English

• 0.   引言

  光动力治疗(PDT)由于具有时间和空间的可控性优势，近二十几年来在抗癌领域已取得显著的研究进展并显示出诱人的临床应用前景^[1-4]。小分子的PDT光敏剂主要包括有机染料分子、过渡金属(如Ru、Ir、Re等)配合物及其一些有机/无机聚集体。金属Ru配合物具有良好的生物相容性、配体结构多样性、有效的¹O₂产生能力、较高的光稳定性、较长的三线态寿命等优势, 在光敏剂的研发中备受青睐^[5-9]，尤其是近年来，双光子过程^[10-15]被引入到生物成像及PDT过程中，使近红外光介导PDT疗法具有更深的组织穿透性、更好的空间成像分辨率和对正常组织更小的光损伤。如最近Chao等以Ru、Ir、Pt配合物为光敏剂，运用双光子技术的优越性再结合一些新的治疗策略^[16]、新的治疗靶点^[17]或联合新的治疗手段^[18]，均获得了显著的治疗效果。

  如何通过修饰光敏剂结构有效提高双光子吸收截面，并与所需的生物活性和光物理特性相结合，实现有效的双光子激发的PDT疗效最大化，是当前的一个重要挑战。迄今为止，临床应用的3例卟啉类光敏剂都是低双光子截面(σ)双光子发色团，如Photofrin在800 nm激发下的σ=10 GM^[19]；原卟啉Ⅸ在800 nm激发时σ=1.0 GM^[20]；Verteporfin在900 nm激发下σ=50 GM^[21]。为了获得大的σ值，对卟啉环可以进行多种基团修饰，而共轭修饰往往集中在卟啉的中位，如在体内实现双光子PDT的第一个卟啉衍生物是通过碳碳三键中位偶联的二聚体^[22]。本文报道了β位修饰的2个高共轭性卟啉-Ru联吡啶配合物PorRu、PorZn-Ru的合成，并测定了2个配合物在800 nm激发下的σ值和对体外鼻咽癌HK-1细胞株的PDT活性。

  1.   实验部分

  1.1   试剂

  β-硝基卟啉根据文献^[23]合成。5，6-二氨基-1, 10-菲咯啉(98%)、cis-Ru(bpy)₂Cl₂(98%)、浓盐酸(AR)、碳酸氢钠(AR)、无水硫酸钠(AR)、氯化锡二水合物(AR)、二氯甲烷(AR)、正己烷(AR)、吡啶(AR)、CHCl₃(AR)、MeOH(AR)、THF(AR)、EtOH(AR)、Zn(OAc)₂· 2H₂O(AR)、乙二胺四乙酸(H₄EDTA，AR)、柱层析硅胶(AR)、柱层析Al₂O₃(AR)均购自上海阿拉丁试剂公司。磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH=7.4)、3-(4'，5'-二甲基噻唑-2'-基)-2，5-二苯基-溴化四唑(MTT，98%)、胰蛋白酶、探针Lyso-Tracker Green DND-26L7526、Mito- Tracker Green FM M7514购自ThermoFisher公司。

  1.2   仪器及表征方法

  所用仪器：Bruker Ultrashield 400 plus核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司)、Bruker Autoflex MALDI- TOF质谱仪(瑞士Bruker公司)、Finnigan TSQ质谱仪710(FAB-MS，美国菲尼根质谱公司)、Nicolet Magna 550 Series Ⅱ红外光谱(美国赛默飞公司)、Varian Cary 300紫外可见分光光度计(美国瓦里安公司)、Photon Technology International QM4荧光光谱仪(配备InGaAs检测器，美国PTI公司)、HORIBA JOBIN YUON单光子计数控制器(法国JobinYvon公司)、TOPAS-HR光学参量放大器(OPA，立陶宛来特激光公司)、Tecan Infinit F200酶标仪(瑞士Tecan公司)、CytoFLEX S流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)、Olympus FV1000共聚焦显微镜及FV10-ASW图像处理分析软件(日本Olympus公司)。

  1.2.1   结构表征

  ¹H NMR的化学位移以四甲基硅烷(TMS，δ= 0.00)为内标；高分辨质谱MALDI-TOF使用2，5-二羟基苯甲酸(DHB)为基质；IR光谱使用KBr压片法。

  1.2.2   线性光物理性质的测试

  配制浓度为1 µmol·L^-1的配体L、PorRu及PorZn-Ru的溶液，分别使用Varian Cary 300分光光度计、Photon Technology International (PTI) QM4测量UV-Vis吸收光谱、光致发光光谱。以四苯基卟啉(H₂TPP，Φ_F=0.106，溶剂：苯)为参比，根据文献方法^[24]确定物质的光致发光量子产率(激发波长为440 nm，激发、发射的狭缝宽度为5 nm)。荧光寿命使用配备脉冲二极管光源的HORIBA JOBIN YUON单光子计数控制器测量(激发光波长440 nm)。使用配备InGaAs检测器的PTI QM4光谱仪采用直接法检测¹O₂，通过其在1 270 nm的磷光发射确定。在CHCl₃(溶液配制前，溶剂先鼓氧)中，以化合物H₂TPP (Φ_Δ=0.55±0.11)为标准，配合物的¹O₂量子产率用以下等式测定^[25]：

  $ {\mathit{\Phi }_{\Delta , {\rm{S}}}} = {\mathit{\Phi }_{\Delta , {\rm{REF}}}} \times \frac{{{n_{\rm{S}}}}}{{{n_{{\rm{REF}}}}}} \times \frac{{{G_{\Delta , {\rm{S}}}}}}{{{G_{\Delta , {\rm{REF}}}}}} \times \frac{{{A_{{\rm{REF}}}}}}{{{A_{\rm{S}}}}} $

