English

• 化疗是治疗癌症的重要手段之一，在Rosenberg等发现顺铂的抗肿瘤活性后，人们合成了许多顺铂类似物并应用于临床。至今，铂类药物仍是应用最广泛的化疗药物^[1-2]。但由于铂类药物的耐药性和严重的副作用，如急性肾毒性、骨髓抑制和慢性神经毒性^[3-4]，促使人们寻找新的非铂类抗肿瘤金属配合物^[5]。

  铜在人体内的含量仅次于铁和锌，并且参与生物体中几个关键的生命过程^[6]。一般来说，铜的毒性比其他金属小，因此，铜(Ⅱ)配合物被认为具有克服毒副作用和耐药性的特性。许多铜(Ⅱ)配合物被报道具有较强的结合与裂解DNA的能力，其中一些具有抗癌和调控凋亡的能力^[7-9]。三联吡啶及其衍生物可以作为DNA结合剂、拓扑酶抑制剂和抗肿瘤药物，具有潜在的应用价值^[10-11]。此外，三联吡啶作为一种三齿配体，有3个共平面的氮原子，具有与金属形成稳定金属配合物的能力，是构建金属配合物的重要配体^{[12, 14-15]}。

  为此，我们合成了1个新的三联吡啶铜(Ⅱ)配合物[Cu₂(μ-L-κO，O)₂Cl₂] (1)，通过单晶X射线衍射确定了配合物1的晶体结构，测定了配合物1对5种肿瘤细胞株(MGC80-3、T24、A549、HeLa、Hep-G2)的体外抗肿瘤活性，应用流式细胞术测定了配合物1对MGC80-3细胞的凋亡效应及周期阻滞情况。

  1.   实验部分

  1.1   仪器和试剂

  所用仪器有：Bruker APEX-Ⅱ CCD单晶衍射仪，德国Bruker Avance Ⅲ HD 400 MHz核磁共振谱仪，德国Bruker HCT离子阱质谱仪，美国Spectrum Two傅里叶变换红外光谱仪，德国Vario EL Ⅲ元素分析仪，美国CARY ECLIPSE紫外可见分光光度计，美国Thermo二氧化碳培养箱，美国TECAN-M1000酶标定量测定仪，美国BD公司FACSVerse流式细胞仪。

  3-氯水杨醛、2-乙酰吡啶及氯化铜均为分析纯试剂，购于阿拉丁。胎牛血清及DMEM培养基购自CIBCO公司，MTT购自Solarbio公司。

  1.2   配体及配合物的合成与结构表征

  配体4-(2-羟基-3-氯)苯基-2，2′:6′，2″-三联吡啶(HL)的合成参考文献已报道的方法^[13]，产率为81.7%。用3-氯水杨醛和2-乙酰吡啶反应合成配体(HL)(Scheme 1)。其结构表征数据为：ESI-MS m/z：397.5[L+K⁺]。¹H NMR(400 MHz，DMSO-d₆)：δ 15.57(s，1H)，9.08(d，J=1.3 Hz，1H)，8.89(d，J=1.3 Hz，1H), 8.84(d，J=4.8 Hz, 2H), 8.48(d，J=8.0 Hz, 1H), 8.32(s, 1H)，8.23(d，J=7.9 Hz，1H)，8.13(s，1H)，8.06(d，J=17.3 Hz，1H)，7.57(s，2H)，7.56(d，J=9.2 Hz，1H)，7.00(s，1H)。¹³C NMR(100 MHz，DMSO-d₆)：δ 155.54，155.42，150.65，150.50，149.79，148.10，137.90，130.83, 129.48, 129.10, 124.89，122.65，121.59，121.30。IR(KBr，cm^-1)：3 910(w)，3 889(w)，3 808(w)，3 786(w)，3 697(w)，3 659(w)，3 636(w)，3 574(w)，3 055(m)，3 010(m)，1 693(w)，1 585(s)，1 566(s)，1 547(s)，1 468(s)，1 436(s)，1 391(s)，1 263(m)，1 228(m)，1 177(m)，1 140(m)，1 080(m)，1 042(m)，991(w)，890(m)，867(m)，829(w)，775(s)，737(s)，665(m)，637(m)，621(m)，564(w)，510(w)。

