English

• 0.   引言

  乳腺癌具有患者年轻化、发病率及死亡率高的特点，不仅威胁到个人身体健康和生命安全，而且严重影响我国乃至世界经济、社会发展^[1]。国际癌症研究机构(IARC)2020年2月发布了全球癌症统计报告，这份报告显示乳腺癌排在女性罹患癌症的第一位。据IARC估计，到2040年全球乳腺癌确诊患者人数将达到310万^[2]。目前，手术和化疗是治疗乳腺癌最常用的方法^[3-4]。然而，化疗虽可杀灭肿瘤细胞，但在治疗过程中，患者会出现身体疲乏、心脏中毒、肝功异常等情况，严重影响患者生活质量，限制其在临床上的广泛应用^[5-6]。为了提供最优化的肿瘤患者给药治疗方式，20世纪60年代中期研究者提出了药物缓释及靶向性治疗策略^[7]。即利用肿瘤和正常组织之间的高通透、高滞留(EPR)效应、pH值差异性、谷胱甘肽含量不同等区别，将药物定向转运到肿瘤组织，实现药物对正常细胞的低毒副作用，从而有效提高癌症治疗效率^[8-13]。

  纳米技术的出现为早日攻克癌症提供了新的视野，利用纳米材料的优势将抗癌药物阿霉素(DOX，结构见图 1)、顺铂、甲氨蝶呤、紫杉醇等设计为负载药物输送体系已经成为研究热潮^[14-20]。例如：Rao等设计、合成了两亲性嵌段聚合物负载DOX的纳米药物输送体系(COPY-DOX)，并且研究了它的抗肿瘤功效^[21]。Fan等把水分散性好的富勒烯作为纳米载体，制备出多功能性抗肿瘤前药体系，该体系有主动靶向性、光动力治疗和pH响应化疗3个特性^[22]。尽管纳米药物输送体系已经被大量开发，但其在肿瘤微环境中释放药物的特性却不尽如人意，并且其抗肿瘤效果也比游离的DOX弱，且生物相容性也有待继续研究。

  图 1

  

  图 1.  DOX的结构

  Figure 1.  Structure of DOX

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  Vallet-Regi等于2001年首次提出硅基介孔材料能够用于药物缓释，之后科研人员就展开了大量研究^[23]。如探究介孔载体表面性质、孔径、形貌等对其载药释药性能影响^[24-26]。分子筛孔道均匀、表面基团丰富、稳定性高和无毒等特点使其在生物医药方面的应用备受关注^[27-30]。综合各项研究成果发现：介孔分子筛不仅可以作为药物载体成为临床上的首选纳米材料，而且还提供了安全保障，这一点对临床医学至关重要。如Wen等研究了ZSM-5负载DOX以及pH对药物释放的影响^[31]；Abasian等研究了PLA/chitosan/NaX/Fe₃O₄/DOX纳米纤维复合物对H1355细胞的杀伤力作用，结果表明其可有效杀死75% 的肿瘤细胞^[32]。虽然上述分子筛-DOX纳米药物体系均取得一定成效，但其药物负载量还不是令人十分满意，且其合成过程繁琐，生物相容性及抗肿瘤效率还有待提高。

  为了得到一种制备过程绿色简单，且具有高负载率和低毒副作用的分子筛纳米药物，我们以Y型分子筛(YMS)作为基体，通过不同pH、不同负载时间和不同DOX加入量等实验探究最佳负载条件，将DOX借助氢键和范德华力等负载在YMS上制备出高负载纳米药物体系(YMS-DOX)。对YMS和YMS- DOX进行了功能基团、粒径和电位等表征，证实YMS-DOX药物体系成功制备。以人乳腺癌细胞(MM-231)和树突细胞(DC)为模型，经细胞毒性试验和流式细胞术测试表明，YMS-DOX具有缓释药物作用，能有效杀死肿瘤细胞，且可降低对正常细胞的毒副作用。