  (1)

  其中，Φ_Δ是¹O₂量子产率，G是¹O₂发射光谱下的积分面积，n是溶剂的折射率，A是激发波长处的吸光度。下标中的REF、S分别表示参比和样品。激发测量¹O₂发射光谱的样品吸光度设置为0.05，以尽量减少发射光的再吸收。

  1.2.3   非线性光物理性质的测试

  双光子吸收光谱在800 nm处通过开孔Z-scan方法测量。检测使用光源系统为TOPAS-HR光学参量放大器钛: 蓝宝石再生放大器系统，参数指标为100 fs、800 nm的激光脉冲，峰值功率276 GW·cm^-2。激光束被分束器分成2部分。一束由光电二极管(D1)作为入射强度参考I₀监测，另一束由光电二极管(D2)检测为透射强度。通过f=20 cm的透镜后，激光束被聚焦并通过石英池。样品池的位置z通过计算机控制的可平移平台沿激光光束方向(z轴)移动，以便在恒定入射强度激光功率水平下改变样品池内的局部功率密度。样品池的透射强度信号由连接到计算机的光电二极管D2采集并被平均化。每个传输的强度信号代表超过100次测量的平均值。在一个高斯光束轮廓中，假设非线性吸收系数β值可以通过曲线拟合到观察到的开孔轨迹T(z)上，β值可以使用以下公式^[26]获得：

  $ T(z) = 1 - \frac{{\beta {I_0}\left( {1 - {{\rm{e}}^{ - {\alpha _0}l}}} \right)}}{{2{\alpha _0}{{\left( {1 + z/{z_0}} \right)}^2}}} $

  (2)

  其中α₀是线性吸收系数，l是样品长度(1 mm石英池)，z₀是入射光束的衍射长度。通过式2得到非线性吸收系数β后，样品分子的TPA横截面σ₂(以GM为单位，1 GM=10^-50 cm⁴·s·photon^-1) 可以使用式3计算^[27]。

  $ {\sigma _2} = \frac{{1000\beta h\nu }}{{{N_{\rm{A}}}c}} $

  (3)

  其中N_A是阿伏加德罗常数，c是溶液中样品的浓度(PorRu、PorZn-Ru的测试浓度为4 mmol·L^-1)，h是普朗克常数，ν是入射激光束的频率。配合物的σ₂是4次独立测量的平均值。

  1.2.4   荧光半定量法测定细胞摄取量

  将人鼻咽癌细胞HK-1(每孔2×10⁵个细胞)分别与2 µmol·L^-1的PorRu、PorZn-Ru避光孵育24 h。用PBS洗涤上述细胞2次，再用胰蛋白酶消解细胞使细胞悬浮。悬浮溶液离心后再用PBS彻底洗涤并稀释至4×10⁵ mL^-1，测量其荧光强度I_S。建立一个配合物荧光强度对PBS中配合物标准浓度的校准曲线和线性方程(强度对浓度)，通过测定细胞的荧光强度I_S，半定量地确定细胞吸收配合物的含量。

  1.2.5   流式细胞仪细胞摄取效率测定

  将HK-1细胞(每孔2×10⁵个细胞)接种过夜，再将细胞与PorRu(2 µmol·L^-1)分别孵育一系列不同的时间间隔(1、2、6、24 h)。细胞用胰蛋白酶消化并用PBS洗涤2次，用CytoFLEX S流式细胞仪分析不同孵育时间下HK-1细胞对药物的吸收。测试条件：用488 nm氩激光激发细胞，FL-3(配备650 nm长通滤波器)收集发射强度，分析10 000个事件。

  1.2.6   共聚焦成像分析

  将HK-1细胞(每孔5×10⁴个细胞)接种过夜，细胞再与PorRu(2 µmol·L^-1)避光孵育24 h。PBS冲洗细胞后再分别用探针DND-26L7526(100 nmol·L^-1)或FM M7514(100 nmol·L^-1) 在黑暗中各孵育30 min。PBS再次冲洗细胞并用Olympus FV1000共聚焦显微镜进行共聚焦分析，用FV10-ASW软件处理(对于PorRu，λ_Ex=488 nm，λ_Em=630~730 nm；对于Mito/Lyso探针，λ_Ex=488 nm，λ_Em=500~540 nm)。

  1.2.7   暗毒性、PDT疗效的评估

  将HK-1细胞(96孔板，每孔1×10⁴个细胞)分别与浓度为2、4、8 µmol·L^-1的PorRu、PorZn-Ru在含有体积分数为0.25% 的DMSO的培养基中避光孵育24 h，新鲜培养基补充细胞一次。以来自400 W钨丝灯的黄光(强度：4 mW·cm^-2，钨灯配备有隔热滤光片和500 nm长通滤光片)照射细胞不同时间后(光剂量：0、2、4 J·cm^-2)，再避光培养24 h。用PBS洗涤细胞，用MTT还原试验法^[28]评估细胞活力。溶解的甲臜晶体的光密度(A)使用96孔板读数器(Tecan Infinit F200)测量，波长为570和690 nm。使用式4计算细胞毒性百分比R_cytotoxicity：

  $ {R_{{\rm{cytotoxicity }}}} = \left( {{A_{\rm{C}}} - {A_{\rm{T}}}} \right)/\left( {{A_{\rm{C}}} - {A_{\rm{B}}}} \right) \times 100\% $

  (4)

  其中，对于暗毒性评估，A_C对应DMSO溶剂组，A_B对应空白组，A_T对应给药组；对于PDT疗效评估，A_C对应给药而无光照组，A_B对应无给药无光照组，A_T对应给药且光照组，每个A值设置平行的3个实验取其平均值确定。

