盐酸氯丙嗪对八肋游仆虫中心蛋白C端功能的抑制

董倩 叶旭文 杨静 王文明 赵亚琴 杨斌盛

引用本文: 董倩, 叶旭文, 杨静, 王文明, 赵亚琴, 杨斌盛. 盐酸氯丙嗪对八肋游仆虫中心蛋白C端功能的抑制[J]. 无机化学学报, 2021, 37(1): 23-32. doi: 10.11862/CJIC.2021.019 shu
Citation:  DONG Qian, YE Xu-Wen, YANG Jing, WANG Wen-Ming, ZHAO Ya-Qin, YANG Bin-Sheng. Inhibition of Functions for C-Terminal Domain of Euplotes Octocarinatus Centrin by Chlorpromazine Hydrochloride[J]. Chinese Journal of Inorganic Chemistry, 2021, 37(1): 23-32. doi: 10.11862/CJIC.2021.019 shu

盐酸氯丙嗪对八肋游仆虫中心蛋白C端功能的抑制

    通讯作者: 杨斌盛。E-mail:yangbs@sxu.edu.cn
  • 基金项目:

    国家自然科学基金(No.21571117)资助

摘要: 通过荧光光谱分析、等温滴定量热(ITC)、圆二色谱(CD)、电泳等技术研究了盐酸氯丙嗪(CPZ)和八肋游仆虫中心蛋白C端(apoC-EoCen)的结合以及CPZ对蛋白功能的影响。结果表明,在室温下10 mmol·L-1 Hepes溶液(pH=7.4)中,CPZ与apoC-EoCen以物质的量之比为1:1结合,条件结合常数约为104L·mol-1。CPZ的结合导致蛋白质的二级结构发生改变,α螺旋含量减小;对金属离子诱导中心蛋白的聚集产生了抑制作用,Tb3+敏化荧光强度也降低;阻碍了中心蛋白与着色性病干皮病C组蛋白(XPC)的结合;且影响了apoC-EoCen类核酸酶活性,导致蛋白对pBR322 DNA的切割能力下降;抑制了蛋白质的磷酸化。综合实验结果表明盐酸氯丙嗪是中心蛋白的生物功能阻断剂,对中心蛋白的功能具有良好的调控作用。

English

  • 中心蛋白是首次在单细胞绿藻中发现的一种高度保守的钙离子结合蛋白,属于钙调蛋白家族[1]。它广泛存在于真核生物中,如酵母[2]、无脊椎动物[3]、高等植物[4]、哺乳动物[5]等,是很多生物的中心体重要组成部分,在细胞分裂过程中起着重要作用。中心蛋白含有4个EF-手结构域,每个EF-手结构域可以结合一个钙离子。当蛋白结合钙离子后,蛋白构象变得更加开放,疏水区暴露,有利于蛋白和靶肽之间的结合[6]。Tb3+具有与Ca3+相似的配位化学性质,但是其与蛋白质结合后出现明显的荧光敏化。因此常常被用作Ca3+结合蛋白的离子探针[7]

    八肋游仆虫中心蛋白由168个氨基酸残基组成,其分子量约为20 kD。本实验室使用Tb3+荧光探针、蛋白质片段等多种方法研究表明,生理条件下每个蛋白质分子可结合4个Ca3+,Tb3+与Ca3+占据相同的结合位点,Ⅲ、Ⅳ位点属于蛋白和金属离子结合的高亲和位点;蛋白与金属离子结合后使得蛋白质从封闭状态到开放状态,从而导致疏水表面暴露,蛋白质聚集;八肋游仆虫中心蛋白的N端在金属离子介导的聚集过程中扮演了重要的角色[8],而与靶肽的结合完全发生于C端[9];中心蛋白还可以参与核苷酸切除修复[10]

    盐酸氯丙嗪(CPZ)是一种吩噻嗪类临床药物[11],其分子结构如图 1所示。它主要作为抗组胺药和安定剂使用,是一种具有多种作用的通用型抗精神病药。其一个重要特征是可以在不损伤人的大脑意识的情况下控制过度兴奋和狂躁,改变精神病患者的异常行为。小剂量的CPZ也可以缓解呕吐, 对于镇定、降温和抗休克效果明显。此外,在生物医学研究中CPZ常被用作为钙调蛋白抑制剂[12],可以与钙调蛋白结合,从而抑制钙调蛋白的功能。本实验室曾报道另一种吩噻嗪类临床药物——三氟拉嗪与八肋游仆虫中心蛋白N端半分子的结合及对蛋白质功能的影响[13]。本文报道CPZ与八肋游仆虫中心蛋白C端半分子的结合及对蛋白质功能的影响,深入了解其在分子水平上的相互作用,有助于理解药物结合的热力学和机制,可以为医学研究做出一定的贡献。

    图 1

    图 1.  盐酸氯丙嗪的结构
    Figure 1.  Structure of chlorpromazine

    GST亲和层析柱材料(Glutathione SepharoseTM 4 Fast Flow)来自GE Healthcare,N-2-羟乙基哌嗪-N'-乙磺酸(Hepes分析纯)、CPZ均来自Sigma公司,氯化钾(>99%)、Tris(>99.9%)、甘氨酸(>99.5%)、Acrylamide (>99.9%)、NNN',N'-四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸钠(SDS)、bis-acrylamide(纯度大于99.0%)均来自上海生工,乙二胺四乙酸钠(EDTA)来自索莱宝,过硫酸铵(分析纯)来自北京化工厂。

    所用仪器有:Eppendorf移液枪、THZ-C摇床(江苏太仓实验设备厂)、KS-600超声波粉碎机(宁波仪器厂)、TGL-16台式高速冷冻离心机(湖南仪器总厂)、F-2700型荧光光谱仪(日本Hitachi公司)、F-2700型荧光分光光度计(日本Hitachi公司)、Chirascan圆二色光谱仪(Applied Photophysics有限公司)、Mal- vern ITC200等温滴定微量热仪、Cary Varian Eclipse紫外分光光谱仪、METTLER TOLEDO Five easy plus pH计、DYCZ-24DN型迷你双垂直电泳和DYY-10C型双稳时电泳仪(北京市六一仪器厂)。