  1.   实验部分

  1.1   实验材料

  YMS(粒径约200 nm)由太原理工大学赠送。柠檬酸(C₆H₁₀O₈)和磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)购自上海阿拉丁试剂有限公司。DOX购自合肥博美生物科技有限责任公司。MM-231和DC细胞由山西医科大学提供。3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)购自北京索莱宝科技有限公司。

  1.2   YMS-DOX纳米药物制备及DOX负载量测定

  称取1.0 mg YMS^[33]，首先用无水乙醇超声高速离心洗涤2次，随后加入1.0 mL pH=9.0的缓冲溶液(C₆H₁₀O₈和Na₂HPO₄·12H₂O调配)，超声分散0.5 h。接着加入0.2 mg DOX，混合均匀后置于WIGGENS (WH220-R)型红外线加热电磁搅拌器(德国)上室温反应20.0 h。待反应结束，高速离心并用去离子水洗涤2~3次，直到上清液接近无色为止。待洗涤完毕，将YMS-DOX纳米颗粒用冷冻干燥机干燥备用，用棕色试剂瓶收集所有洗涤液，避光储存，此YMS-DOX为最佳制备条件所得样品。

  借助UV - Vis吸收光谱法^[34]和标准曲线计算DOX负载量。在2.0 mL的EP管中将1.0 mg·mL^-1的DOX溶液用pH=9.0的缓冲液依次稀释到10、20、30、40、50、60 μg·mL^-1。然后用紫外可见分光光度计检测DOX的吸光度，以吸光度值为纵坐标，DOX浓度为横坐标，绘制DOX的标准曲线。

  1.3   pH、作用时间和加入量对YMS-DOX负载量的影响

  称取10份1.0 mg的YMS，首先用无水乙醇超声高速离心洗涤2次，随后分别加入1.0 mL pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0的缓冲溶液(C₆H₁₀O₈和Na₂HPO₄·12H₂O调配)，超声分散0.5 h。接着加入0.2 mg DOX，混合均匀后置于红外线加热电磁搅拌器上室温反应20.0 h。待反应结束，高速离心并用去离子水洗涤2~3次，直到上清液接近无色为止。将YMS-DOX纳米颗粒置于冷冻干燥机干燥备用，用棕色试剂瓶收集所有洗涤液，避光储存。通过测定DOX在480 nm处吸光度，利用ε_DOX= 11 500 L·mol^-1·cm^-1计算出上清液中DOX含量，DOX加入总量与上清液中DOX含量的差值即为YMS中DOX负载量。

  称取5份1.0 mg的YMS，首先用无水乙醇超声高速离心洗涤2次，随后加入1.0 mL pH=9.0的缓冲溶液(C₆H₁₀O₈和Na₂HPO₄·12H₂O调配)，超声分散0.5 h。接着加入0.2 mg DOX，混合均匀后置于红外线加热电磁搅拌器上室温下依次反应0.5、1.0、4.0、12.0和20.0 h，待反应结束，后续操作如上所述。称取6份1.0 mg的YMS，首先用无水乙醇超声高速离心洗涤2次，随后加入1.0 mL pH=9.0的缓冲溶液(C₆H₁₀O₈和Na₂HPO₄·12H₂O调配)，超声分散0.5 h。随后依次分别加入0.1、0.2、0.4、0.5、0.8和1.0 mg的DOX，混合均匀后置于红外线加热电磁搅拌器上室温反应20.0 h，待反应结束，后续按上述操作处理。

  1.4   YMS-DOX纳米药物形貌、粒径和光谱表征

  取少量YMS和按照最佳条件制备得到的YMS-DOX(下同，不再特别说明)加入无水乙醇中，超声分散0.5 h后，将样品分别滴至数个铜网上，风干，借助FEI Tecnai F30型透射电子显微镜(TEM，荷兰) 对其形貌进行观察，加速电压200 kV。