  1.3   目标产物合成

  目标产物PorRu、PorZn-Ru的合成路线如图 1所示。

  图 1

  

  图 1.  PorRu和PorZn-Ru的合成路线

  Figure 1.  Synthesis route of PorRu and PorZn-Ru

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  1.3.1   配合物2的合成

  将氯化锡二水合物(185 mg，0.821 mmol)和浓盐酸(0.5 mL)添加到β-硝基卟啉(54 mg，0.082 mmol) 的二氯甲烷溶液(5 mL)中。将反应混合物在氮气气氛及避光条件下室温搅拌，并通过TLC(CH₂Cl₂/正己烷，1∶4，V/V)监测反应。当反应完成时，加入CH₂Cl₂ (30 mL)和水(20 mL)，有机层依次用水(30 mL)、碳酸氢钠溶液(5%，30 mL×2)、水(30 mL)洗涤，再用无水硫酸钠干燥，过滤除去有机溶剂后得到β-氨基四苯基卟啉。中间产物通过IR和FAB-MS鉴定。由于β-氨基卟啉易氧化不稳定，所以此步不进行纯化，直接进行光氧化。将氨基衍生物溶解在20 mL无水CH₂Cl₂中，溶液用干燥O₂鼓泡20 min，混合液在白炽灯照射下搅拌几天。TLC(CH₂Cl₂/石油醚，2∶3，V/V)法监测反应，当β-氨基卟啉消耗完时，蒸干反应液。残渣通过硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为CH₂Cl₂/石油醚(2∶3，V/V)，得到中间体2(18 mg)，两步总收率为35.6%。¹H NMR(CDCl₃)：δ -2.12(s，2H)，7.66~7.79 (m，12H)，7.89~7.91(m，4H)，8.11~8.14(m，4H)，8.52 (s，2H)，8.59(d，2H，J=5.0 Hz)，8.74(d，2H，J=4.9 Hz)。FAB - MS(m/z)：C₄₄H₂₈N₄O₂([M]⁺) 计算值644；实测值([M+H]⁺)645.0。

  1.3.2   配体L的合成

  将5，6-二氨基-1，10-菲咯啉(26 mg，0.124 mmol)、卟啉-α-二酮2(80 mg，0.124 mmol)和吡啶(8 mL)加入一个三颈烧瓶中。在N₂气氛下将混合物加热至110 ℃并搅拌过夜，除掉吡啶溶剂，残余物通过硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为CHCl₃/MeOH(100∶1，V/ V)，得到卟啉配体L(71 mg，68%)。IR(KBr，cm^-1)：2 913(m)，2 844(w)，1 719(s)，1 638(s)，1 609(m)，1 572(s)，1 556(m)，1 540(w)，1 458(m)，1 384(m)，1 266(s)，1 151(s)，1 119(m)，1 074(s)，796(s)，698(s)，518(w)。¹H NMR(CDCl₃)：δ -2.62(s，2H)，7.70~7.88(m，8H)，7.90~7.93(m，4H)，8.01~8.05(m，2H)，8.23(dd，2H，J=1.7 Hz，7.6 Hz)，8.31(d，2H，J=7.0 Hz)，8.75(s，2H)，8.83(d，2H，J=8.2 Hz)，8.97(s，4H)，9.24(d，2H，J=2.9Hz)。HRMS (MALDI-TOF)(m/z)：C₅₆H₃₄N₈([M]⁺)计算值818.290 6；实测值([M+H]⁺)818.288 1。

  1.3.3   配合物PorRu的合成

  将卟啉配体L(30 mg，0.036 mmol)、cis-Ru(bpy)₂Cl₂(53 mg，0.233 mmol) 加入到15 mL THF和15 mL EtOH的溶液中。混合液中通入N₂几分钟，将反应温度设置为85 ℃并回流15 h。反应完成后，旋蒸除去溶剂，残余物在Al₂O₃上层析数次，洗脱液依次为CHCl₃、CHCl₃/MeOH(12∶1，V/V)，最终得到PorRu 30.49 mg，产率65%。IR(KBr，cm-1)：2 918(m)，2 851(w)，1 715(s)，1 640(s)，1 609(m)，1 569(s)，1 551(w)，1 534(w)，1 458(m)，1 384(m)，1 261(s)，1 151(s)，1 125(m)，1 071(s)，795(s)，698(s)，518(w)。¹H NMR(DMSO- d₆)：δ -2.74(s，2H)，7.30~7.32(m，2H)，7.61~7.63(m，2H)，7.72(d，2H，J=5.6 Hz)，7.83~7.90(m，10H)，8.01~ 8.04(m，4H)，8.10~8.12(m，4H)，8.24~8.30(m，10H)，8.32(d，2H，J=7.5 Hz)，8.68(s，2H)，8.74(d，2H，J=8.0 Hz)，8.89(dd，4H，J=6.4 Hz，18.2 Hz)，9.07(dd，4H，J=4.8 Hz，16.8 Hz)。HRMS(MALDI-TOF) (m/z)：C₇₆H₅₀N₁₂Ru ([M-2Cl]⁺)计算值1 232.333 9；实测值([M-2Cl]⁺)1 232.339 7，([M-2Cl+DHB]⁺)1 385.277 6。