    1.2.1   储备液的配制

    Tb3+储备液的配制参照文献[14]进行。

    CPZ溶液的配制:准确称取0.177 7 g的CPZ加入1 mL的Hepes溶液(10 mmol·L-1,pH=7.4)中,搅拌均匀至溶解,配制成0.5 mmol·L-1的CPZ溶液,避光保存备用。

    pBR322 DNA储备液的配制:在无菌环境下用移液枪取一定量的pBR322 DNA(浓度为0.5 μg· μL-1),用无菌水稀释至所需浓度,并将其分装储备于-20 ℃下。

    1.2.2   荧光光谱分析

    CPZ和apoC-EoCen作用的荧光通过荧光光谱仪测定[15]。隔3 min扫描1次,记录保存相关数据。同样可以测定Tb3+的敏化荧光光谱。

    1.2.3   等温滴定量热分析

    apoC-EoCen与CPZ结合的热力学常数通过等温量热分析得到,实验在30 ℃下进行[16]。apoC- EoCen浓度为0.08 mmol·L-1,CPZ浓度为4 mmol· L-1,分别将其置于样品池及注射器中。

    1.2.4   CD色谱的测定

    通过Biologic Mos型CD光谱仪测定圆二色光谱(CD),扫描范围为190~260 nm,样品均溶解于Hepes缓冲溶液(10 mmol·L-1,pH=7.4)中[17]。所有实验均在室温下进行,扫描3次取平均值,扣除稀释效应。

    1.2.5   共振光散射测定

    共振光散射(RLS)通过扫描同步荧光光谱实现。设定激发波长为250 nm,扫描范围为250~600 nm,电压为400 V, 激发和发射狭缝均为10 nm。取1 mL apoC-EoCen和不同浓度的CPZ混合溶液于1 cm的比色皿中,apoC-EoCen浓度为10 μmol·L-1,然后加入1 mmol·L-1的Tb3+,每次加2 μL,隔3 min扫描1次,最终结果为3次扫描结果的平均值。

    1.2.6   apoC-EoCen的磷酸化修饰

    将apoC-EoCen(0.1 mmol·L-1)、蛋白激酶A (protein kinase A,PKA,0.1 mmol·L-1)、Mg2+ (0.132 mol·L-1)、ATPNa2(1.01 mmol·L-1)均溶解于Hepes缓冲溶液(10 mmol·L-1,pH=7.4)中,分别加入0、5、10、30、50倍的CPZ,置于恒温水浴(30 ℃)反应10 h,得到磷酸化蛋白(P-apoC-EoCen)。利用PD-10脱盐柱将多余的金属离子和ATP等洗脱。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测蛋白的电迁移率[18]

    1.2.7   聚丙烯酰胺凝胶电泳

    将提前制备好的apoC-EoCen和XPC混合样品放置于4 ℃过夜反应,apoC-EoCen的电迁移率在室温下用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,电泳时间约3 h完成,用考马斯亮蓝R-250染色, 然后用乙醇或冰乙酸脱色后在紫外可见透射反射仪中观察。

    1.2.8   琼脂糖凝胶电泳分析

    pBR322 DNA、apoC-EoCen和CPZ按一定比例混合,在4 ℃反应约3 h,通过琼脂糖凝胶电泳实验研究apoC-EoCen、CPZ和pBR322 DNA三者之间的相互作用。实验结果置于紫外可见透射反射仪下进行观察[13]

    1.2.9   分子对接

    apoC-HsCen 2与apoC-EoCen的序列同源性高达71.8%,与钙调蛋白的同源性也在50%以上[19]。如此高的同源性使得它们之间的生物功能基本相似,因此我们选择apoC-HsCen 2(PDB:2GGM)的结构作为模板, 利用自动对接软件Discovery Studio 3.0 (DS)对小分子CPZ与C端半分子之间的结合位点和结合模式进行模拟,找到最优结合位点,即能量最低位点[20]。这种研究方法的优点在于在实验基础上可以直观地看到两者之间的结合状态。

    2.1.1   荧光光谱

    图 2A是在pH=7.4、10 mmol·L-1 Hepes缓冲条件下,用CPZ滴定apoC-EoCen的荧光光谱。从图 2A可以看出,308 nm处是apoC-EoCen的最大荧光发射峰。随着CPZ滴加到apoC-EoCen溶液中,可以看到位于308 nm处的C端半分子蛋白荧光强度逐渐下降,而在355和452 nm处出现了CPZ的2个特征荧光峰,并在335 nm处出现了等荧光点。表明CPZ与apoC-EoCen结合生成了复合物。

    图 2

    图 2.  (A) CPZ (2.5 mmol·L-1)的加入对apoC-EoCen(10 μmol·L-1, 1 mL)荧光光谱的影响; (B)随cCPZ/capoC-EoCen变化的荧光强度(308 nm)滴定曲线, 以及CPZ滴定apoC-EoCen的拟合曲线
    Figure 2.  (A) Fluorescence spectra produced by addition of CPZ (2.5 mmol·L-1) to 1 mL apoC-EoCen (10 μmol·L-1); (B) Titration curve of fluorescent intensity at 308 nm against concentration ratio of CPZ and apoC-EoCen

    Concentration of CPZ from a to u was 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 μmol·L-1, respectively; All experiments were carried out in 10 mmol·L-1 Hepes buffer (pH=7.4); Inset: plot of lg[(F0-F)/(F-F)] vs lg cCPZ, f and fitting curve