  取少量YMS和YMS-DOX加入到蒸馏水中，超声分散0.5 h后，利用Nano ZS90马尔文激光粒度散射仪(英国)于25 ℃和90°测其粒径和ζ电位。

  取YMS、YMS-DOX和DOX分别加入到磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，超声分散0.5 h，随后借助日立U- 3900紫外可见吸收光谱仪(日本)测定其吸光度，扫描范围为800~200 nm。借助日立F-7000荧光光谱仪(日本)测定其荧光光谱图，设置激发波长为480 nm，发射波长扫描范围为500~700 nm，狭缝均设为5 nm。取冷冻干燥好的YMS-DOX与KBr混合，研磨压片，采用热电Nicolet Is5型红外光谱仪(美国)表征样品骨架结构，判断YMS负载DOX是否成功。

  取少量干燥好的YMS和YMS-DOX研磨成粉末，借助理学Rigaku Ultima Ⅳ型X射线衍射仪(XRD，日本)测定样品结构，采用Cu靶Kα射线(λ= 0.154 18 nm)，管电压40 kV，管电流40 mA，扫描步长0.02°，扫描范围10°~80°。

  1.5   YMS-DOX纳米药物体外释药

  称取4份1.0 mg YMS-DOX纳米药物，分别加入1.0 mL pH为4.5、5.5、6.5和7.4的PBS，超声分散0.5 h后，移入透析袋中，两端封口，随后将透析袋置于分别装有9.0 mL相对应的PBS的50.0 mL离心管中，避光置于恒温振荡仪中孵育(温度37.0 ℃，转速150.0 r·min^-1)。按照设定的不同时间间隔从离心管中取出2.0 mL透析液，按照文献方法^[33]测定DOX负载量，待测定结束后，再将2.0 mL透析液转移回离心管中，重复上述操作，待48.0 h后，计算并绘制药物释放累积曲线。

  1.6   YMS-DOX细胞毒性和凋亡测试

  将处于对数生长期的MM-231和DC细胞按每孔5.0×10³个细胞分别接种于96孔板中，待细胞完全贴壁后，分别加入含不同质量浓度的YMS、YMS-DOX和DOX的培养液继续孵育培养，每组以未处理的细胞作为空白对照，分别培养24、48、72、96 h后，采用MTT法，测试细胞存活率^[35]。

  将处于对数生长期的MM-231细胞以每盘2.0×10⁵个细胞分别接种于35.0 mm培养皿中，孵育过夜。待细胞贴壁后，分别加入含YMS(25.1 μg·mL^-1)、YMS-DOX(25.1 μg·mL^-1，等量于5.0 μg·mL^-1 DOX)和DOX(5.0 μg·mL^-1)的培养液继续孵育72 h。待孵育结束，用0.25%胰酶消化，离心(1 000 r·min^-1) 5.0 min，收集细胞，加入凋亡检测试剂，随后借助流式细胞仪测定^[36]。

  2.   结果与讨论

  2.1   YMS-DOX的制备及DOX负载量测定

  为设计和开发出高负载、低毒副作用、高疗效以及低成本的分子筛药物输送体系，我们以pH=9.0的缓冲溶液作为反应介质，将YMS与DOX混合，通过物理吸附作用制备得到高负载纳米药物体系(图 2)。由于DOX的pK_a=8.3，反应介质的pH=9.0，DOX的氨基在反应介质中以—NH₂形式存在，而YMS表面有—OH，DOX分子中的—NH₂与YMS分子表面的—OH可通过范德华力和氢键相结合^[34]，即得到YMS-DOX纳米药物。

  图 2

  

  图 2.  YMS-DOX用于肿瘤药物输送示意图

  Figure 2.  Scheme of YMS-DOX nanomedicine for drug delivery

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  DOX负载量的测定通过UV-Vis吸收光谱法进行。首先通过标准曲线得到DOX的吸光度(A)与其浓度(c)的关系。图 3A为DOX的UV-Vis谱图，图 3B为DOX标准曲线。由图可知，DOX在0~60 μg·mL^-1范围内的吸光度与浓度有很好的线性关系，线性回归方程为A=0.013 08c+0.027 61，R²=0.994 1。利用该标准曲线，可以计算得到在pH=9.0时YMS对DOX的负载量。