  1.3.4   配合物PorZn-Ru的合成

  卟啉配体L(35 mg，0.043 mmol) 和Zn(OAc)₂· 2H₂O(0.215 mmol) 溶解在20 mL混合溶剂(CHCl₃/ MeOH，1∶1，V/V)中，混合液在60 ℃回流5 h。反应结束后，向溶液中加入等体积的EDTA水溶液(0.01 mol·L^-1 H₄EDTA+0.1 mol·L^-1醋酸盐缓冲液，pH= 4.7)，继续搅拌24 h，分离有机层，并依次用4% 碳酸氢钠水溶液、水和盐水50 mL各洗涤一次。以CHCl₃为洗脱剂，硅胶柱色谱纯化该粗产物，得到金属锌卟啉配体。在类似的处理方法下，锌卟啉(35 mg，0.039 mmol)与cis-Ru(bpy)₂Cl₂(0.117 mmol)反应生成PorZn-Ru，两步总产率为64%(36 mg)。IR(KBr，cm^-1)：2 915(s)，2 855(m)，1 715(s)，1 644(s)，1 610(m)，1 569(s)，1 551(w), 1 531(w), 1 460(m), 1 384(m), 1 259(s)，1 151(s)，1 125(m)，1 071(s)，796(s)，695(s)，518(w)。¹H NMR(DMSO-d₆)：δ 7.30~7.32(m，2H)，7.61~7.63(m，2H)，7.73(d，2H，J=5.4 Hz)，7.83~7.90(m，10H)，7.93~ 8.19(m, 8H)，8.22~8.28(m，10H)，8.31~8.33(m，2H)，8.73(s，2H)，8.76(d，2H，J=4.7 Hz)，8.81(m，4H)，8.88 (d，2H，J=8.1 Hz)，8.92(d, 2H，J=8.2 Hz)。HRMS (MALDI-TOF)(m/z)：C₇₆H₄₈N₁₂RuZn([M-2Cl]⁺)计算值1 296.246 3；实测值([M-2Cl]⁺)1 296.245 3，([M-2Clbipyridine]⁺)1 140.307 5。

  2.   结果与讨论

  2.1   合成和表征

  两个最终产物通过¹H NMR、HRMS、IR、UV-Vis光谱进行了表征。在PorRu的¹H NMR数据(图S1，Supporting information)中，化学位移在8.6~8.8之间存在1个单峰和2个双峰共振，这是典型的吡咯氢的化学位移；化学位移在9.0的信号应该归属于1，10-菲咯啉、联吡啶基配位N原子相邻的氢；化学位移在7.0~8.3之间的信号应该归属于远离1，10-菲咯啉、联吡啶基配位N原子的质子及苯环质子的共振吸收。自由基卟啉的2个N—H质子出现在化学位移为-2.74的高场。与PorRu相比，PorZn-Ru核磁谱峰与之相似(图S2)，但峰更宽，这可能是由于其更刚性的分子结构在NMR测试所需浓度下更易聚集。PorRu的高分辨率MALDI-TOF质谱中(图S3)，在m/z=1 232.339 7处显示出强信号，代表该带电配合物的分子离子峰(理论值：1 232.333 9)在m/z= 1 385.277 6处有一弱信号，代表带电分子与基质DHB的质量总和。类似地，PorZn-Ru的高分辨率质谱(图S4)在m/z=1 296.245 3处显示出强信号，代表该带电配合物的分子离子峰(理论值：1 296.246 3) 在m/z=1 140.3处出现了失去一个配位联吡啶基团的离子碎片峰。

  2.2   光谱性质

  PorRu、PorZn-Ru及卟啉配体L在DMSO中的UV-Vis光谱如图 2A所示。这是典型的卟啉衍生物的吸收光谱，强的Soret吸收带(420~440 nm)与弱的Q带(500~650 nm)共存。相对于四苯基卟啉(H2TPP) 的Soret带和Q带，吡嗪环共轭连接的PorRu显示出较大红移(约20 nm)和更宽谱峰，这种现象在其它共轭卟啉-Ru(Ⅱ)配合物中普遍存在。由于锌卟啉-Ru(Ⅱ) 配合物具有更高的结构对称性，因此PorZn-Ru的Q带数目(2个)少于自由基卟啉-Ru(Ⅱ)配合物PorRu(3个)^[29]。此外，在吸收光谱中还可以清楚观察到联吡啶基团相关的π-π*电子跃迁(285 nm)。

  图 2

  

  图 2.  L、PorRu和PorZn-Ru的UV-Vis吸收光谱(A)、荧光激发和发射光谱(B); 由PorRu和PorZn-Ru产生的¹O₂的近红外磷光光谱(λ_max=1 270 nm) (C); PorRu和PorZn-Ru的开孔Z-scan测量(D)

  Figure 2.  UV-Vis absorption spectra (A), excitation and emission fluorescence spectra (B) of L, PorRu, and PorZn-Ru; Near-infrared phosphorescence spectra of 1O₂ at 1 270 nm generated by PorRu and PorZn-Ru (C); Open-apertureZ-scan measurements of PorRu and PorZn-Ru (D)

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  PorRu、PorZn-Ru及卟啉配体L在DMSO溶液中的激发、发射光谱如图 2B所示(L：λ_ex=436 nm，PorRu、PorZn-Ru：λ_ex=440 nm)。PorRu在约660和730 nm处出现双发射峰，这些荧光发射峰能级与吸收光谱的Q带Q(0，0)电子跃迁的能级相匹配，据此可以推测这些荧光发射应该来自卟啉的S₁激发态到S₀基态的弛豫^[30]。相对于卟啉配体L(量子产率10%, 寿命9.5 ns)，PorRu、PorZn-Ru的荧光量子产率(< 3%)和寿命(2.1~2.6 ns)明显降低(图S4及表 1)。尤其是PorZn-Ru的荧光几乎被猝灭并且在600~ 750 nm范围内只有微弱的宽发射带，这表明卟啉环插入金属锌会严重降低其荧光强度，这种重原子猝灭效应在一些多金属或卤代卟啉的文献中常有报道^[31]。

  表 1

  