    将apoC-EoCen在308 nm处的荧光强度对cCPZ/ capoC-EoCen作图,得到图 2B。从图 2B可以看出,apoC- EoCen在308 nm处的荧光强度随着cCPZ/capoC-EoCen的增大而逐渐减小。利用CPZ与apoC-EoCen反应形成apoC-EoCen-CPZ复合物的平衡方程,可将荧光强度与反应表观结合常数、结合位点数建立式1所示方程:

    $ \lg \left[ {\left( {{F_0} - F} \right)/\left( {F - {F_\infty }} \right)} \right]n\lg {c_{{\rm{CPZ, f}}}} + \lg K $

    (1)

    其中F0为apoC-EoCen在308 nm处的初始荧光强度;F为任一滴定点的荧光强度;F为CPZ与apoC- EoCen完全结合后apoC-EoCen在308 nm处的荧光强度;K为CPZ与apoC-EoCen结合的条件结合常数;n为apoC-EoCen的CPZ结合位点数;cCPZ, f为任一滴定点时CPZ的游离浓度。根据文献[21],使用CPZ的总浓度代替CPZ的游离浓度,由式1用lg[(F0-F)/(F-F)]对lg cCPZ, f作图可得近似的Kn(图 2BInset)。CPZ与apoC-EoCen的结合比为1:1,结合常数为(1.91±0.04)×104 L·mol-1 (Supporting information)。

    2.1.2   等温滴定量热分析

    为了进一步研究CPZ和apoC-EoCen之间的相互作用,我们选用等温量热滴定进行分析。图 3为室温下在Hepes缓冲溶液(10 mmol·L-1,pH=7.4)中CPZ滴定apoC-EoCen的等温量热滴定曲线。通过单位点结合模型拟合,获得结合常数为(1.12±0.15)× 104 L·mol-1,apoC-EoCen有1个CPZ的结合位点,与前面的荧光滴定结果一致。热力学参数列于表 1,可以看出熵是正数、焓是负数、吉布斯自由能是负数,表明CPZ和apoC-EoCen反应的过程是焓熵共同驱动的自发放热反应,它们之间反应的主要作用力是静电作用[22]

    图 3

    图 3.  25 ℃下CPZ (3 mmol·L-1)对apoC-EoCen (0.08 mmol·L-1)的等温量热滴定曲线
    Figure 3.  Calorimetric titration curve of CPZ (3 mmol·L-1) to apoC-EoCen (0.08 mmol·L-1) at 25 ℃

    表 1

    表 1  25 ℃下通过ITC和荧光光谱测量CPZ与apoC-EoCen结合的热力学数据
    Table 1.  Thermodynamics data of CPZ binding with apoC-EoCen measured by ITC and fluorescence spectrometry at 25 ℃
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    Method K / (L·mol-1) n ΔS / (J·mol-1) ΔH / (kJ·mol-1) ΔG / (kJ·mol-1)
    ITC (1.12±0.15)×104 1 55.2 -6.77±0.81 -23.51
    Fluorescence (1.91±0.04)×104 0.9
    2.1.3   CD光谱分析

    在室温、pH=7.4、10 mmol·L-1 Hepes缓冲溶液下测得的apoC-EoCen和apoC-EoCen-CPZ复合物的远紫外圆二色谱如图 4所示。由图 4可见,apoC-EoCen的CD光谱在208和222 nm附近出现了2个负吸收峰,这是中心蛋白由α螺旋结构组成的2个特征峰。加入10倍的CPZ并形成apoC-EoCen-CPZ复合物后,2个峰的负吸收减少,中心蛋白的α螺旋含量降低了约40%,说明钙调蛋白抑制剂CPZ的结合,对中心蛋白的二级结构产生了影响,导致α螺旋部分解旋,椭圆率降低。

    图 4

    图 4.  apoC-EoCen和apoC-EoCen-CPZ复合物在水中的远紫外CD光谱
    Figure 4.  Far-UV CD spectra of apoC-EoCen and apoC- EoCen-CPZ complex in aqueous solution

    Condition: 10 mmol·L-1 Hepes buffer, pH=7.4, 25 ℃; Ratio of CPZ added to apoC-EoCen (25 μmol·L-1): 0 (a), 10 (b)

    2.1.4   CPZ与apoC-EoCen之间的福斯特共振能量转移及分子模拟

    根据福斯特非辐射能量转移理论[23],能量供体和受体发生能量转移的条件有2个:一是供体的荧光发射光谱和受体的紫外吸收光谱存在着一定的重叠;二是供体和受体之间的距离r < 7 nm,二者不可缺一。图 5A为室温下在290~355 nm范围内供体apoC-EoCen的荧光发射光谱和受体CPZ的紫外吸收光谱的光谱重叠。由此计算得到光谱重叠积分J为2.69×10-15 cm6,已知K2=2/3,n=1.336,Φ=0.14[24],由此得到福斯特临界能量转移距离R0为2 nm,能量转移效率E=0.91,进一步计算得到能量供体apoC- EoCen的168位酪氨酸残基和受体CPZ之间的距离r为1.36 nm (Supporting information)。0.5R0 < r < 1.5R0,证明蛋白供体和CPZ之间发生了无辐射能量转移。

    图 5

    图 5.  (A) apoC-EoCen荧光光谱(a)和CPZ吸收光谱的重叠(b); (B) apoC-EoCen和CPZ的分子对接图
    Figure 5.  (A) Overlap of apoC-EoCen fluorescence spectrum (a) and CPZ absorption spectrum (b); (B) Molecular docking between apoC-EoCen and CPZ

    Cartoon ribbon model structure of apoC-EoCen; Black dotted line represents the distance between Tyr and CPZ; green: apoC-EoCen, yellow: CPZ, purple: Tyr