  图 3

  

  图 3.  DOX在缓冲液中的UV-Vis谱图(A)和标准曲线(B)

  Figure 3.  UV-Vis spectra (A) and standard curve (B) of DOX in buffer solution

  pH=9.0

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  之后，我们探究了pH对DOX负载量(根据ε_DOX计算)的影响(图 4A和4B)。由图可知，在pH=3~12范围内，DOX的负载量随pH增大呈现出先增大后减小的趋势，当pH=9.0时，DOX负载量达到最大。由于DOX的摩尔吸光系数在不同介质中有细微的差别，当确定了最佳pH后，为了排除此细微影响，使pH=9.0的最佳条件下DOX的负载量数据更加准确，我们利用标准曲线计算pH=9.0条件下，不同时间和加入量对负载量的影响。如图 4C和4D所示，DOX负载量随时间延长而增加，20.0 h后负载量达到最大，该吸附动力学可较好地拟合为假一级动力学，速率常数为0.122 h^-1。图 4E和4F显示了DOX加入量对DOX负载量的影响。由图可知，pH=9.0时，DOX负载量随DOX加入量增加而增加，且呈现出很好的线性关系(Y=0.993 5c+0.436 9，R²=0.999 9)。当DOX加入量为200 μg时，YMS负载DOX量为(199.22±1.98) μg·mg^-1，DOX负载率可高达99.61%。

  图 4

  

  图 4.  pH对YMS负载DOX的影响(A、B); pH=9时, 时间(C、D)及DOX加入量(E、F)对YMS负载DOX的影响

  Figure 4.  Effect of pH on YMS loading DOX (A, B); Time (C, D) and the amount of added DOX (E, F) on YMS loading DOX when pH=9

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  2.2   YMS-DOX的表征

  利用XRD对YMS和YMS-DOX进行表征，结果如图 5A所示。图中位于10.35°、15.81°、20.43°、23.85°、27.21°、31.39°、32.47°的衍射峰与文献报道一致^[31]，表明所制备的YMS纯度较好。在负载DOX后(图 5B)，上述位置的衍射峰依然存在，说明YMS的立方结构没有发生大的改变；然而，衍射峰的锐度略有下降，表明与纯YMS相比，负载DOX后YMS的结晶度有所降低。

  图 5

  

  图 5.  YMS (A)和YMS-DOX (B)的XRD图

  Figure 5.  XRD patterns of YMS (A) and YMS-DOX (B)

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  此外利用TEM对YMS和YMS-DOX的形貌进行了观察(图 6)，由图可看到，YMS在吸附DOX之前，呈现出清晰的孔道，在吸附DOX之后，孔道模糊，表面出现黑点，表明YMS-DOX纳米药物成功制备。

  图 6

  

  图 6.  YMS和YMS-DOX的TEM图

  Figure 6.  TEM images of YMS and YMS-DOX

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  此外，通过马尔文粒度仪分别测定了YMS和YMS-DOX的粒径大小和ζ电位，结果见图 7。我们发现与YMS粒径相比，YMS-DOX粒径增大到了约500.0 nm，这可能是由于DOX在碱性条件下会发生自聚集形成DOX纳米颗粒，附着于YMS表面，使其粒径发生一个大的改变。YMS负载DOX前后的ζ电位分别为(-33.2±0.23) mV和(-29.5±0.12) mV，这可能是由于DOX与YMS发生静电引力作用，消耗了YMS表面羟基，所以表面电位增大，上述结论表明DOX成功负载在YMS表面。

  图 7

  

  图 7.  YMS (A)和YMS-DOX (B)的粒径; YMS和YMS-DOX的ζ电位(C)

  Figure 7.  Particle sizes of YMS (A) and YMS-DOX (B); ζ potentials of YMS and YMS-DOX (C)

