骨关节炎(OA)是一种慢性退行性疾病[1]，其治疗目的在于缓解疼痛及炎症，在疾病的各个阶段给予合适的治疗方案[2]。研究表明，OA的主要特征是软骨损伤，这主要是由不利的OA微环境引起的[3]。OA微环境主要包括过量的炎症介质[4-5]、过表达的基质金属蛋白酶(MMPs)[6]和过量产生的活性氧(ROS)[7-8]。Wu等设计了多功能金属多酚纳米粒子，通过线粒体靶向清除多余的ROS、调节细胞外基质代谢稳态和抑制炎症来治疗椎间盘退变[9]。由此可以推断，降低OA微环境中的ROS和炎症介质水平，重塑关节微环境，可能是OA的一种潜在治疗策略。
近年来，“精准医疗”概念的兴起使得纳米药物被开发出来，用于向炎症组织输送诊断和/或治疗药物，以有效提高诊断或治疗效果，减少副作用[10-11]。目前，纳米合成药物在提高药物靶向性、延长作用持续时间、实现精准治疗等方面取得了令人满意的效果[12]。研究表明，纳米合成药物或设计在OA治疗中具有独特的优势，Zhang等报道普鲁士蓝纳米药物通过减少ROS和炎症因子的释放来重塑OA微环境(TNF-α、IL-6、iNOS)，增加中间结构蛋白的表达(COL 2和Aggrescan)，从而减少软骨降解和软骨细胞凋亡，最终延缓OA的发展[13]。得益于纳米药物的非侵入性和安全策略，用于OA治疗的新纳米材料开发每年都在增加。考虑到OA患者体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)等抗氧化酶的失活，使用具有生物催化特性的人工纳米酶进行治疗是一个新兴的研究领域。目前，已有研究报道多种具备ROS清除能力的无机纳米材料，包括纳米氧化铈(CeO2)、二氧化锰(MnO2)以及铂(Pt)纳米颗粒等。其中，CeO2纳米粒子凭借其可逆的Ce/Ce氧化还原循环特性及丰富的表面氧空位催化清除ROS，从而表现出显著的抗氧化与抗炎活性。基于这些特性，CeO2纳米粒子在骨关节炎、视网膜病变等炎症相关疾病的治疗中显示出潜在的应用价值[14]。
槲皮素(quercetin)是一种天然且广泛存在于蔬菜和水果中的类黄酮，其名称来源于栎属，具有优异的抗氧化和抗炎特性[15]。研究表明，IL-1β与组织损伤有关，是OA病理学最重要的炎症因子之一[16]。而槲皮素不仅能显著抑制炎症软骨细胞产生NO和MMP，并能有效增加SOD的含量从而降低氧化应激反应。同时，槲皮素还能通过增加TGF-β和胰岛素样生长因子的表达促进糖胺聚糖的合成，进而达到抗炎和促软骨修复的目的[17]。可以说，槲皮素已被证明是一种强有力的蛋白质非酶糖基化抑制剂，这在治疗OA及其并发症方面具有极大的意义[18]。然而，槲皮素较低的水溶性限制了其在OA诊疗研究中的应用[19]。研究表明，由金属离子和有机配体连接产生的纳米探针会显示出丰富的结构和酶模拟生物催化活性。值得注意的是，这些纳米探针还能提供灵活的组成可调性、生物降解性和重要的疾病治疗的重要改进性[20]。由此可知，纳米探针的构建有望解决与槲皮素相关的一系列问题，如不溶于水、难以被人体吸收、半衰期短、需要重复和长期给药以及稳定性差等。
分子成像技术是借助高特异性与高亲和力的分子探针，实现对特定靶点的精准结合，进而利用成像手段进行可视化检测[21-22]。在各类成像模式中，磁共振成像(MRI)凭借其无创、无辐射、高空间分辨率及优越的软组织对比度等优势，已广泛应用于临床诊断。然而，其在分子水平的成像灵敏度相对有限，这在一定程度上制约了其在肿瘤分子影像中的应用[23]。近年来，光学分子成像因具有灵敏度高、可实时成像等特点，成为分子影像学中重要的技术手段之一[24]。鉴于MRI与光学成像在性能上具有显著的互补性，融合二者的荧光-MRI双模态成像技术已成为分子成像领域的研究热点[25]。
本研究以疏水性槲皮素和光敏剂卟啉为有机连接物，以钆(Gd)离子为金属结点，以聚乙二醇(PEG)为表面活性剂，通过一步法制备出水溶性超小槲皮素-钆/铈(CPQGd)纳米探针。得益于其表面的负电荷，CPQGd纳米探针可精准靶向退变的软骨细胞，并借助T1 MRI/荧光多模态成像技术准确判定细胞位置。同时，CPQGd通过模拟3种重要抗氧化酶(SOD、CAT和POD)的活性，表现出优异的ROS清除能力。因此，本研究构建的新型纳米探针CPQGd有望通生化改变对早期退变的软骨细胞进行诊断，从而实现软骨病损的亚临床诊断、治疗并监测软骨状态。