    在实验测定的基础上,通过自动对接软件Dis- covery Studio 3.0可以更加直观地看到CPZ与apoC- EoCen之间的结合位点以及结合模式。图 5B是最小结合能为-36.88 kJ·mol-1时对应的结构。如图 5B所示,CPZ的吩噻嗪环和第4个EF-hand结构域的F螺旋上的168位酪氨酸残基芳环之间的距离是1.38 nm,与福斯特能量转移得到的结果吻合。仔细分析CPZ与apoC-EoCen之间结合的驱动力可知其分为2种:(1)静电作用,质子化的吩噻嗪与去质子化的E144间的作用。(2)疏水作用,CPZ与F109、L122、M141、I142、F145、I153、I161、T165、M162、S166间的作用。除F109和L122分别位于第3个EF-hand结构域的E和Fα-螺旋之外,其它10个氨基酸残基均位于第4个EF-hand结构域,其中9个氨基酸残基分别位于第4个EF-hand结构域的E和Fα-螺旋,I153是唯一位于loop区的氨基酸残基。

    2.2.1   对Tb3+结合的影响

    八肋游仆虫中心蛋白不含色氨酸残基,含有4个酪氨酸残基Y46、Y72、Y79和Y168,分别位于第Ⅰ、Ⅱ结构域和蛋白质的末端。因此,当Tb3+与蛋白质结合时,占据Ⅲ和Ⅳ结合位点(高亲和位点)的Tb3+出现弱荧光敏化,而占据Ⅰ和Ⅱ结合位点(低亲和位点)的Tb3+出现强荧光敏化[25]。由此得出八肋游仆虫中心蛋白的4个金属离子结合部位是不等价的,结合顺序为Ⅳ≈Ⅲ>Ⅰ、Ⅱ[26]。C端半分子的酪氨酸残基只有1个,当用Tb3+滴定时仍可观测到在490、545、590和620 nm附近出现的Tb3+特征峰(图 6A)。可见,随着Tb3+的不断加入,其在490、545、590和620 nm处的特征峰荧光强度逐渐增大,直至不变。这表明Tb3+与apoC-EoCen结合后发生了Y168残基与结合Tb3+间的非辐射能量转移。将545 nm处的荧光强度对cTb3+/capoC-EoCen作图(图 6C曲线a),可以看出,cTb3+/capoC-EoCen < 1.0时,Tb3+在545 nm处荧光强度随着cTb3+/capoC-EoCen的增加而线性地增加;在cTb3++/capoC-EoCen为1.0~2.0范围内,尽管Tb3+在545 nm处荧光强度仍随着cTb3+/capoC-EoCen的增加而线性地增加,但增加幅度明显减少;当cTb3+/capoC-EoCen>2.0时,Tb3+在545 nm处荧光强度不再随着cTb3+/capoC-EoCen的增加而增加。表明Tb3+和apoC-EoCen以2:1的结合比结合。在Ⅲ和Ⅳ结构域分别引入色氨酸残基的研究表明,Tb3+优先占据蛋白质的第Ⅳ结合位点[27],即结合于第Ⅳ结合位点的Tb3+出现强荧光敏化,而结合于第Ⅲ结合位点的Tb3+出现弱荧光敏化。图 6B是在10倍CPZ存在的条件下,用Tb3+滴定apoC-EoCen的荧光光谱。同样将545 nm处的荧光强度对cTb3+/capoC-EoCen作图(图 6C曲线b)。由该曲线可得,当cTb3++/capoC-EoCen < 1.0时,Tb3+在545 nm处荧光强度随着cTb3+/capoC-EoCen的增加而线性地增加;当cTb3+/capoC-EoCen>1.0时,Tb3+在545 nm处荧光强度不再随着cTb3+/capoC-EoCen的增加而增加。表明Tb3+和apoC-EoCen-CPZ以1:1的结合比结合,即CPZ与apoC-EoCen的结合导致Tb3+的1个结合部位被破坏。由图 6C曲线b的斜率及图 5B分子对接的CPZ作用部位可推断,CPZ与apoC-EoCen的结合导致其第Ⅳ结合部位丧失Tb3+结合能力。

    图 6

    图 6.  在CPZ不存在(A)和存在(B)的情况下Tb3+敏化的荧光光谱; (C)在CPZ不存在(a)和存在(b)的情况下, Tb3+在545 nm处的荧光强度与cTb3+/capoC-EoCen的关系; (D) Tb2-apoC-EoCen和Tb-apoC-EoCen-CPZ的远紫外CD光谱
    Figure 6.  Tb3+ sensitized fluorescence spectra in the absence (A) and presence (B) of CPZ; (C) Fluorescence intensity of Tb3+ at 545 nm as a function of cTb3+/capoC-EoCen in the absence (a) and presence (b) of CPZ; (D) Far-UV CD spectra of Tb 2-apoC-EoCen and Tb-apoC-EoCen-CPZ

    Condition: (A) Titrating apoC-EoCen with 1 mmol·L-1 Tb3+, the protein concentration was 10 μmol·L-1, from a to h, the ratios of Tb3+ added to apoC-EoCen were 0, 0.33, 0.66, 1, 1.33, 1.66, 2, 2.33, respectively; (B) cCPZ/capoC-EoCen=10, the experiment condition was the same as A; (C) Fluorescence intensity selected at 545 nm in Fig.A as curve a, and fluorescence intensity at 545 nm in Fig.B as curve b; (D) Ratios of CPZ added to Tb 2-apoC-EoCen were 0 (a), 10 (b), respectively, capoC-EoCen=25 μmol·L-1

    根据式1拟合图 6C的Tb3+荧光敏化数据可得,在10 mmol·L-1 Hepes、pH=7.4的条件下,Tb3+与apoC -EoCen的结合位点数n为2.04±0.25,条件结合常数K为1.70×1016 L2·mol-2;而Tb3+与apoC-EoCen-CPZ的结合位点数n为1.09±0.06,条件结合常数K为2.00× 108 L·mol-1 (Supporting information),与Ⅲ和Ⅳ结构域分别引入色氨酸残基后所测得的结合常数吻合[28]

