF-7 cells after incubation with gold nanoclusters AuGSCB-Glu (60 μmol·L^-1) at different time points

  Time / h	Boron content / ng
  6	368±18
  12	412±20
  18	469±16
  24	500±16
  36	482±20
  48	452±16

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