  Scheme 1

  

  Scheme 1.  Synthesis of ligand HL

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  配合物[Cu₂(μ-L-κO，O)₂Cl₂] (1)的合成方法如下：称取10 mg(0.028 mmol)配体和10 mg(0.056 mmol) CuCl₂·2H₂O于一端闭合的25 cm Pyrex厚壁玻璃管中，滴加0.25 mL丙酮与1 mL甲醇，液氮冷冻后，在真空条件下将玻璃管开口端熔封，待玻璃管内溶液恢复室温后置于65 ℃的烘箱反应72 h。反应结束后梯度降温至室温，管内生成墨绿色块状晶体(配合物1)，产率为62.7%。挑选出大小、形状适合的单晶，进行结构表征。配合物1的晶体学及结构修正数据见表 1。其结构表征数据如下：ESI-MS m/z：498.6[M-Cu-L-Cl+K+H]⁺。元素分析按C₄₂H₂₆Cl₄ Cu₂N₆O₂计算值(%)：C 55.10，H 2.86，N 9.18；实测值(%)：C 54.87，H 2.89，N 9.15。IR(KBr，cm^-1)：3 909(w)，3 890(w)，3 858(w)，3 843(w)，3 826(w)，3 807(w)，3 787(w)，3 738(w)，3 715(w)，3 695(m)，3 680(w)，3 659(w)，3 635(w)，3 572(m)，3 433(m)，3 057(m)，2 344(w)，1 604(s)，1 569(m)，1 554(m)，1 475(s)，1 450(m)，1 414(s)，1 325(m)，1 301(m)，1 246(s)，1 164(m)，1 138(m)，1 093(m)，1 067(m)，1 052(w)，1 036(m)，1 019(s)，890(m)，870(m)，783(s)，749(m)，736(m)，715(m)，680(m)，656(m)，645(m)，510(w)，414(w)。

  表 1

  

  表 1  配合物1的晶体学及结构修正数据

  Table 1.  Crystal data and structure refinement for complex 1

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  Empirical formula	C42H26Cl4Cu2N6O2·CH3OH
  Formula weight	947.61
  Crystal system	Triclinic
  Space group	P1
  a / nm	0.885 2(5)
  b / nm	1.035 5(5)
  c / nm	1.137 8(6)
  α / (°)	103.212(7)
  β / (°)	107.047(7)
  γ / (°)	91.143(7)
  Volume / nm3	0.966 5(9)
  Z	1
  Dc / (g·cm-3)	1.573
  μ / mm-1	1.423
  F(000)	480
  Crystal size / mm	0.21×0.15×0.12
  2θ range for data collection / (°)	3.862~60.91
  Index ranges	-12 ≤ h ≤ 12, -14 ≤ k ≤ 14, -16 ≤ l ≤ 16
  Reflection collected	15 062
  Independent reflection	5 629 (Rint=0.030 0, Rσ=0.034 9)
  Data, restraint, parameter	5 629, 12, 272
  Goodness-of-fit on F2	1.058
  Final R indexes [I≥2σ(I)]	R1=0.041 3, wR2=0.114 3
  Final R indexes (all data)	R1=0.054 4, wR2=0.123 6
  Largest diff. peak and hole / (e·nm-3)	1 000, -680

  1.3   配合物1晶体结构测定

  挑选出大小、形状适合的单晶置于Bruker APEX-Ⅱ CCD单晶衍射仪上，采用经石墨单色器单色化的Mo Kα射线(λ=0.071 073 nm)，在296.15 K下, 2.417°~29.601°(θ)范围内对配合物1的单晶X射线衍射数据进行收集。晶体结构使用具有各向异性热参数的SHELXL-2015^[16]的直接方法解出并通过全矩阵最小二乘法(the full-matrix least-squares method on F²)进行精修。碳原子上的氢原子为理论加氢。配合物1的部分晶体学及结构修正数据见表 1。