    图 6D是10 mmol·L-1 Hepes、pH=7.4条件下Tb2- apoC-EoCen和Tb-apoC-EoCen-CPZ的CD光谱。可以看出,在10倍CPZ的存在下,位于208和220 nm处蛋白质的2个负吸收峰减少近40%,即CPZ的结合使蛋白质的分子结构发生改变,α螺旋含量降低。

    2.2.2   CPZ对apoC-EoCen聚集的影响

    中心蛋白的生物功能之一是金属离子结合诱导的蛋白质聚集[29]。尽管其聚集驱动力主要集中在N端,但是C端也有一定的聚集能力[30]图 7A是在室温、pH=7.4、10 mmol·L-1 Hepes缓冲溶液时,用Tb3+滴定apoC-EoCen的RLS光谱。可见,随着Tb3+的不断加入,280 nm处的RLS强度逐渐增强。增大到某一点时,基本保持稳定。将280 nm处的RLS强度对cTb3+/capoC-EoCen作图(图 7B曲线a),可以发现类似于图 6的Tb3+敏化荧光滴定,Tb3+和apoC-EoCen以2: 1的结合比结合。由Tb3+滴定apoC-EoCen-CPZ的RLS光谱可得其滴定曲线如图 7B曲线b所示,即Tb3+与apoC-EoCen-CPZ的结合比为1:1。根据式1拟合图 7B的Tb3+诱导RLS数据可得,在10 mmol·L-1 Hepes、pH=7.4的条件下,Tb3+与apoC-EoCen的结合位点数n为1.95±0.10,条件结合常数K为1.15×1016 L2·mol-2;而Tb3+与apoC-EoCen-CPZ的结合位点数n为1.00±0.06,条件结合常数K为2.14×108 L·mol-1 (Supporting information),与Tb3+敏化荧光所得结果一致。

    图 7

    图 7.  (A) Tb3+滴定apoC-EoCen的RLS光谱; (B)在CPZ比例不同(cCPZ/capoC-EoCen=0 (a), 10 (b))的情况下, RLS光谱在280 nm处的强度与cTb3+/capoC-EoCen的关系
    Figure 7.  (A) RLS spectra of apoC-EoCen titrated with Tb3+; (B) RLS intensity at 280 nm as a function of cTb3+/capoC-EoCen in the presence of different proportions of CPZ: cCPZ/capoC-EoCen=0 (a), 10 (b)

    apoC-EoCen concentration was 10 μmol·L-1; apoC-EoCen was titrated with 1 mmol·L-1 Tb3+, and the experiments were performed in Hepes (10 mmol·L-1, pH=7.4); from a to h, the ratios of Tb3+ added to apoC-EoCen were 0, 0.33, 0.66, 1, 1.33, 1.66, 2, 2.33, respectively

    2.2.3   CPZ对apoC-EoCen类核酸酶活性的抑制
    2.2.3.1   apoC-EoCen的类核酸酶活性

    pBR322 DNA质粒是一种超螺旋型(Ⅰ)核酸大分子,能够被一些具有切割活性的小分子、蛋白等切割成切口型(Ⅱ)以及线型(Ⅲ)。它们具有不同的迁移速率,其大小顺序一般为超螺旋型>线型>缺刻型。图 8A为不同浓度的apoC-EoCen对pBR322 DNA切割的凝胶电泳图。1~10号泳道为pBR322 DNA,2~ 10号泳道为分别加入2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25 μmol·L-1 apoC-EoCen后的pBR322 DNA。从图 8A中可以看出,最初DNA只有超螺旋一种形式,随着apoC-EoCen浓度的增大,线型和缺刻型条带逐渐变亮,而超螺旋DNA条带慢慢变暗,即DNA逐渐由超螺旋状态变为线型和缺刻型,直到超螺旋型完全消失。将图 8A中3种不同形式的DNA进行黑度扫描并对apoC-EoCen浓度作图得到图 8B。从图 8B可以看出,当apoC-EoCen终浓度为25 μmol·L-1时,pBR322 DNA完全由Ⅰ型转变为Ⅱ和Ⅲ型。即apoC -EoCen像apoN-EoCen[31]一样有类核酸酶活性。

    图 8

    图 8.  (A) apoC-EoCen切割pBR322 DNA的琼脂糖凝胶电泳图; (B)不同构型DNA的比例与apoC-EoCen浓度的关系
    Figure 8.  (A) Agarose gel electrophoresis for pBR322 DNA cutting with different concentrations of apoC-EoCen; (B) Relationship between proportion of different configurations pBR322 DNA and apoC-EoCen concentration

    10 mmol·L-1 Hepes, pH=7.4, 4 ℃ reaction for 3 h; lane 1: pBR322 DNA, lanes 2~10: 0.003 5 g·L-1 pBR322 DNA added with 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 17.5, 20 and 25 μmol·L-1 apoC-EoCen, respectively, Vtotal=10 μL

    2.2.3.2   不同浓度CPZ对apoC-EoCen类核酸酶活性的影响

    图 9A是不同浓度CPZ对apoC-EoCen类核酸酶活性的影响。其中1~10号泳道为相同浓度的pBR322 DNA,2~10号泳道为加入终浓度为25 μmol·L-1的apoC-EoCen,3~10号泳道为含有不同浓度CPZ的apoC-EoCen类核酸酶活性,cCPZ/capoC-EoCen分别为5、10、15、20、25、30、40、50。由图中可见,随着CPZ浓度的增大,线型和切口型pBR322 DNA条带逐渐由亮变暗,直到消失;而超螺旋型pBR322 DNA逐渐出现,其条带逐渐变亮。说明CPZ和apoC- EoCen的结合抑制了apoC-EoCen的类核酸酶活性,阻碍了其对pBR322 DNA的切割,使得pBR322 DNA保存为最初的超螺旋形式。将图 9A中3种不同形式的pBR322 DNA进行黑度扫描并对cCPZ/capoC-EoCen作图得到图 9B。从图 9B可以看出,开始蛋白将DNA切割成Ⅱ和Ⅲ型DNA,随着CPZ浓度的增大,Ⅱ和Ⅲ型DNA均逐渐减少,Ⅰ型DNA逐渐增加;当加入20倍的CPZ时,Ⅲ型DNA基本消失;当加入50倍CPZ时,仅剩下Ⅰ型DNA。