  表 1  L、PorRu和PorZn-Ru的光谱参数

  Table 1.  Spectral parameters of L, PorRu, and PorZn-Ru

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  Compound	λabs / nm (lg[ε / (L·mol-1·cm-1)])	λem / nm (τ/ ns)	ΦF/%	ΦΔ
  L	436(5.14), 527(4.22), 561(3.95), 597(4.00), 654 (3.80)	664(10.54), 726 (9.80)	10	—
  PorRu	285(4.79), 440(5.19), 530(4.29), 600(4.00), 657 (3.55)	664(2.67), 728 (2.17)	3	0.93
  PorZn-Ru	285(5.03), 440(5.22), 584(4.44), 620(3.95)	667(2.16)	0.5	0.82

  在CHCl₃中以422 nm光源激发时，在约1 270 nm处检测到PorRu、PorZn-Ru和参照物(H2TPP) 的1O2的生成(图 2C)。通过计算^[22]，PorRu、PorZn-Ru具有非常高的¹O₂量子产率，分别达到0.93和0.82。造成高¹O₂量子产率的原因可能是这种刚性分子的高共轭性导致三重激发态能量T₁的降低和聚集，从而更有利于其与氧分子三线态发生能量交换^[32]。同理，分子结构的高共轭性也可能大大提高其双光子吸收截面，我们以罗丹明B为参照物，采用开放孔径的Z-scan的方法，在800 nm脉冲激光激发下，测得PorRu、PorZn-Ru的双光子吸收截面分别达619、621 GM(图 2D)，远远高于临床用Photofrin及Verteporfin的σ值。进一步发现2个配合物在800 nm激发下表现出双光子诱导的荧光，其荧光光谱(图S6)与单光子激发过程基本一致。以上结果表明，PorRu、PorZn-Ru在多光子诱导PDT治疗中也具有一定的应用潜力。

  2.3   细胞摄取及PDT活性

  选取鼻咽癌HK-1细胞株为研究对象，以meso-四(4-(N-甲基吡啶基))卟啉(H₂TMPyP)为参照，在避光及2 µmol·L^-1给药浓度下孵育24 h后，用半定量荧光分析方法评估HK-1细胞对光敏剂PorRu、PorZn-Ru的摄取。结果显示，2个配合物都能被HK-1细胞大量摄取(图 3)，在细胞摄取量上几乎无差别，相比于参照物H₂TMPyP，光敏剂PorRu、PorZn-Ru在细胞质内的累积浓度提高了10倍，达到每10⁶个细胞约22 nmol。以PorRu为例，用流式细胞仪分析了HK-1细胞对其的摄取效率(图S7)，发现在2 µmol· L^-1的给药浓度下，1 h后配合物能大量进入细胞，而在孵育6 h后，细胞对PorRu的摄取基本达到饱和。而PorRu与HK-1细胞共孵育1 h后的细胞成像(图 4)也显示HK-1细胞内有明显的PorRu的红色荧光，融合的成像结果佐证了PorRu的快速细胞动力学吸收行为。2个配合物良好的细胞摄取能力可能归因于其两亲性的高共轭性分子结构有利于细胞膜对药物分子的亲和性和转运^[33]。

  图 3

  

  图 3.  半定量荧光分析法测定HK-1细胞对H₂TMPyP、PorRu (2 µmol·L^-1)和PorZn-Ru (2 µmol·L^-1)的摄取

  Figure 3.  Fluorescence semi-quantitative analysis of the uptake of H₂TMPyP, PorRu (2 µmol·L^-1), and PorZn-Ru (2 µmol·L^-1) by HK-1 cells

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  图 4

  

  图 4.  HK-1细胞与PorRu (2 µmol·L^-1)共孵育1 h后的荧光成像图

  Figure 4.  Fluorescence cell imaging of PorRu (2 µmol·L^-1) in HK-1 cell after 1 h incubation

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  一般而言，高共轭性的小分子具有较高的跨膜电势，往往能快速穿透细胞膜甚至线粒体膜^[34-35]。然而，通过特定的线粒体、溶酶体等细胞器标记物的共染实验，共聚焦显微成像图(图 5)进一步显示，配合物PorRu对线粒体、溶酶体没有特定的靶向性。此外，在其它不同的孵育时间段，也未发现PorRu在细胞内聚集状态的变化和对其它细胞器明确的靶向行为，目前对这一现象的机理仍不清楚。而由于PorZn-Ru的荧光效率极低，在培养基溶液中，几乎观察不到其发光，较难用荧光显微镜观察其亚细胞定位。

  图 5

  

  图 5.  PorRu与探针Lyso-Tracker Green DND-26L7526和Mito-Tracker Green FM M7514共染共聚焦成像

  Figure 5.  Co-staining imagings of PorRu with probes Lyso-Tracker Green DND-26L7526 and Mito-Tracker Green FM M7514

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  我们用MTT还原试验评估了PorRu、PorZn-Ru对HK-1细胞株的暗毒性及PDT效果。实验发现(图 6)，避光条件下(0 J·cm^-2)，PorRu、PorZn-Ru的暗毒性很低，即使在8 µmol·L^-1的高浓度下，细胞死亡率仍低于15%。而当HK-1细胞在96孔板中(每孔1×10⁴个细胞)与一定浓度(2、4、8 µmol·L^-1)的配合物PorRu、PorZn-Ru培养24 h后，将细胞暴露于4 mW·cm^-2强度的黄光下，用2 J·cm^-2光剂量照射，发现2 µmol·L^-1浓度下PorRu对HK-1细胞的光毒性为(38.31±1.39)%，接近半抑制率浓度，而同一浓度下PorZn-Ru的光毒性仅为(16.78±2.13)%。当在4 µmol·L^-1的浓度下时PorRu对HK-1细胞的光毒性高达(87.44±2.21)%，而同一浓度下PorZn-Ru的光毒性仅为(45.03±2.85)%。以上MTT分析结果表明PorRu的光动力疗效好于PorZn-Ru。在2个配合物的细胞摄取量无巨大差别的情况下，光毒性的大小差异可能归因于两者光生¹O₂量子产率的不同。而在4 J·cm^-2的光剂量条件下，即使是2 µmol·L^-1的低浓度下，2个配合物的细胞抑制率也达到90%以上。

