2008年三鹿奶粉由于添加三聚氰胺导致严重的婴幼儿健康问题，引起人们对食品中三聚氰胺检测的高度关注。三聚氰胺(2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪)是一种水溶性且含有多个氮原子的化合物，因价格低廉，被不良商家应用于增加乳制品中的表观蛋白质含量[1-2]。研究发现，人体内摄入过量的三聚氰胺会导致肾脏衰竭[3-5]，存在潜在的癌变风险[6]。另外，三聚氰胺广泛应用于塑料和涂料工业，在食品生产过程中可能会混入到食品中[7]。因此，三聚氰胺的分析和检测至关重要。
目前，常用的三聚氰胺的检测方法有气相色谱法、高效液相色谱偶联其他设备等方法，可以满足检测灵敏度的要求。但是这些方法具有耗时长，样品处理流程及数据分析复杂，需要经验丰富的操作员和昂贵的仪器等诸多缺点[8-12]，这阻碍了上述手段在日常检测三聚氰胺中的应用。SERS技术作为一种较为灵活的微量检测技术，具有成本低、无损害和操作简单等优点[13]，逐渐被应用于单分子检测中[14-16]。许多物质被用作SERS基底的支撑材料，如二氧化钛[17-18]、氧化锌[19]、金纳米颗粒[20-21]和银纳米颗粒[22-23]等。由于贵金属纳米粒子对单分子物质的吸附能力有限，加之单一衬底对低浓度物质的检测存在一定难度，可通过组装半导体/导体和贵金属复合基底来提高SERS性能。如Yin等[24]通过水热方法以Na2MoO4·2H2O和L-半胱氨酸为反应物先制备3D MoS2纳米球，然后通过微波辅助水热法制备3D MoS2-NS@Au-NPs杂化体，实现了对牛奶中三聚氰胺的SERS检测。Li等[25]在乙二醇和PVP-29辅助下，以CF3COOAg和HAuCl4为主要反应原料通过分步反应制备的Ag-Au纳米箱对低浓度三聚氰胺有较灵敏的SERS响应。在所有的SERS衬底中，银纳米结构相对成本较低，且在可见光区域具有较好的表面等离子体共振特性使其对分子检测更容易[26]。Guo等[27]通过合成1.98 nm六磷酸肌醇酯(IP6)包裹的AgNPs检测Fe3+的表面增强拉曼散射，选择罗丹明B(R6G)作为指示剂，在最佳条件下检测限可达到0.28 mg·L-1。
纳米态银的制备方法分为化学还原法和物理法。Li等[26]以聚乙烯吡咯烷酮(PVP)提高纳米银的稳定性和均匀性，以柠檬酸钠还原硝酸银，在沸腾的条件下搅拌1 h，冷却至室温，离心制得银纳米颗粒。但这种方法耗时长，且PVP可能会对SERS信号产生干扰。Bai等[28]通过结合磁控溅射和退火处理制得银纳米粒子，该方法虽然成本低，操作简单，但是得到的银纳米粒子颗粒不均匀且纯度较低。另外，一般的银拉曼基底通常在玻璃片或者硅片等材料上组装，基底本身拉曼活性低，且基底与纳米银之间的作用力弱，灵敏度低，这对于目标分子的SERS检测是不利的。因此，通过简单的化学方法在具有一定拉曼增强活性的基底表面负载银纳米颗粒以制备对三聚氰胺有拉曼活性的基底，从而实现对三聚氰胺的选择性检测，这具有潜在的实用价值。铝价格低廉、容易获取且能与含氮、氧等的分子配位，使其对这类分子有一定的SERS增强活性[29]。重要的是，通过合适的方法处理，容易调控其表面官能团的种类和数量，有利于与其它功能材料组装，通过协同作用以及对探针分子的富集可能会实现对目标分子的高灵敏检测。
我们选择Al片作为SERS基底的支撑物质，通过置换反应在Al片表面负载一定量的银纳米颗粒获得Al/Ag SERS基底，该方法制备的SERS基底耗时短、操作简单且得到的银纳米粒子较为均匀。以其为SERS基底，详细考察其对三聚氰胺的SERS性能。
实验中使用的试剂和原料Al片、氢氧化钠、硝酸银、三聚氰胺、三乙醇胺、丙二胺和N，N-二甲基甲酰胺均是从国药集团化学试剂有限公司购买，且均未经处理直接使用。去离子水为实验室自制。