    图 9

    图 9.  (A) CPZ对apoC-EoCen裂解DNA影响的琼脂糖凝胶电泳图; (B)不同构型DNA的比例随cCPZ/capoC-EoCen变化的曲线
    Figure 9.  (A) Agarose gel electrophoresis for effect with different proportions of CPZ on apoC-EoCen cleavaging DNA; (B) Relationship between proportion of different configurations pBR322 DNA and cCPZ/capoC-EoCen

    10 mmol·L-1 Hepes, pH=7.4, at 4 ℃ for 3 h, total volume: 10 μL; Lane 1: pBR322 DNA, lanes 2~10: pBR322 DNA+apoC-EoCen, lanes 3~10: pBR322 DNA+apoC-EoCen+CPZ (cCPZ/capoC-EoCen)=5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, respectively; final pBR322 DNA concentration: 0.003 5 g·L-1

    2.2.4   CPZ对apoC-EoCen与靶肽结合的抑制

    XPC是以人着色性干皮病C组蛋白中覆盖中心蛋白结合序列的多肽,它参与许多细胞内生物分子反应。在pH=7.4、10 mmol·L-1 Hepes缓冲条件下,XPC和apoC-EoCen可形成1:1的复合物。图 10A是CPZ对apoC-EoCen-XPC复合物影响的天然凝胶电泳图。其中1号泳道为apoC-EoCen,2号泳道为apoC-EoCen-XPC,3~10号泳道是cCPZ/capoC-EoCen分别为5、10、20、30、40、50、100、200时的apoC-EoCen-XPC。由图 10A可见,随着CPZ浓度的增加,apoC-EoCen- XPC复合物逐渐减少,直到复合物全部消失,而apoC-EoCen条带逐渐从无到有。这表明CPZ的结合抑制了apoC-EoCen-XPC复合物的形成。将图 10A中蛋白及其复合物进行黑度扫描并对cCPZ/ capoC-EoCen作图(图 10B),其中曲线a为apoC-EoCen随CPZ浓度的变化,曲线b为apoC-EoCen-XPC随CPZ浓度的变化。从图 10B可以看出,随着CPZ浓度的增大,曲线a呈上升趋势,曲线b呈下降趋势,CPZ抑制了蛋白和XPC的结合,使得复合物含量逐渐下降。当加入50倍的CPZ时,apoC-EoCen和apoC- EoCen-XPC复合物含量基本各占一半。

    图 10

    图 10.  (A) 不同比例的CPZ加入apoC-EoCen和XPC中的天然凝胶电泳图; (B) apoC-EoCen (a)和apoC-EoCen-XPC (b)随cCPZ/capoC-EoCen的变化; (C)远紫外CD光谱中CPZ对apoC-EoCen与XPC复合物的影响(a: apoC-EoCen; b: apoC-EoCen-XPC复合物; c: apoC-EoCen-XPC与CPZ共存); (D) apoC-EoCen与XPC或CPZ结合的缎带模型
    Figure 10.  (A) Non-denaturing gel electrophoresis diagram for effect of adding CPZ with different proportions to apoC-EoCen combined with XPC; (B) apoC-EoCen (a) and apoC-EoCen-XPC (b) changes with cCPZ/capoC-EoCen; (C) Far-UV CD spectra for effect of CPZ on apoC-EoCen binding to XPC (a: apoC-EoCen; b: apoC-EoCen-XPC complex; c: apoC-EoCen-XPC combined with CPZ); (D) Cartoon ribbon model structure of apoC-EoCen combined with XPC and CPZ

    Condition: (A) 10 mmol·L-1 Hepes, pH=7.4, at 4 ℃ for 6 h, total volume=10 μL, protein concentration=200 μmol·L-1; (C) protein concentration=25 μmol·L-1, target peptide ratio=1:1, CPZ concentration=250, 750 μmol·L-1, total volume= 300 μL at 25 ℃; (D) apoC-EoCen (blue), XPC (purple), CPZ (green)

    中心蛋白C端结构域是其靶蛋白结合功能区,许多靶肽如蜂毒素[32]、XPC[33]在溶液中处于随机卷曲态,当与中心蛋白结合后便形成α-螺旋结构。图 10C谱线a是apoC-EoCen的远紫外CD光谱,可见在208和220 nm处出现蛋白质α-螺旋结构的特征峰;当apoC-EoCen与XPC结合形成apoC-EoCen-XPC复合物后,位于208和220nm处的2个特征负峰明显增大(谱线b),α-螺旋结构含量增加;CPZ与apoC- EoCen结合导致蛋白质α-螺旋结构含量减少;图 10C谱线c是apoC-EoCen-XPC中加入10倍CPZ后的远紫外CD光谱,可知apoC-EoCen的α螺旋含量减少约25%。这些结果表明CPZ的结合抑制了apoC-EoCen和XPC形成复合物。

    图 10D是apoC-EoCen和CPZ结合能量最低结构与apoC-EoCen-XPC晶体结构(PDB:2GGM)的叠加图。由图 10D可见,CPZ与XPC的N端占据apoC- EoCen的同一结合部位,尤其是存在XPC的色氨酸残基与apoC-EoCen间的疏水作用。因此,CPZ与apoC-EoCen-XPC的结合可看作配体的置换反应,CPZ将蛋白质结合的XPC置换。由此,可根据apoC- EoCen-XPC的结合常数计算得到CPZ与apoC-EoCen间的结合常数为5.52×104 L·mol-1 (Supporting infor- mation),与其它方法所得数据吻合。