  图 6

  

  图 6.  PorRu和PorZn-Ru对HK-1细胞的暗毒性和PDT活性

  Figure 6.  Dark toxicity and PDT activity of PorRu and PorZn-Ru on HK-1 cells

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  3.   结论

  我们对四苯基卟啉β位进行吡嗪杂环共轭修饰，制备了一种新的卟啉-Ru(PorRu)及相应的异双金属锌卟啉-Ru(PorZn-Ru)配合物。研究发现2个高共轭性配合物显示出吸收红移，并显示出与卟啉相关的特征发射、高的¹O₂量子产率、较高的双光子吸收截面、快速而良好的细胞摄取率、低的暗毒性。在无特异性亚细胞靶向的情况下2个配合物对HK- 1细胞仍表现出优越的PDT疗效。

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• 1. [1]

     Lan M H, Zhao S J, Liu W M, Lee C S, Zhang W J, Wang P F. Photosensitizers for Photodynamic Therapy[J]. Adv. Healthc. Mater., 2019, 8(13):  1900132. doi: 10.1002/adhm.201900132

  2. [2]

     Chen J M, Fan T J, Xie Z J, Zeng Q Q, Xue P, Zheng T T, Chen Y Y, Luo X L, Zhang H. Advances in Nanomaterials for Photodynamic Therapy Applications: Status and Challenges[J]. Biomaterials, 2020, 237:  119827. doi: 10.1016/j.biomaterials.2020.119827

  3. [3]

     Li X S, Kwon N, Guo T, Liu Z, Yoon J. Innovative Strategies for Hypoxic-Tumor Photodynamic Therapy[J]. Angew. Chem. Int. Ed., 2018, 57(36):  11522-11534. doi: 10.1002/anie.201805138

  4. [4]

     Xie J L, Wang Y W, Choi W, Jangili P, Ge Y Q, Xu Y J, Kang J L, Liu L P, Zhang B, Xie Z J, He J, Xie N, Nie G H, Zhang H, Kim J S. Overcoming Barriers in Photodynamic Therapy Harnessing Nano-Formulation Strategies[J]. Chem. Soc. Rev., 2021, 50:  9152-9201. doi: 10.1039/D0CS01370F

  5. [5]

     Zhao X Z, Liu J P, Fan J L, Chao H, Peng X J. Recent Progress in Photosensitizers for Overcoming the Challenges of Photodynamic Therapy: From Molecular Design to Application[J]. Chem. Soc. Rev., 2021, 50:  4185-4219. doi: 10.1039/D0CS00173B

  6. [6]

     Huang T C, Yu Q, Liu S J, Huang W, Zhao Q. Phosphorescent Iridium(Ⅲ) Complexes: A Versatile Tool for Biosensing and Photodynamic Therapy[J]. Dalton Trans., 2018, 47:  7628-7633. doi: 10.1039/C8DT00887F

  7. [7]

     Wu Y P, Li S M, Chen Y C, He W J, Guo Z J. Recent Advances in Noble Metal Complex Based Photodynamic Therapy[J]. Chem. Sci., 2022, 13(18):  5085-5106. doi: 10.1039/D1SC05478C

  8. [8]

     Yi S L, Lu Z, Zhang J, Wang J, Xie Z H, Hou L X. Amphiphilic Gemini Iridium(Ⅲ) Complex as a Mitochondria-Targeted Theranostic Agent for Tumor Imaging and Photodynamic Therapy[J]. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2019, 11(17):  15276-15289. doi: 10.1021/acsami.9b01205

  9. [9]

     Huang H Y, Banerjee S, Sadler P J. Recent Advances in the Design of Targeted Iridium (Ⅲ) Photosensitizers for Photodynamic Therapy[J]. ChemBioChem, 2018, 19:  1574-1589. doi: 10.1002/cbic.201800182

  10. [10]

      李佳, 计亮年, 巢晖. 生物素钌(Ⅱ)光敏剂作为肿瘤靶向双光子光动力治疗//中国化学会第十一届全国化学生物学学术会议论文集. 广州: 中国化学会, 2019: 252LI J, JI L N, CHAO H. Biotin-Ruthenium (Ⅱ) Photosensitizer as Tumor-targeted Two-Photon Photodynamic Therapy//Proceedings of 11th Chinese Chemical Biology Conference of Chinese Chemical Society. Guangzhou: Chinese Chemical Society, 2019: 252

  11. [11]

      Bolze F, Jenni S, Sour A, Heitz V. Molecular Photosensitisers for Two-Photon Photodynamic Therapy[J]. Chem. Commun., 2017, 53:  12857-12877. doi: 10.1039/C7CC06133A

  12. [12]

      Xu L, Zhang J Z, Yin L F, Long X T, Zhang W Y, Zhang Q C. Recent Progress in Efficient Organic Two-Photon Dyes for Fluorescence Imaging and Photodynamic Therapy[J]. J. Mater. Chem. C, 2020, 8:  6342-6349. doi: 10.1039/D0TC00563K

  13. [13]

      Sun Z Y, Zhang L P, Wu F P, Zhao Y X. Photosensitizers for Two-Photon Excited Photodynamic Therapy[J]. Adv. Funct. Mater., 2017, 27(48):  1704079. doi: 10.1002/adfm.201704079