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  YMS、DOX和YMS-DOX的UV-Vis谱图如图 8A所示。YMS-DOX在480 nm处有一个小的DOX特征峰，证实了YMS-DOX成功制备。图 8B是YMS-DOX的红外光谱图，其中3 456 cm^-1处为—OH的伸缩振动峰，1 487 cm^-1处为—NH₂的伸缩振动峰，1 471 cm^-1处出现了DOX的特征伸缩振动峰，由此说明DOX已经成功负载在YMS上。三者的荧光光谱如图 8C所示，游离的DOX荧光强度很大，但是负载到YMS上之后，YMS-DOX的荧光强度减弱，这是荧光共振能量转移造成的，这也证实了YMS-DOX的成功制备。

  图 8

  

  图 8.  YMS、DOX和YMS-DOX的UV-Vis (A)、红外(B)和荧光(C)谱图

  Figure 8.  UV-Vis (A), FT-IR (B), and fluorescence (C) spectra of YMS, DOX, and YMS-DOX

  DIW: deionized water

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  2.3   YMS-DOX的体外释药

  为了验证YMS-DOX药物释放是否也受pH调控，采用体外透析法研究了其药物释放行为，结果如图 9所示。由图可知，经过48.0 h后，YMS-DOX在pH=7.4(模拟生理环境)时药物释放率约为12.0%，而随着酸性逐渐增强，DOX释放量逐渐增加，且先呈现出一个药物快速释放过程，随后进入缓释状态，拟合得出释放速率常数k_d为0.134 h^-1，半衰期t_1/2为5.2 h，而游离DOX的t_1/2为0.37 h，前者约为后者的14倍，表明YMS-DOX具有较好的药物缓释特性。此外在pH=4.5的酸性环境中(模拟肿瘤细胞内环境)，药物释放率达到约46.0%，是pH=7.4条件下的3.8倍，这是由于在肿瘤酸性环境中，范德华力作用和氢键可被H⁺破坏，从而使YMS高效大量释放DOX。上述结果表明，与游离DOX相比，YMS-DOX可显著降低对正常组织的毒副作用。

  图 9

  

  图 9.  YMS-DOX纳米药物的体外药物释放曲线

  Figure 9.  In vitro drug release curves of YMS-DOX nanomedicine

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  2.4   YMS-DOX的细胞毒性及凋亡测试

  通过MTT法测试细胞毒性，探究不同时间、不同浓度下YMS-DOX作用于MM-231和DC细胞，对各自细胞杀伤率的影响，如图 10所示。可以看出，随着作用时间和浓度的增加，YMS-DOX对MM-231的杀伤率逐渐上升。当浓度为2.8 μg·mL^-1时，杀伤率最强。如图 11所示，相比于DOX，YMS-DOX对DC细胞的细胞杀伤率有所下降，说明YMS-DOX可降低DOX对正常细胞的杀伤力。

  图 10

  

  图 10.  YMS (A)、YMS-DOX (B)和DOX (C)对MM-231细胞的MTT毒性测试

  Figure 10.  Effects of YMS (A), YMS-DOX (B), and DOX (C) on MM-231 cells viability by MTT assay

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  图 11

  

  图 11.  YMS (A)、YMS-DOX (B)和DOX (C)对DC细胞的MTT毒性测试

  Figure 11.  Effects of YMS (A), YMS-DOX (B), and DOX (C) on DC cells viability by MTT assay

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  通过流式细胞术进行细胞凋亡检测，如图 12所示。图 12A为纳米载体YMS对细胞凋亡的影响，结果发现并未引起细胞显著凋亡，与空白细胞组(图 12D)大致相同，表明YMS具有高生物兼容性；反观YMS-DOX(图 12B)和DOX(图 12C)均引起大量细胞凋亡，且主要诱导细胞晚期凋亡。图 12E为细胞凋亡柱状图，当孵育处理细胞时间为72.0 h时，YMS-DOX引起75.6% 的细胞凋亡，DOX为66.3%，这一现象表明YMS-DOX能有效提高DOX对肿瘤细胞的凋亡诱导作用，且具有缓释功效，从而提高肿瘤治疗功效。这一结论与细胞毒性测试相一致。

  图 12

  