槲皮素、内消旋-四(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)、苯甲酸(BEN)、六水合硝酸铈(Ce(NO)3·6H2O)、六水合硝酸钆(Gd(NO3)3·6H2O)、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)、2，2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、过硫酸钾购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。聚乙二醇(PEG，MW=2 000)购自西格玛奥德里齐生化科技有限公司。N，N-二甲基甲酰胺(DMF)购自上海麦克林生化科技有限公司。30%过氧化氢、无水乙醇购自上海国药集团化学试剂有限公司。磷酸盐缓冲溶液(PBS)购自徐州康美生物技术有限公司。ATDC5专用培养基购自武汉普诺赛科技有限公司。DMEM高糖培养基购自南京凯基生物科技发展有限公司。胎牛血清购自美国Gibco公司，小鼠成软骨细胞、小鼠单核巨噬细胞购自中国科学院细胞库。细胞毒性与增殖检测试剂盒、活性氧检测试剂盒(DCFH-DA)、胰酶细胞消化液(0.25%胰酶)购自上海碧云天生物技术有限公司。4%多聚甲醛购自徐州微科曼得生物工程有限公司。抗荧光衰减封片剂[含4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)]购自大连美伦生物技术有限公司。SOD检测试剂盒、CAT检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。白介素1β(IL-1β)购自medchemexpress公司。
主要仪器有Tecnai G2 F20透射电子显微镜(TEM，美国FEI公司)、FA2204B电子天平(中国上海精密科学仪器有限公司)、KS-180EI医用超声波清洗机(宁波海曙科生超声设备有限公司)、Nano ZS90 Zeta电位仪(英国马尔文仪器有限公司)、UH4150紫外/可见光分光光度计(中国天美科学仪器公司)、Thermo红外光谱仪(苏州赛默飞世尔科技公司)、SpectraMax i3x多功能酶标仪(上海美谷分子仪器公司)、GE 750w 3.0T全身磁共振成像设备(美国GE公司)、LeicaDMl3000B倒置生物显微镜(德国Leica公司)、Incubator 311二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)。
将25 mg TCPP、96 mg Ce(NO)3·6H2O、99.82 mg Gd(NO3)3·6H2O、683 mg BEN、1 246 mg PEG和47.8 mg槲皮素依次溶解到25 mL DMF中，并在95 ℃下避光搅拌8 h。待反应完全后，将溶液冷却至室温，透析后得到水溶性CPQGd纳米探针。
将25 mg TCPP、96 mg Ce(NO)3·6H2O、99.82 mg Gd(NO3)3·6H2O、683 mg BEN和47.8 mg槲皮素依次溶解到25mL DMF中，并在95℃下避光搅拌8 h。待反应完全后，将溶液冷却至室温，透析后得到不含PEG的CQGd纳米探针。
将25 mg TCPP、99.82 mg Gd(NO3)3·6H2O、683 mg BEN、1246 mg PEG和47.8 mg槲皮素依次溶解到25 mL DMF中，并在95℃下避光搅拌8 h。待反应完全后，将溶液冷却至室温，透析后得到不含槲皮素的水溶性PQGd纳米探针。
研究表明，Ce3+/Ce4+的氧化还原行性具有潜在的类酶抗氧化活性[26]。因此，本实验将Ce3+作为纳米探针组成的一部分，旨在为后续的系统性功能验证工作打下基础(本文未涉及)。
取5 μL质量浓度为1 mg·mL-1的CPQGd纳米水溶液滴加至覆有超薄碳膜的铜网表面，并在室温干燥12 h。最后，用透射电子显微镜(电压为200 kV)进行形貌观察并拍摄照片。
首先，将CPQGd纳米水溶液进行冷冻干燥。接着，分别将少量的CPQGd粉末、TCPP和槲皮素粉末置于仪器上，在600~4 000 cm-1进行扫描，并记录。