  14. [14]

      Zipfel W R, Williams R M, Webb W W. Nonlinear Magic: Multiphoton Microscopy in the Biosciences[J]. Nat. Biotechnol., 2003, 21:  1369. doi: 10.1038/nbt899

  15. [15]

      Zeng L L, Kuang S, Li G Y, Jin C Z, Ji L N, Chao H. A GSH-Activatable Ruthenium (Ⅱ)-Azo Photosensitizer for Two-Photon Photodynamic Therapy[J]. Chem. Commun., 2017, 53:  1977-1980. doi: 10.1039/C6CC10330H

  16. [16]

      Shen J C, Liao X X, Wu W J, Feng T, Karges J, Lin M W, Luo H J, Chen Y, Chao H. A pH-Responsive Iridium(Ⅲ) Two-Photon Photosensitizer Loaded CaCO ₃ Nanoplatform for Combined Ca²⁺ Overload and Photodynamic Therapy[J]. Inorg. Chem. Front., 2022, 9(16):  4171-4183. doi: 10.1039/D2QI00951J

  17. [17]

      Ke L B, Wei F M, Xie L N, Karges J, Chen Y, Ji L N, Chao H. A Biodegradable Iridium (Ⅲ) Coordination Polymer for Enhanced Two-Photon Photodynamic Therapy Using an Apoptosis-Ferroptosis Hybrid Pathway[J]. Angew. Chem. Int. Ed., 2022, 61:  e202205429.

  18. [18]

      Kuang S, Wei F M, Karges J, Ke L B, Xiong K, Liao X X, Gasser G, Ji L N, Chao H. Photodecaging of a Mitochondria-Localized Iridium(Ⅲ) Endoperoxide Complex for Two-Photon Photoactivated Therapy under Hypoxia[J]. J. Am. Chem. Soc., 2022, 144(9):  4091-4101. doi: 10.1021/jacs.1c13137

  19. [19]

      Karotki A, Khurana M, Lepock J R, Wilson B C. Simultaneous Two-Photon Excitation of Photofrin in Relation to Photodynamic Therapy[J]. Photochem. Photobiol., 2006, 82:  443-452. doi: 10.1562/2005-08-24-RA-657

  20. [20]

      Goyan R L, Cramb D T. Near-Infrared Two-Photon Excitation of Protoporphyrin Ⅸ : Photodynamics and Photoproduct Generation[J]. Photochem. Photobiol., 2000, 72:  821-827. doi: 10.1562/0031-8655(2000)0720821NITPEO2.0.CO2

  21. [21]

      Khurana M, Collins H A, Karotki A, Anderson H L, Cramb D T, Wilson B C. Quantitative In Vitro Demonstration of Two-Photon Photodynamic Therapy Using Photofrin^® and Visudyne^®[J]. Photochem. Photobiol., 2007, 83:  1441-1448. doi: 10.1111/j.1751-1097.2007.00185.x

  22. [22]

      Collins H A, Khurana M, Moriyama E H, Mariampillai , A , Dahlstedt E, Balaz M, Kuimova M K, Drobizhev M, Yang V X D, Phillips D, Rebane A, Wilson B C, Anderson H L. Blood-Vessel Closure Using Photosensitizers Engineered for Two-Photon Excitation[J]. Nat. Photonics, 2008, 2:  420-424. doi: 10.1038/nphoton.2008.100

  23. [23]

      Crossley M J, King L G. Novel Heterocyclic Systems from Selective Oxidation at the β-Pyrrolic Position of Porphyrins[J]. J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1984, (14):  920-922. doi: 10.1039/C39840000920

  24. [24]

      Schmidt R, Afshari E. Comment on"Effect of Solvent on the Phosphorescence Rate Constant of Singlet Molecular Oxygen (1Δ _g)"[J]. J. Phys. Chem., 1990, 94:  4377-4378. doi: 10.1021/j100373a096

  25. [25]

      Li Y J, Pritchett T M, Huang J D, Ke M R, Shao P, Sun W F. Photophysics and Nonlinear Absorption of Peripheral-Substituted Zinc Phthalocyanines[J]. J. Phys. Chem. A, 2008, 112:  7200-7207. doi: 10.1021/jp7108835

  26. [26]

      Sheik-Bahae M, Said A A, Wei T H, Hagan D J, Van Stryland E W. Sensitive Measurement of Optical Nonlinearities Using a Single Beam[J]. IEEE J. Quantum Electron., 1990, 26(4):  760-769. doi: 10.1109/3.53394

  27. [27]

      He G S, Swiatkiewicz J, Yan J, Prasad P N. Two-Photon Excitation and Optical Spatial-Profile Reshaping via a Nonlinear Absorbing Medium[J]. J. Phys. Chem. A, 2000, 104(20):  4805-4810. doi: 10.1021/jp000370+

  28. [28]

      Mak N K, Leung W N, Wong R N S, Huang D P, Lung M L, Lau Y K, Chang C K. Involvement of Both Endoplasmic Reticulum and Mitochondria in Photokilling of Nasopharyngeal Carcinoma Cells by the Photosensitizer Zn-BC-AM[J]. Biochem. Pharmacol., 2004, 68:  2387-2396. doi: 10.1016/j.bcp.2004.08.024

  29. [29]

      任丽磊, 彭晓霞, 王树军, 肖立伟, 李泽强. 5-氟尿嘧啶卟啉锰/锌配合物的合成、光电性质及抗癌活性[J]. 无机化学学报, 2019,35,(6): 965-970. REN L L, PENG X X, WANG S J, XIAO L W, LI Z Q. Syntheses, Spectral and Electrochemical Properties, Antitumor Activities of Manganese/Zinc Complexes with Porphyrin Modified by 5-Fluorouracil[J]. Chinese J. Inorg. Chem., 2019, 35(6):  965-970.