    2.2.5   CPZ对apoC-EoCen磷酸化的抑制

    蛋白质磷酸化是重要的生物化学反应过程,通过蛋白激酶的催化将ATP上的γ-磷酰基转移到蛋白质底物的丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)或酪氨酸(Tyr)残基上来实现中心蛋白的磷酸化[34]。根据我们实验室之前的研究,蛋白激酶A(PKA)在apoC-EoCen上的磷酸化位点是Ser-166(KQTS)[35]。CPZ作为钙调蛋白抑制剂,通过聚丙烯凝胶电泳实验可以研究其是否对磷酸化蛋白质有影响。如图 11所示,apoC-EoCen终浓度为100 μmol·L-1,1~6号泳道加apoC-EoCen,2~6号泳道加磷酸化溶液混合物(Mg2+与ATP及PKA),3~6号泳道加不同浓度的CPZ,cCPZ/capoC-EoCen=5、10、30、50。蛋白质经过磷酸化后条带下移,当加入5倍和10倍的CPZ时,P-apoC-EoCen条带没有发生明显变化,当加入30倍CPZ时,P-apoC-EoCen完全转化为apoC-EoCen。说明CPZ的结合抑制了磷酸化蛋白质的形成,阻碍了蛋白质的磷酸化。

    图 11

    图 11.  CPZ对apoC-EoCen磷酸化影响的聚丙烯凝胶电泳图
    Figure 11.  Polypropylene gel electrophoresis diagram for effect of CPZ on apoC-Eocen phosphorylation

    10 mmol·L-1 Hepes, pH=7.4, 30 ℃ reaction in a water bath for 10 h, total volume=10 μL, protein concentration=100 μmol·L-1

    通过光谱分析、电泳、等温量热滴定、Tb3+荧光探针和分子对接等方法,在pH=7.4、10 mmol·L-1 Hepes条件下,研究了钙调蛋白抑制剂CPZ与apoC- EoCen的相互作用。结果表明,CPZ与apoC-EoCen以1:1结合比与apoC-EoCen的4个α-螺旋间的疏水区结合而形成复合物,条件结合常数约为104 L· mol-1;apoC-EoCen具有类核酸酶活性,可将pBR322 DNA切割为切口型􀃭、线型􀃮DNA,而CPZ抑制了apoC-EoCen的类核酸酶活性;CPZ与apoC-EoCen的结合导致蛋白质第Ⅳ结构域的金属离子结合能力丧失,进而抑制金属离子结合诱导的聚集;CPZ通过疏水作用占据apoC-EoCen的靶肽结合部位而抑制其与XPC的结合;CPZ还抑制PKA对apoC-EoCen的磷酸化。多种实验手段证明,CPZ是一种良好的中心蛋白生物功能阻断剂,在以后的医学研究中有着良好的应用前景。


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  • 图 1  盐酸氯丙嗪的结构

    Figure 1  Structure of chlorpromazine

    图 2  (A) CPZ (2.5 mmol·L-1)的加入对apoC-EoCen(10 μmol·L-1, 1 mL)荧光光谱的影响; (B)随cCPZ/capoC-EoCen变化的荧光强度(308 nm)滴定曲线, 以及CPZ滴定apoC-EoCen的拟合曲线

    Figure 2  (A) Fluorescence spectra produced by addition of CPZ (2.5 mmol·L-1) to 1 mL apoC-EoCen (10 μmol·L-1); (B) Titration curve of fluorescent intensity at 308 nm against concentration ratio of CPZ and apoC-EoCen

    Concentration of CPZ from a to u was 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 μmol·L-1, respectively; All experiments were carried out in 10 mmol·L-1 Hepes buffer (pH=7.4); Inset: plot of lg[(F0-F)/(F-F)] vs lg cCPZ, f and fitting curve

    图 3  25 ℃下CPZ (3 mmol·L-1)对apoC-EoCen (0.08 mmol·L-1)的等温量热滴定曲线

    Figure 3  Calorimetric titration curve of CPZ (3 mmol·L-1) to apoC-EoCen (0.08 mmol·L-1) at 25 ℃

    图 4  apoC-EoCen和apoC-EoCen-CPZ复合物在水中的远紫外CD光谱

    Figure 4  Far-UV CD spectra of apoC-EoCen and apoC- EoCen-CPZ complex in aqueous solution

    Condition: 10 mmol·L-1 Hepes buffer, pH=7.4, 25 ℃; Ratio of CPZ added to apoC-EoCen (25 μmol·L-1): 0 (a), 10 (b)

    图 5  (A) apoC-EoCen荧光光谱(a)和CPZ吸收光谱的重叠(b); (B) apoC-EoCen和CPZ的分子对接图

    Figure 5  (A) Overlap of apoC-EoCen fluorescence spectrum (a) and CPZ absorption spectrum (b); (B) Molecular docking between apoC-EoCen and CPZ

    Cartoon ribbon model structure of apoC-EoCen; Black dotted line represents the distance between Tyr and CPZ; green: apoC-EoCen, yellow: CPZ, purple: Tyr

    图 6  在CPZ不存在(A)和存在(B)的情况下Tb3+敏化的荧光光谱; (C)在CPZ不存在(a)和存在(b)的情况下, Tb3+在545 nm处的荧光强度与cTb3+/capoC-EoCen的关系; (D) Tb2-apoC-EoCen和Tb-apoC-EoCen-CPZ的远紫外CD光谱

    Figure 6  Tb3+ sensitized fluorescence spectra in the absence (A) and presence (B) of CPZ; (C) Fluorescence intensity of Tb3+ at 545 nm as a function of cTb3+/capoC-EoCen in the absence (a) and presence (b) of CPZ; (D) Far-UV CD spectra of Tb 2-apoC-EoCen and Tb-apoC-EoCen-CPZ