用ICP‑MS检测Gd3+的含量后，分别配制不同Gd3+浓度(0、1.76、3.52、5.28、7.05、8.81、10.57、12.33、14.09、15.85、17.62 mmol·L-1)的CPQGd水溶液，进行T1加权成像(T1 WI)扫描。扫描参数：重复时间425 ms，回波时间MinFull，反转时间200~800 ms，矩阵384×224，视野18 cm×18 cm，层厚3.0 mm，层距1.5mm。原始图像经过GEAw4.6工作站处理，得到不同样品的T1。
将不同质量浓度的CPQGd水溶液(0、2.34、4.69、9.38、18.75、37.5、75.0、150 mg·L-1)放入荧光成像仪中进行成像拍摄，得到不同浓度的CPQGd的荧光成像图。之后，以波长为425 nm的激发光，检测不同溶液在400~900 nm之间的荧光光谱。
配制质量浓度梯度为0、400、600、800、1 000 mg·L-1的CPQGd溶液，用SOD检测试剂盒测定CPQGd的类SOD活性。首先，将测试液与CPQGd溶液混合均匀。混合液在37 ℃下反应30 min后，于450 nm处测得吸光度，并依据公式计算对超氧阴离子自由基(O2-·)的抑制率(Rin)：Rin=(Acontrol-Asample)/Acontrol×100%，其中A为吸光度，sample表示实验组，control表示对照组。
配制质量浓度梯度为0、100、300、400、500 mg·L-1的CPQGd溶液，并用CAT试剂盒检测CPQGd对过氧化氢的清除能力。首先，将纳米溶液与测试液混合均匀。混合液在37 ℃下反应，产生大量肉眼可见的气泡后终止反应。最后，用酶标仪测定混合液在405 nm处的吸光度，并根据公式计算CAT活性(UCAT，U·mL-1)：UCAT=235.65(Acontrol-Asample)/(60V)，其中，V表示体积(0.1 mL)。
配制浓度梯度为0、100、200、300、400、500、600、700、800 mg·L-1的CPQGd溶液，并将CPQGd、30% H2O2、10 mg·mL-1 TMB、pH=6.0的PBS按1∶3∶ 1∶20的体积比配制反应液。待反应5 min后，用酶标仪测量650 nm处溶液的吸光度。
ABTS能与K2S2O8反应生成稳定的自由基。该自由基能在734 nm处显示最大吸收紫外吸收，并呈蓝绿色。当自由基被清除后，溶液颜色变浅，从而使734 nm处吸光度降低。因此，配制质量浓度梯度为0、10、20、30、40、50 mg·L-1的CPQGd溶液，并将CPQGd、ABTS-过硫酸钾溶液按1∶9的体积比配制反应液。待避光反应10 min后，用酶标仪测量反应液在519 nm处的吸光度，并依据公式计算自由基清除率：DROS=(Acontrol-Asample)/Asample×100%。
细胞实验均在无菌细胞室进行操作。小鼠成软骨(ATDC-5)细胞用ATDC-5专用培养基，小鼠巨噬细胞(RAW 264.7)用含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM培养基培养，并在37 ℃、CO2体积分数5%的培养箱中培养。接着，用CCK8测定纳米探针的细胞毒性。将ATDC-5细胞和RAW 264.7细胞与不同质量浓度(0、50、100、150、250、400 mg·L-1)的CPQGd纳米探针共同培养24 h后，用PBS清洗细胞。接着，向每孔加入100 μL 10% CCK8工作液，并避光培养15 min。待反应完成后，用酶标仪检测各孔在450 nm处的光密度(OD)，并根据公式计算各组的细胞存活率：RCV=(ODtest-ODblank)/(ODcontrol-ODblank)×100%。
将ATDC-5细胞(每孔1×105个)接种于6孔板，并在37 ℃、CO2体积分数5%的培养箱中培养24 h。接着，向六孔板内分别加入1 mL Gd3+浓度为0.44、0.88、1.76、2.64、3.52 mmol·L-1的CPQGd纳米探针或1 mL PBS，并共同培养6 h。其次，用胰酶消化收集细胞，并用4%的多聚甲醛重悬离心后的细胞并固定15 min。最后，用PBS重悬细胞，并置于500 μL的EP管中后，用快速自旋回波(Fast Spin Echo，FSE)序列扫描进行MRI扫描。其中，扫描参数：回波时间Min Full，重复时间425 ms，视野18 cm×18 cm，矩阵224×224，层厚3.0 mm，层间距1.5 mm。