  CCDC：1959094。

  1.4   体外抗肿瘤活性实验

  采用MTT比色法测定CuCl₂·2H₂O、配体HL、配合物1及顺铂对所选5种癌细胞株(MGC80-3、T24、A549、HeLa、Hep-G2)的IC₅₀值。使用流式细胞术检测配合物1诱导MGC80-3细胞凋亡以及周期阻滞的情况。

  2.   结果与讨论

  2.1   配合物1的晶体结构

  配合物1的晶体结构如图 1所示，部分键长和键角数据详见表 2。配合物1属于三斜晶系，P1空间群。配合物1为双核结构，在对称单元中，中心铜(Ⅱ)离子为五配位扭曲四方锥几何构型，每个铜离子与1个Cl^-以及来自配体L^-的2个N原子和2个羟基O原子配位；2个铜(Ⅱ)离子通过羟基的桥联形成双核结构。

  图 1

  

  图 1.  配合物1的椭球率50%的晶体结构图

  Figure 1.  Crystal structure of complex 1 with 50% probability ellipsoids

  CH₃OH molecule has been omitted for clarity; Symmetry code: ⁱ-x+1, -y+1, -z

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  表 2

  

  表 2  配合物1部分键长(nm)和键角(°)

  Table 2.  Selected bond lengths (nm) and angles (°) for complex 1

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  Cu1-Cl1	0.226 58(11)	Cu1-O1	0.232 35(19)	Cu1-N2	0.200 2(2)
  Cu1-O1i	0.191 8(17)	Cu1-N1	0.200 68(19)
  Cl1-Cu1-O1	103.93(6)	O1i-Cu1-N1	91.14(8)	N1-Cu1-Cl1	154.72(6)
  O1i-Cu1-Cl1	94.81(6)	N2-Cu1-Cl1	95.34(7)	N1-Cu1-O1	101.27(8)
  O1i-Cu1-O1	80.77(7)	N2-Cu1-O1	92.73(8)
  O1i-Cu1-N2	169.03(8)	N2-Cu1-N1	81.41(8)
  Symmetry code: i -x+1, -y+1, -z.

  2.2   配合物1在溶液中的稳定性

  用紫外光谱检测配体HL和配合物1的稳定性(图 2、3)。浓度为20 μmol·L^-1的配合物在pH=7.35的Tris-HCl缓冲液中，置于室温下0和48 h后，分别用紫外光谱仪各测1次吸光度^[17-18]。从图中可以看出各组吸收峰没有发生红移或蓝移现象，也没有新的吸收峰出现，说明配合物1在Tris-HCl缓冲液中能够稳定存在至少48 h。

  图 2

  

  图 2.  配体HL的紫外光谱图

  Figure 2.  UV spectra of ligand HL

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  图 3

  

  图 3.  配合物1的紫外光谱图

  Figure 3.  UV spectra of complex 1

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  2.3   体外抗肿瘤活性

  为了研究配合物1的体外抗肿瘤活性，我们以人正常肝细胞HL-7702为对照，采用MTT法测定了CuCl₂·2H₂O、配体HL、配合物1和顺铂对MGC80-3，T24，A549，HeLa和Hep-G2五种肿瘤细胞株的细胞毒性^[19-22]。由表 3可知，配合物1对所选的肿瘤细胞株的抑制率均高于CuCl₂·2H₂O、配体HL及顺铂。其中对人胃癌MGC80-3细胞的抑制率最高，达到了(84.30±1.28)%。如表 4所示，从IC₅₀也可以看出，配合物1对人胃癌MGC80-3细胞的细胞毒性最高，其IC₅₀值为(3.36±0.43) μmol·L^-1。与正常细胞HL-7702相比，配合物1对5种肿瘤细胞均表现出较高的细胞毒性，说明配合物1在一定程度上可以选择性抑制肿瘤细胞。

  表 3

  

  表 3  化合物对不同细胞株的抑制率

  Table 3.  Inhibition rates of ligand HL, CuCl₂·2H₂O, complex 1 and cisplatin on the six selected human cell lines