    Condition: (A) Titrating apoC-EoCen with 1 mmol·L-1 Tb3+, the protein concentration was 10 μmol·L-1, from a to h, the ratios of Tb3+ added to apoC-EoCen were 0, 0.33, 0.66, 1, 1.33, 1.66, 2, 2.33, respectively; (B) cCPZ/capoC-EoCen=10, the experiment condition was the same as A; (C) Fluorescence intensity selected at 545 nm in Fig.A as curve a, and fluorescence intensity at 545 nm in Fig.B as curve b; (D) Ratios of CPZ added to Tb 2-apoC-EoCen were 0 (a), 10 (b), respectively, capoC-EoCen=25 μmol·L-1

    图 7  (A) Tb3+滴定apoC-EoCen的RLS光谱; (B)在CPZ比例不同(cCPZ/capoC-EoCen=0 (a), 10 (b))的情况下, RLS光谱在280 nm处的强度与cTb3+/capoC-EoCen的关系

    Figure 7  (A) RLS spectra of apoC-EoCen titrated with Tb3+; (B) RLS intensity at 280 nm as a function of cTb3+/capoC-EoCen in the presence of different proportions of CPZ: cCPZ/capoC-EoCen=0 (a), 10 (b)

    apoC-EoCen concentration was 10 μmol·L-1; apoC-EoCen was titrated with 1 mmol·L-1 Tb3+, and the experiments were performed in Hepes (10 mmol·L-1, pH=7.4); from a to h, the ratios of Tb3+ added to apoC-EoCen were 0, 0.33, 0.66, 1, 1.33, 1.66, 2, 2.33, respectively

    图 8  (A) apoC-EoCen切割pBR322 DNA的琼脂糖凝胶电泳图; (B)不同构型DNA的比例与apoC-EoCen浓度的关系

    Figure 8  (A) Agarose gel electrophoresis for pBR322 DNA cutting with different concentrations of apoC-EoCen; (B) Relationship between proportion of different configurations pBR322 DNA and apoC-EoCen concentration

    10 mmol·L-1 Hepes, pH=7.4, 4 ℃ reaction for 3 h; lane 1: pBR322 DNA, lanes 2~10: 0.003 5 g·L-1 pBR322 DNA added with 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 17.5, 20 and 25 μmol·L-1 apoC-EoCen, respectively, Vtotal=10 μL

    图 9  (A) CPZ对apoC-EoCen裂解DNA影响的琼脂糖凝胶电泳图; (B)不同构型DNA的比例随cCPZ/capoC-EoCen变化的曲线

    Figure 9  (A) Agarose gel electrophoresis for effect with different proportions of CPZ on apoC-EoCen cleavaging DNA; (B) Relationship between proportion of different configurations pBR322 DNA and cCPZ/capoC-EoCen

    10 mmol·L-1 Hepes, pH=7.4, at 4 ℃ for 3 h, total volume: 10 μL; Lane 1: pBR322 DNA, lanes 2~10: pBR322 DNA+apoC-EoCen, lanes 3~10: pBR322 DNA+apoC-EoCen+CPZ (cCPZ/capoC-EoCen)=5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, respectively; final pBR322 DNA concentration: 0.003 5 g·L-1

    图 10  (A) 不同比例的CPZ加入apoC-EoCen和XPC中的天然凝胶电泳图; (B) apoC-EoCen (a)和apoC-EoCen-XPC (b)随cCPZ/capoC-EoCen的变化; (C)远紫外CD光谱中CPZ对apoC-EoCen与XPC复合物的影响(a: apoC-EoCen; b: apoC-EoCen-XPC复合物; c: apoC-EoCen-XPC与CPZ共存); (D) apoC-EoCen与XPC或CPZ结合的缎带模型

    Figure 10  (A) Non-denaturing gel electrophoresis diagram for effect of adding CPZ with different proportions to apoC-EoCen combined with XPC; (B) apoC-EoCen (a) and apoC-EoCen-XPC (b) changes with cCPZ/capoC-EoCen; (C) Far-UV CD spectra for effect of CPZ on apoC-EoCen binding to XPC (a: apoC-EoCen; b: apoC-EoCen-XPC complex; c: apoC-EoCen-XPC combined with CPZ); (D) Cartoon ribbon model structure of apoC-EoCen combined with XPC and CPZ

    Condition: (A) 10 mmol·L-1 Hepes, pH=7.4, at 4 ℃ for 6 h, total volume=10 μL, protein concentration=200 μmol·L-1; (C) protein concentration=25 μmol·L-1, target peptide ratio=1:1, CPZ concentration=250, 750 μmol·L-1, total volume= 300 μL at 25 ℃; (D) apoC-EoCen (blue), XPC (purple), CPZ (green)

    图 11  CPZ对apoC-EoCen磷酸化影响的聚丙烯凝胶电泳图

    Figure 11  Polypropylene gel electrophoresis diagram for effect of CPZ on apoC-Eocen phosphorylation

    10 mmol·L-1 Hepes, pH=7.4, 30 ℃ reaction in a water bath for 10 h, total volume=10 μL, protein concentration=100 μmol·L-1

    表 1  25 ℃下通过ITC和荧光光谱测量CPZ与apoC-EoCen结合的热力学数据

    Table 1.  Thermodynamics data of CPZ binding with apoC-EoCen measured by ITC and fluorescence spectrometry at 25 ℃

    Method K / (L·mol-1) n ΔS / (J·mol-1) ΔH / (kJ·mol-1) ΔG / (kJ·mol-1)
    ITC (1.12±0.15)×104 1 55.2 -6.77±0.81 -23.51
    Fluorescence (1.91±0.04)×104 0.9
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  • 发布日期:  2021-01-10
  • 收稿日期:  2020-08-20
  • 修回日期:  2020-10-28
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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