  图 12.  (A) YMS、(B) YMS-DOX和(C) DOX对MM-231细胞的凋亡测试及(D) 作为对照组的未处理细胞; (E) 根据(A~D)的数据所作细胞凋亡柱状图

  Figure 12.  Cell apoptosis of MM-231 cells treated with (A) YMS, (B) YMS-DOX, and (C) DOX for 72.0 h, and (D) MM-231 cells untreated as control; (E) Cell apoptosis histogram for (A-D)

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  3.   结论

  借助氢键和范德华力等作用力，通过绿色简单的方法制备出pH调控的满足EPR效应的Y型分子筛高负载纳米药物。探究了pH、时间和DOX加入量对YMS负载DOX的影响，发现在pH=9.0，DOX加入量为0.2 mg且负载时间为20.0 h的最佳条件下，负载率可高达99.61%。体外药物释放研究发现，YMS-DOX可将DOX大量释放于肿瘤组织，而在正常组织中释药率低，暗示其可有效杀死肿瘤细胞。通过流式细胞术研究了YMS-DOX对MM-231细胞凋亡的影响，结果发现YMS-DOX可将药物缓慢释放于细胞内，进而诱导细胞凋亡，表明其具有良好的细胞杀伤力。综上，我们介绍了一种基于分子筛的肿瘤可激活药物传输体系，为高负载纳米药物体系的合成提供了新的设计思路和理论支持。

  
  
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  图 1  DOX的结构

  Figure 1  Structure of DOX

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  图 2  YMS-DOX用于肿瘤药物输送示意图

  Figure 2  Scheme of YMS-DOX nanomedicine for drug delivery

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  图 3  DOX在缓冲液中的UV-Vis谱图(A)和标准曲线(B)

  Figure 3  UV-Vis spectra (A) and standard curve (B) of DOX in buffer solution

  pH=9.0

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  图 4  pH对YMS负载DOX的影响(A、B); pH=9时, 时间(C、D)及DOX加入量(E、F)对YMS负载DOX的影响

  Figure 4  Effect of pH on YMS loading DOX (A, B); Time (C, D) and the amount of added DOX (E, F) on YMS loading DOX when pH=9

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  图 5  YMS (A)和YMS-DOX (B)的XRD图

  Figure 5  XRD patterns of YMS (A) and YMS-DOX (B)

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  图 6  YMS和YMS-DOX的TEM图

  Figure 6  TEM images of YMS and YMS-DOX

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  图 7  YMS (A)和YMS-DOX (B)的粒径; YMS和YMS-DOX的ζ电位(C)

  Figure 7  Particle sizes of YMS (A) and YMS-DOX (B); ζ potentials of YMS and YMS-DOX (C)

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  图 8  YMS、DOX和YMS-DOX的UV-Vis (A)、红外(B)和荧光(C)谱图

  Figure 8  UV-Vis (A), FT-IR (B), and fluorescence (C) spectra of YMS, DOX, and YMS-DOX

  DIW: deionized water

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  图 9  YMS-DOX纳米药物的体外药物释放曲线

  Figure 9  In vitro drug release curves of YMS-DOX nanomedicine

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  图 10  YMS (A)、YMS-DOX (B)和DOX (C)对MM-231细胞的MTT毒性测试

  Figure 10  Effects of YMS (A), YMS-DOX (B), and DOX (C) on MM-231 cells viability by MTT assay

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  图 11  YMS (A)、YMS-DOX (B)和DOX (C)对DC细胞的MTT毒性测试

  Figure 11  Effects of YMS (A), YMS-DOX (B), and DOX (C) on DC cells viability by MTT assay

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  图 12  (A) YMS、(B) YMS-DOX和(C) DOX对MM-231细胞的凋亡测试及(D) 作为对照组的未处理细胞; (E) 根据(A~D)的数据所作细胞凋亡柱状图

  Figure 12  Cell apoptosis of MM-231 cells treated with (A) YMS, (B) YMS-DOX, and (C) DOX for 72.0 h, and (D) MM-231 cells untreated as control; (E) Cell apoptosis histogram for (A-D)

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