  30. [30]

      Strachan J P, Gentemann S, Seth J, Kalsbeck W A, Lindsey J S, Holten D, Bocian D F. Effects of Orbital Ordering on Electronic Communication in Multiporphyrin Arrays[J]. J. Am. Chem. Soc., 1997, 119:  11191-11201. doi: 10.1021/ja971678q

  31. [31]

      张万宇, 张晓娟, 佟佳霖, 陈天赐, 田俊强, 胡蓉, 王志明. Meso-四(对甲基苯基)卟啉及其钴配合物的光学性能与生物应用[J]. 无机化学学报, 2018,34,(12): 2161-2171. doi: 10.11862/CJIC.2018.279ZHANG W Y, ZHANG X J, TONG J L, CHEN T C, TIAN J Q, HU R, WANG Z M. Optical Properties and Biological Applications of Meso-tetrakis (p-methylphenyl) Porphyrin and Its Cobalt Complex[J]. Chinese J. Inorg. Chem., 2018, 34(12):  2161-2171. doi: 10.11862/CJIC.2018.279

  32. [32]

      Ke H Z, Wang H D, Wong W K, Mak N K, Kwong D W, Wong K L, Tam H L. Responsive and Mitochondria-Specific Ruthenium (Ⅱ) Complex for Dual In Vitro Applications: Two-Photon (Near-Infrared) Induced Imaging and Regioselective Cell Killing[J]. Chem. Commun., 2010, 46:  6678-6680. doi: 10.1039/c0cc01848a

  33. [33]

      Schmitt J, Heitz V, Sour A, Bolze F, Ftouni H, Nicoud J, Flamigni L, Ventura B. Diketopyrrolopyrrole-Porphyrin Conjugates with High Two-Photon Absorption and Singlet Oxygen Generation for Two-Photon Photodynamic Therapy[J]. Angew. Chem. Int. Ed., 2015, 54(1):  169-173. doi: 10.1002/anie.201407537

  34. [34]

      Engelmann F M, Mayer I, Gabrielli D S, Toma H E, Kowaltowski A J, Araki K, Baptista M S. Interaction of Cationic meso-Porphyrins with Liposomes, Mitochondria and Erythrocytes[J]. J. Bioenerg. Biomembr., 2007, 39:  175-185. doi: 10.1007/s10863-007-9075-0

  35. [35]

      Zhang J X, Zhou J W, Chan C F, Lau C K, Kwong W J, Tam H L, Mak N K, Wong K L, Wong W K. Comparative Studies of the Cellular Uptake, Subcellular Localization, and Cytotoxic and Phototoxic Antitumor Properties of Ruthenium (Ⅱ)-Porphyrin Conjugates with Different Linkers[J]. Bioconjugate Chem., 2012, 23:  1623-1638. doi: 10.1021/bc300201h

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  图 1  PorRu和PorZn-Ru的合成路线

  Figure 1  Synthesis route of PorRu and PorZn-Ru

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  图 2  L、PorRu和PorZn-Ru的UV-Vis吸收光谱(A)、荧光激发和发射光谱(B); 由PorRu和PorZn-Ru产生的¹O₂的近红外磷光光谱(λ_max=1 270 nm) (C); PorRu和PorZn-Ru的开孔Z-scan测量(D)

  Figure 2  UV-Vis absorption spectra (A), excitation and emission fluorescence spectra (B) of L, PorRu, and PorZn-Ru; Near-infrared phosphorescence spectra of 1O₂ at 1 270 nm generated by PorRu and PorZn-Ru (C); Open-apertureZ-scan measurements of PorRu and PorZn-Ru (D)

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  图 3  半定量荧光分析法测定HK-1细胞对H₂TMPyP、PorRu (2 µmol·L^-1)和PorZn-Ru (2 µmol·L^-1)的摄取

  Figure 3  Fluorescence semi-quantitative analysis of the uptake of H₂TMPyP, PorRu (2 µmol·L^-1), and PorZn-Ru (2 µmol·L^-1) by HK-1 cells

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  图 4  HK-1细胞与PorRu (2 µmol·L^-1)共孵育1 h后的荧光成像图

  Figure 4  Fluorescence cell imaging of PorRu (2 µmol·L^-1) in HK-1 cell after 1 h incubation

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  图 5  PorRu与探针Lyso-Tracker Green DND-26L7526和Mito-Tracker Green FM M7514共染共聚焦成像

  Figure 5  Co-staining imagings of PorRu with probes Lyso-Tracker Green DND-26L7526 and Mito-Tracker Green FM M7514

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  图 6  PorRu和PorZn-Ru对HK-1细胞的暗毒性和PDT活性

  Figure 6  Dark toxicity and PDT activity of PorRu and PorZn-Ru on HK-1 cells

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  表 1  L、PorRu和PorZn-Ru的光谱参数

  Table 1.  Spectral parameters of L, PorRu, and PorZn-Ru

  Compound	λabs / nm (lg[ε / (L·mol-1·cm-1)])	λem / nm (τ/ ns)	ΦF/%	ΦΔ
  L	436(5.14), 527(4.22), 561(3.95), 597(4.00), 654 (3.80)	664(10.54), 726 (9.80)	10	—
  PorRu	285(4.79), 440(5.19), 530(4.29), 600(4.00), 657 (3.55)	664(2.67), 728 (2.17)	3	0.93
  PorZn-Ru	285(5.03), 440(5.22), 584(4.44), 620(3.95)	667(2.16)	0.5	0.82

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