将ATDC-5细胞(1×105 mL-1)接种于6孔板24 h后，向其中加入900 μL CPQGd(300 mg·L-1)的溶液，并分别培养0、0.5、1、2、4 h。接着，用PBS洗涤细胞，并用多聚甲醛固定30 min。结束后，将10 μL含DAPI的抗荧光猝灭剂滴于载玻片后制作细胞爬片。作为对照，将ATDC5细胞(1×105 mL-1)接种于含1 mL培养基的6孔板24 h，并用IL-1β的培养基诱导ATDC-5细胞。反应12h后，用PBS轻洗细胞，并依次进行材料添加、细胞固定、DAPI染色、制片。最后，在倒置荧光显微镜下观察细胞内的荧光状况。
将ATDC-5细胞接种于6孔板培养24 h后，分别向细胞孔中加入(1) Control、(2) IL-1β、(3) PQGd、(4) CPQGd(均为100 mg·L-1), 并共同培养1h。接着，除Control组外再向每组加入10 ng·mL-1 IL-1β诱导4 h。最后，将10 μmol·L-1 DCFH-DA探针与细胞在37 ℃下培养30 min后，用无菌PBS清洗，并在倒置荧光显微镜下观察荧光状况。
将ATDC-5细胞接种于6孔板培养24 h后，用与倒置荧光显微镜定性检测相同的方法进行分组、加药、共培养和清洗。接着，消化收集细胞，并离心弃去离心管中的上清液。然后，向细胞液避光加入1 mL浓度为10 μmol·L-1的DCFH-DA探针，并在37 ℃培养30 min。离心弃上清后，用PBS洗涤细胞。最后，加入500 μL PBS以重悬细胞，并用流式细胞仪进行定量检测。
通过一步热化学反应合成水溶性CPQGd纳米探针后，我们用TEM检测其形态及分散性，结果如图 1A所示。球形结构的CPQGd不仅显示出良好的分散性，14 nm的尺寸也显示出较好的均一性。同时，(106±15) nm的水合粒径表明CPQGd在水溶液中具有良好的分散性(图 1B)。而且，PEG的负电位[(-1.92±0.87) mV]使CPQGd显示出明显的负电位[(-17.43±0.72) mV](图 1C)，表明PEG在CPQGd表面的成功包覆。
为了进一步验证CPQGd纳米探针的成功合成，我们对其进行了紫外可见和傅里叶红外光谱测试。紫外可见光谱测试结果显示(图 2A)，CPQGd的紫外可见吸收光谱中不仅显示Gd(NO3)3·6H2O的特征吸收峰(275~325 nm)，而且能显示TCPP(400~450 nm)的特征吸收峰，并且显示了Ce3+(295 nm)、槲皮素(375nm)的特征性吸收峰，证明CPQGd的成功构建。这与文献报道类似：双金属CeZr-UiO-66样品的紫外可见光谱中同时出现了Zr与Ce的吸收峰，该结果支持具有不同电子性质的单金属和双金属UiO-66框架的成功形成[27]。对比样品的FTIR谱图后发现，槲皮素和TCPP在3 413 cm-1处的羟基伸缩振动峰，在形成纳米材料以后向低波数方向(2 882 cm-1)移动(图 2B)。此外，TCPP在1 686 cm-1处的C=O伸缩振动，也因与金属离子的反应而移动到1 630 cm-1 [28]。与槲皮素和TCPP不同，CPQGd纳米探针在1 242 cm-1处显示出羧基与金属离子反应的特殊吸收峰[29]，进一步证实超小槲皮素-钆纳米颗粒的成功合成。
Gd3+的存有望赋予超小槲皮素-钆纳米探针良好的MRI性能。测试结果表明，T1 WI信号随CPQGd浓度的增加而增强，对应的T1图(T1 mapping)由蓝色向深红色转变(图 3A)。根据Gd3+的浓度和T1图计算可知，CPQGd的T1加权弛豫率(r1)为23.2 L·mmol-1·s-1，远高于临床MRI造影剂Gd-DTPA(4.49 L·mmol-1·s-1)，表明制备的CPQGd纳米探针具有更优秀的T1 MRI效果(图 3B)。接着，我们进一步评价CPQGd在水溶液中的荧光成像性能。如图 3C所示，CPQGd纳米探针的水溶液在激发光照射下显示红色荧光，其红色荧光随质量浓度的增加而增强。而且，由CPQGd在425 nm激发波长作用下的荧光光谱可知，CPQGd纳米探针的水溶液在650和715 nm处显示明显的特征吸收峰(图 3D)，而且荧光强度随CPQGd浓度的增加而逐渐增强(图 3E)，表明超小CPQGd纳米探针具有良好的荧光/T1 MRI双模态成像性能，这为其软骨细胞的定位提供了数据支撑。