利用X射线粉末衍射仪(XRD，德国Bruker D8 Advance)测定样品的物相和结构，采用Cu Kα辐射源，波长λ=0.154 nm，管流为40 mA，管压为40 kV，测试范围2θ=30°~80°。利用场发射扫描电镜观察底物的表面形貌，测试前无需特殊处理，直接将合适大小的Al片或Al/Ag片置于JEOL JSM-6701F扫描电镜(日本)下观察，工作电压10 kV。样品的组成及元素的价态信息通过X射线光电子能谱(XPS，Kratos AXIS Ultra DLD型，日本)测得，使用的X射线为Al Kα发射(hν=1 486.6 eV)，并通过C1s峰(284.5 eV)进行校准。SERS光谱通过拉曼光谱仪(Raman，i-Raman-532S型，美国B&W Tek)进行测定。
先将1 cm×1 cm的Al片用洗洁精洗掉表面的污渍，然后分别于乙醇和丙酮中超声10 min，将干净的Al片置于0.1 mol·L-1的氢氧化钠溶液中刻蚀5 min，水洗3次并快速吹干；将经上述处理的Al片浸入到1 mmol·L-1的硝酸银溶液中，10 min后取出，水洗3次吹干，备用。
取新配制的浓度为10-3 mol·L-1的三聚氰胺水溶液分别滴加在Al片、玻璃片和Al/Ag基底表面，烘干后利用拉曼光谱采集各种基底表面的拉曼信号(积分时间为40 000 ms，激发波长为532 nm)。同样条件下测试10-4、10-5、10-6、10-7 mol·L-1的三聚氰胺水溶液在Al/Ag基底表面的拉曼信号。
取新配制的浓度为10-5 mol·L-1的三聚氰胺水溶液滴加在Al/Ag基底，烘干后利用拉曼光谱采集基底表面的拉曼信号，每隔10 h采集一次。
取新配制的浓度为10-6 mol·L-1的三聚氰胺、三乙醇胺、丙二胺和N，N-二甲基甲酰胺水溶液分别滴加于Al/Ag基底和玻璃片，然后烘干，利用拉曼光谱采集各种基底表面的拉曼信号。为了对比，实验过程中还采集了纯三聚氰胺、三乙醇胺、丙二胺和N，N-二甲基甲酰胺样品在玻璃片的拉曼信号。
图 1是Al片和Al/Ag基底的SEM图以及在Al/Ag基底上Ag纳米颗粒的尺寸分布图。图 1A为刻蚀后的Al片，表面粗糙，细小颗粒组成的网络清晰可见，视野较暗。负载银纳米粒子后的表面形貌如图 1B所示，可见图片中视野明显变亮，一些较大尺寸的纳米粒子集中在Al片网络中。这可能是因为存在细小颗粒的网络区域性质较为活泼，易与溶液中的银离子发生化学反应，产生银纳米颗粒。图 1C是较大视野下的Al/Ag基底的扫描电镜图，可以看到银纳米颗粒较均匀地分散于Al基底上。基于图 1C中的银纳米颗粒得到图 1D的尺寸分布图，该图显示银颗粒尺寸在88~167 nm，主要集中在100 nm。
为表征所制备的SERS基底的结构，我们对基底进行了XRD分析。图 2给出了组装的Al/Ag基底(a)和刻蚀后的Al片(b)的XRD图。在图 2A中观察到Al在2θ=44.7°、65.0°和78.2°出现3个强的衍射峰，分别归属于Al片的(200)、(220)和(311)晶面，与标准卡片(PDF No.53-0780)相对应。与图 2B的XRD结果相比，在2θ=37.8°出现1个新的衍射峰，可归属于Ag2O的(200)晶面，表明Al/Ag中部分银元素可能以Ag2O的形式存在。另外，在2θ=44.3°出现的新峰归属于面心立方相银的(200)晶面，说明在Al/Ag基底中也存在单质银。进一步通过XPS研究在Al/Ag基底中Ag的2种价态。
(a) Al/Ag; (b) Al
为进一步确认Al/Ag基底中元素的组成和价态，对该SERS基底进行了XPS分析。从XPS全谱(图 3A)可以观察到基底中含有Al、O和Ag元素。进一步测试了Al/Ag基底中的Ag3d轨道的高分辨XPS谱，结果如图 3B所示。通过高斯分峰可拟合出4个峰，其中位于366.6和372.6 eV的2个峰分别归属于Ag2O的Ag3d5/2和Ag3d3/2轨道[30]，而位于367.8和373.4 eV的2个峰可归属于单质银的Ag3d5/2和Ag3d3/2轨道[31]。这进一步证实了Al/Ag基底中银元素以2种价态形式存在。由此可见，XPS的结果与XRD结果相一致。