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  %
  	MGC80-3	T24	A549	HeLa	Hep-G2	HL-7702
  HL	29.74±1.97	41.12±1.28	53.57±0.66	51.70±1.13	44.19±1.01	36.59±0.09
  1	84.30±1.28	77.57±1.36	60.25±0.93	76.16±0.27	69.79±1.72	78.42±0.79
  CuCl2·2H2O	28.39±0.7	39.68±0.74	36.47±0.20	29.88±0.37	21.66±0.90	25.13±0.11
  Cisplatin	56.79±0.67	62.18±1.09	47.61±0.85	54.38±1.27	50.64±0.97	52.07±0.77

  表 4

  

  表 4  化合物对不同细胞株的IC₅₀值

  Table 4.  IC₅₀ values of ligand HL, CuCl₂·2H₂O, complex 1 and cisplatin on the six selected human cell lines

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  μmol·L-1
  	MGC80-3	T24	HeLa	Hep-G2	A549	HL-7702
  HL	> 20	> 20	18.89±0.76	no activity	17.99±0.84	> 20
  1	3.36±0.43	5.19±0.028	5.86±0.52	6.94±0.56	8.16±0.81	11.27±0.71
  CuCl2·2H2O	17.53±0.72	> 20	22.11±0.26	no activity	> 20	> 20
  Cisplatin	14.29±0.69	12.90±0.31	16.02±0.29	17.04±0.08	20.47±1.09	14.49±0.58

  2.4   细胞凋亡

  采用Annexin V FITC和PI双染色法测定配合物1对MGC80-3细胞的凋亡效应。图 4为药物浓度分别为1.5、3.0和4.5 μmol·L^-1，作用24 h后，配合物1诱导人胃癌MGC80-3细胞凋亡的百分数。在给药浓度4.5 μmol·L^-1下，细胞凋亡百分数为41.4%，比对照组增加了33.45%，可推测配合物1诱导MGC80-3细胞进入早期凋亡^[23]。

  图 4

  

  图 4.  配合物1诱导MGC80-3凋亡的情况

  Figure 4.  Apoptosis in MGC80-3 cells exposure to complex 1 for 24 h

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  2.5   周期阻滞

  采用流式细胞术研究了配合物1诱导MGC80-3细胞的细胞周期阻滞情况^[24-25]。图 5为不同浓度下，配合物1作用MGC80-3细胞24 h后的细胞周期阻滞情况。与空白对照组相比，随着给药浓度从1.5、3.0、4.5 μmol·L^-1逐渐增大，MGC80-3细胞在G1期的百分比明显增加，由43.81%分别增至72.14%、72.68%和74.19%，呈浓度依赖关系。说明配合物1使MGC80-3细胞阻滞于G1期，从而抑制肿瘤细胞的生长。

  图 5

  

  图 5.  配合物1对MGC80-3细胞周期的影响

  Figure 5.  Cell cycle distribution of MGC80-3 cells exposure to complex 1 for 24 h

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  3.   结论

  以4-(2-羟基-3-氯)苯基-2，2′:6′，2″-三联吡啶(HL)作为配体合成了配合物[Cu₂(μ-L-κO，O)₂Cl₂] (1)，并用多种分析方法对其进行完整的表征。采用MTT法、流式细胞术对5种肿瘤细胞株及人正常肝细胞HL-7702进行抑制生长活性、细胞凋亡和细胞周期阻滞测试。与配体和顺铂相比，配合物1对不同的细胞株具有更高的细胞毒性，其中对人胃癌MGC80-3细胞的细胞毒性最高，IC₅₀值为(3.36±0.43) μmol·L^-1。配合物1可以诱导MGC80-3细胞凋亡，且配合物1使MGC80-3细胞阻滞于G1期。

  
  
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  Scheme 1  Synthesis of ligand HL

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  图 1  配合物1的椭球率50%的晶体结构图

  Figure 1  Crystal structure of complex 1 with 50% probability ellipsoids

  CH₃OH molecule has been omitted for clarity; Symmetry code: ⁱ-x+1, -y+1, -z

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  图 2  配体HL的紫外光谱图

  Figure 2  UV spectra of ligand HL

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  图 3  配合物1的紫外光谱图

  Figure 3  UV spectra of complex 1

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  图 4  配合物1诱导MGC80-3凋亡的情况

  Figure 4  Apoptosis in MGC80-3 cells exposure to complex 1 for 24 h

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  图 5  配合物1对MGC80-3细胞周期的影响

  Figure 5  Cell cycle distribution of MGC80-3 cells exposure to complex 1 for 24 h