为系统评价超小槲皮素-钆纳米探针的类酶催化活性及其抗氧化性，分别对CPQGd探针的SOD、CAT及POD的模拟活性进行了测定。首先，我们用WST-1法检测对O2-·的清除能力来评估其SOD活性，结果如图 4A所示。随着CPQGd纳米探针浓度的增加，其对O2-·的清除率逐渐增加，表明纳米探针的SOD活性随浓度增加而显著增强。接着，我们通过监测反应体系中过氧化氢(H2O2)的消耗来评估类CPQGd纳米探针的CAT活性。如图 4B所示，CPQGd纳米探针的CAT活性随浓度的升高而逐渐增加，表明CPQGd纳米探针能有效催化H2O2分解为水和氧气，且H2O2清除率随纳米探针浓度的升高而增加。此外，我们还进一步以TMB为显色底物来检测CPQGd纳米探针的POD活性。如图 4C所示，检测体系在过氧化氢(H2O2)存在下的紫外吸光度随纳米探针浓度的增加而增强，表明CPQGd纳米探针具有显著的POD活性，且活性与浓度呈正相关。研究表明，ABTS经氧化后生成的ABTS+·在734 nm处具有特征吸收峰。当ABTS+·被还原时，其在734 nm处的可见吸光度值下降。由此可知，可用ABTS来判断CPQGd纳米探针的清除自由基能力。如图 4D所示，CPQGd纳米探针对ROS的清除率随其浓度的增加而逐渐增强，表明CPQGd纳米探针能有效清除ABTS+·。综上所述，CPQGd纳米探针具有很强的抗氧化性能，这为其在骨关节的抗氧化治疗提供了理论基础。
在生物成像应用之前，以ATDC5细胞和RAW 264.7细胞为模型，用CCK8法对CPQGd的体外细胞毒性进行了评估。如图 5A和5B所示，与CPQGd纳米探针共培养的ATDC5细胞和RAW 264.7细胞存活率随纳米质量探针浓度的增加仅轻度下降。即使在较高质量浓度时(400 mg·L-1)，ATDC5和RAW 264.7细胞的存活率仍在80%以上，表明CPQGd纳米探针细胞毒性较低，这为其后续的细胞实验奠定了理论基础。接着，我们用3T磁共振成像仪对CPQGd纳米探针在ATDC5细胞内的T1成像能力进行系统探究，结果如图 5C所示。随着CPQGd纳米探针浓度的增加，吞噬CPQGd的ATDC5细胞越来越亮，表明CPQGd纳米探针在ATDC5软骨细胞内仍然具有较好的T1成像能力。最后，我们用细胞内的荧光亮度评价CPQGd纳米探针对退变ATDC5细胞的靶向性，结果如图 5D所示。与IL-1β诱导后ATDC5细胞内的红色荧光信号相比，无IL-1β诱导ATDC5细胞的红色荧光信号较弱，表明正常的软骨细胞对CPQGd纳米探针的摄取能力较差。相对而言，早期退变软骨细胞表面较少的负电荷通过电荷-电荷(静电)相互作用，能精准吸引带有大量负电荷的CPQGd纳米探针，进而达到精准靶向的目的。因此，我们制备的超小CPQGd纳米探针能精准靶向退变的软骨细胞，并凭借优异荧光/T1磁共振能力对细胞进行精准定位，这为其未来在关节炎的诊疗提供了理论基础。
基于CPQGd纳米探针优秀的抗氧化性，我们进一步评估了其在体外IL-1β诱导细胞模型中的抑制ROS能力，结果如图 6所示。在荧光探针DCFH-DA的作用下，细胞内的ROS显示出红色。同时，DAPI能将细胞核染成蓝色，这对细胞核的定位十分有利。由图 6A的共聚焦荧光图像可知，与CPQGd纳米探针共培养后，红色荧光显著下降，表明纳米探针能有效降低细胞内的ROS。对比不同纳米探针处理后的红色荧光强度后发现(图 6B)，IL-1β的诱导能显著增强细胞内的ROS，而CPQGd纳米探针表现出最强的ROS抑制作用。最后，流式细胞检测分析结果进一步证明CPQGd纳米探针能有效抑制退变ATDC5细胞内ROS的生成(图 6C)。
*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001; * indicates comparison with the control group.