三聚氰胺的结构如图 4所示，具有D3h对称性结构，因此可以用拉曼光谱检测。已有研究表明，位于665 cm-1处的特征峰归属于三聚氰胺中三嗪环呼吸模式和面内变形振动，574 cm-1为N-C=N弯曲振动与NH2基团扭转运动的混合模式, 975 cm-1归属于C-N与N-C=N弯曲振动的共同作用[32-33]。
我们研究了不同基底对三聚氰胺的拉曼响应。如图 5所示，曲线a、b和c分别代表 10-3 mol·L-1三聚氰胺溶液在玻璃片、Al片和Al/Ag基底上的拉曼光谱。可以看出，三聚氰胺在玻璃片上仅显示微弱的拉曼信号，这说明以玻璃为拉曼基底对三聚氰胺不敏感；而三聚氰胺在Al片上显示强于在玻璃片上的拉曼信号，说明Al片是比玻璃片更好的拉曼基底，而在Al/Ag基底上三聚氰胺的特征拉曼峰明显增强。比较3种不同基底对三聚氰胺的拉曼增强效果，拉曼活性从低到高依次是玻璃片、Al片和Al/Ag基底。这说明Al/Ag基底是对三聚氰胺进行拉曼检测较好的活性基底。
通过以上分析，我们发现三聚氰胺在Al/Ag基底上拉曼信号最高，因此选择Al/Ag基底对不同浓度的三聚氰胺进行拉曼检测。图 6显示了不同浓度的三聚氰胺水溶液在Al/Ag基底的SERS光谱。从光谱显示的结果可以看出，随三聚氰胺浓度的降低，拉曼强度逐渐减弱，当三聚氰胺浓度降低到10-7 mol·L-1时，依然可以检测到三聚氰胺位于667 cm-1的归属于三聚氰胺中三嗪环呼吸模式和面内变形振动的特征峰。上述结果表明所制备的Al/Ag基底上能检测到10-7 mol·L-1的三聚氰胺，这满足我国食品安全检测中心提出的婴幼儿乳粉中三聚氰胺含量不得超过1 mg·kg-1(7.9×10-6 mol·L-1)和其它乳制品中不超过2.5 mg·kg-1(2×10-5 mol·L-1)的要求。因此，所制备的Al/Ag基底能够满足对实际生活中三聚氰胺的拉曼检测要求。
(a) 10-4, (b) 10-5, (c) 10-6 and (d) 10-7 mol·L-1 melamine
基底对待检测物的拉曼测试重现性是评价基底性能的重要参数之一，为此我们对Al/Ag基底检测三聚氰胺的重现性进行了探究。图 7A中的曲线是每隔10 h测试的Al/Ag基底上10-6 mol·L-1的三聚氰胺的拉曼光谱图，从中可以看到在150 h内三聚氰胺的拉曼强度总体保持在同一强度。据文献报道[33]三聚氰胺在667 cm-1处的特征峰为三嗪环的呼吸振动，拉曼活性较强。在本实验中制备的Al/Ag基底上由于三聚氰胺分子与银纳米粒子之间产生较强的相互作用，进而发生电荷转移，使电荷重新分配，引起极化率的变化，导致其拉曼信号增强[34-35]。因此，以667 cm-1处的拉曼主特征峰的强度作柱状图(图 7B)，能更直观地观察到主特征峰的强度在150 h内基本保持不变(在130 h时拉曼强度有增加，这可能一方面由于仪器待机时间过长，造成测量误差；另一方面原因可能是空气中的水分子影响三聚氰胺在基底的吸附，致使拉曼强度有所波动)。
为了研究Al/Ag基底是否对三聚氰胺具有选择性，我们选择了另外3种水溶性胺类化合物三乙醇胺、N，N-二甲基甲酰胺和1，2-丙二胺进行拉曼测试。结果如图 8所示，曲线a和b分别代表 10-6 mol·L-1的胺类物质在Al/Ag基底和玻璃片基底的拉曼光谱，曲线c为单纯胺类物质在玻璃片基底的拉曼信号。从图中可以看出，当待检测物的浓度为10-6 mol·L-1时，在Al/Ag基底上只能观察到三聚氰胺的拉曼信号峰，而并未观察到其它3类待检测物(三乙醇胺、N，N-二甲基甲酰胺和1，2-丙二胺)的拉曼信号。这初步说明Al/Ag基底对低浓度三聚氰胺具有较高的SERS活性和较好的选择性。