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  表 1  配合物1的晶体学及结构修正数据

  Table 1.  Crystal data and structure refinement for complex 1

  Empirical formula	C42H26Cl4Cu2N6O2·CH3OH
  Formula weight	947.61
  Crystal system	Triclinic
  Space group	P1
  a / nm	0.885 2(5)
  b / nm	1.035 5(5)
  c / nm	1.137 8(6)
  α / (°)	103.212(7)
  β / (°)	107.047(7)
  γ / (°)	91.143(7)
  Volume / nm3	0.966 5(9)
  Z	1
  Dc / (g·cm-3)	1.573
  μ / mm-1	1.423
  F(000)	480
  Crystal size / mm	0.21×0.15×0.12
  2θ range for data collection / (°)	3.862~60.91
  Index ranges	-12 ≤ h ≤ 12, -14 ≤ k ≤ 14, -16 ≤ l ≤ 16
  Reflection collected	15 062
  Independent reflection	5 629 (Rint=0.030 0, Rσ=0.034 9)
  Data, restraint, parameter	5 629, 12, 272
  Goodness-of-fit on F2	1.058
  Final R indexes [I≥2σ(I)]	R1=0.041 3, wR2=0.114 3
  Final R indexes (all data)	R1=0.054 4, wR2=0.123 6
  Largest diff. peak and hole / (e·nm-3)	1 000, -680

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  表 2  配合物1部分键长(nm)和键角(°)

  Table 2.  Selected bond lengths (nm) and angles (°) for complex 1

  Cu1-Cl1	0.226 58(11)	Cu1-O1	0.232 35(19)	Cu1-N2	0.200 2(2)
  Cu1-O1i	0.191 8(17)	Cu1-N1	0.200 68(19)
  Cl1-Cu1-O1	103.93(6)	O1i-Cu1-N1	91.14(8)	N1-Cu1-Cl1	154.72(6)
  O1i-Cu1-Cl1	94.81(6)	N2-Cu1-Cl1	95.34(7)	N1-Cu1-O1	101.27(8)
  O1i-Cu1-O1	80.77(7)	N2-Cu1-O1	92.73(8)
  O1i-Cu1-N2	169.03(8)	N2-Cu1-N1	81.41(8)
  Symmetry code: i -x+1, -y+1, -z.

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  表 3  化合物对不同细胞株的抑制率

  Table 3.  Inhibition rates of ligand HL, CuCl₂·2H₂O, complex 1 and cisplatin on the six selected human cell lines

  %
  	MGC80-3	T24	A549	HeLa	Hep-G2	HL-7702
  HL	29.74±1.97	41.12±1.28	53.57±0.66	51.70±1.13	44.19±1.01	36.59±0.09
  1	84.30±1.28	77.57±1.36	60.25±0.93	76.16±0.27	69.79±1.72	78.42±0.79
  CuCl2·2H2O	28.39±0.7	39.68±0.74	36.47±0.20	29.88±0.37	21.66±0.90	25.13±0.11
  Cisplatin	56.79±0.67	62.18±1.09	47.61±0.85	54.38±1.27	50.64±0.97	52.07±0.77

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  表 4  化合物对不同细胞株的IC₅₀值

  Table 4.  IC₅₀ values of ligand HL, CuCl₂·2H₂O, complex 1 and cisplatin on the six selected human cell lines

  μmol·L-1
  	MGC80-3	T24	HeLa	Hep-G2	A549	HL-7702
  HL	> 20	> 20	18.89±0.76	no activity	17.99±0.84	> 20
  1	3.36±0.43	5.19±0.028	5.86±0.52	6.94±0.56	8.16±0.81	11.27±0.71
  CuCl2·2H2O	17.53±0.72	> 20	22.11±0.26	no activity	> 20	> 20
  Cisplatin	14.29±0.69	12.90±0.31	16.02±0.29	17.04±0.08	20.47±1.09	14.49±0.58

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