在该研究中，我们通过槲皮素与钆离子的偶联合成了超小槲皮素-钆CPQGd纳米探针。通过静电作用，带较强负电荷的CPQGd纳米探针可以精准靶向带有退变软骨细胞，并借助荧光/T1 MRI多模态成像技术准确判定细胞位置。体外功能测定表明，CPQGd纳米探针具有优异的模拟细胞内抗氧化酶的能力，并能有效防止ROS介导的氧化损伤。未来，我们将进一步探索铈离子在CPQGd纳米探针中可能发挥的协同或增强作用，并进一步研究在其骨关节模型中的抗氧化潜力。总体而言，我们合理设计的CPQGd纳米探针可能会启发下一代高性能中药纳米探针在骨关节炎诊疗的未来发展，以进一步扩大中药纳米探针的实用性。
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图 1 (A) CPQGd的透射电镜图; (B) CQGd和CPQGd的水合粒径分布; (C) PEG、CQGd和CPQGd的ζ电位图
Figure 1 (A) TEM image of CPQGd; (B) Hydrodynamic diameter distributions of CQGd and CPQGd; (C) ζ potential profiles of PEG, CQGd, and CPQGd
图 2 (A) CPQGd、Gd(NO3)3·6H2O、TCPP、Ce(NO3)3·6H2O和槲皮素(Que)的紫外可见吸收光谱图; (B) CPQGd、TCPP和槲皮素的FTIR谱图
Figure 2 (A) UV-Vis absorption spectra of CPQGd, Gd(NO3)3·6H2O, TCPP, Ce(NO3)3·6H2O, and Quercetin (Que); (B) FTIR spectra of CPQGd, TCPP, and Quercetin
图 3 不同Gd3+浓度的CPQGd溶液的(A) T1 WI、T1 mapping和(B) T1加权弛豫率; 不同质量浓度的CPQGd溶液的(C) 荧光及对应的(D) 荧光光谱图和(E) 荧光强度
Figure 3 (A) T1 WI, T1 mapping, and (B) T1-weighted relaxivity ratio of CPQGd solutions with different Gd3+ concentrations; (C) Fluorescence images and corresponding (D) fluorescence spectra and (E) fluorescence intensities of CPQGd solutions with various mass concentrations
图 4 CPQGd纳米探针的(A) 类SOD、(B) 类CAT和(C) 类POD活性及(D) 基于ABTS的ROS清除率
Figure 4 (A) SOD-like, (B) CAT-like, and (C) POD-like activities and (D) ABTS-based ROS scavenging rate of the CPQGd nanoprobe
图 5 不同浓度CPQGd纳米探针对(A) ATDC5细胞和(B) RAW 264.7细胞的细胞毒性; (C) 与不同浓度CPQGd共培养的ATDC5细胞的T1 WI图; (D) IL-1β诱导前后ATDC5细胞对不同浓度CPQGd纳米探针的共聚焦荧光图像(蓝色荧光: 细胞核的DAPI染色，红色荧光: CPQGd纳米探针)
Figure 5 Cytotoxicity of CPQGd nanoprobes at different concentrations toward (A) ATDC5 cells and (B) RAW 264.7 cells; (C) T1-WIs of ATDC5 cells co-cultured with CPQGd at various concentrations; (D) Confocal fluorescence images of ATDC5 cells before and after IL-1β induction, incubated with different concentrations of CPQGd nanoprobes (blue fluorescence: DAPI staining for nuclei; red fluorescence: CPQGd nanoprobes)
图 6 与不同纳米探针共培养后的软骨细胞经DFCH-DA和DAPI染色后的(A) 共聚焦荧光图像、(B) 红色荧光强度和(C) 流式细胞术定量分析
Figure 6 (A) Confocal fluorescence images, (B) red fluorescence intensity, and (C) quantitative flow cytometry analysis of chondrocytes stained with DCFH-DA and DAPI after co-incubation with different nanoprobes
*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001; * indicates comparison with the control group.
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