通过置换法在铝板上快速制备了一种即插即用型的Al/Ag纳米SERS活性基底。通过对三聚氰胺的拉曼活性测试，发现该SERS基底能够快速实现对三聚氰胺的检测，而且具有操作简单、成本低、无损伤检测等优点，最低检测浓度能达到10-7 mol· L-1，满足国家食品安全要求对三聚氰胺检测的最低标准。另外，Al/Ag基底对三聚氰胺检测具有较高的拉曼重现性和较好的选择性，这对于实现Al/Ag基底在实际中的应用非常有利。本研究对快速构筑具有SERS活性的传感器并实现对食品中有毒、有害物质的快速检测提供一定的理论和实验基础。
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图 1 (A) Al和(B, C) Al/Ag的扫描电镜图和(D) Ag纳米颗粒的尺寸分布
Figure 1 SEM images of (A) Al and (B, C) Al/Ag, and (D) size distribution of Ag
图 2 样品的(A) XRD图和(B)局部放大XRD图
Figure 2 (A) XRD patterns and (B) enlarged XRD patterns in 2θ range of 36°~46° of samples
(a) Al/Ag; (b) Al
图 3 Al/Ag的(A) XPS全谱和(B) Ag3d轨道的高分辨XPS谱
Figure 3 (A) Typical XPS survey spectra and (B) high resolution XPS spectra of Ag3d of Al/Ag
图 5 10-3 mol·L-1三聚氰胺溶液在(a)玻璃、(b) Al片和(c) Al/Ag基底上的SERS谱图
Figure 5 Raman spectra of 10-3 mol·L-1 melamine on (a) glass, (b) Al and (c) Al/Ag substrate
图 6 不同浓度的三聚氰胺溶液在Al/Ag基底上的SERS谱图
Figure 6 SERS spectra of different concentrations of melamine solution on Al/Ag substrate
(a) 10-4, (b) 10-5, (c) 10-6 and (d) 10-7 mol·L-1 melamine
图 7 10-5 mol·L-1的三聚氰胺在Al/Ag上150 h内每隔10 h测试的拉曼光谱(A), 667 cm-1处拉曼强度与时间的关系柱状图(B)
Figure 7 SERS spectra of 10-5 mol·L-1 melamine on Al/Ag at intervals of 10 h within 150 h (A) and column chart of the relationship between the Raman intensity at 667 cm-1 and 17:35:33
图 8 10-6 mol·L-1的三聚氰胺、三乙醇胺、N, N-二甲基甲酰胺和1, 2-丙二胺在Al/Ag (a)和玻璃基片(b)上的拉曼光谱; 纯三聚氰胺、三乙醇胺、N, N-二甲基甲酰胺和1, 2-丙二胺在玻璃片上的拉曼光谱(c)
Figure 8 Raman spectra of 10-6 mol·L-1 of melamine, triethanolamine, N, N-dimethylformamide and 1, 2-diaminopropane on the Al/Ag (a) and glass (b), respectively; Raman spectra of pure melamine, pure triethanolamine, pure N, N′-dimethylformamide and pure 1, 2-diaminopropane on glass (c)
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