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• 果胶酶是一类将植物组织中的果胶多糖水解成半乳糖醛酸等小分子的异构相关酶^[1]。近年来，果胶酶在食品药品工业、麻类脱胶、木材防腐、环境保护、污水处理等方面都有着广泛的应用^[2~4]。在食品工业中，添加一定量的果胶酶可以提高果蔬汁的出汁率、改善果蔬饮料的营养成分和浓缩果汁的品质、脱除及净化果皮及提高超滤时的膜通量等^[5]。在当前的工业应用中都是将果胶酶直接加入到生产中，但是以这种方式添加的果胶酶很难回收再利用^[6]。为了提高果胶酶的使用率^[7]、降低生产成本，研究者提出了固定化酶技术。固定化酶技术是一种利用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，进行特有的催化反应，并可回收及重复利用的技术^[8]。目前，固定化酶的载体材料主要有以下几类：无机载体(如玻璃、硅凝胶、蒙脱土等)、磁性高分子微球(如聚苯乙烯磁性微球)、天然高分子载体(如海藻酸钠^[9]、壳聚糖^[10])和合成高分子载体(如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯)等^[11]。以上述材料制备的固定化酶酶活力较低或机械稳定性不佳，因此需要探究效果更好的固定化酶载体材料。

  HPD系列树脂是具有不同极性的苯乙烯型大孔吸附树脂^[12]。其中HPD-750大孔树脂是中极性树脂，物理化学性质稳定，具有较大的比表面积，平均孔径在85~90 nm，属于大孔吸附树脂^[13~17]，具有性质稳定、生物相容性好、酶负载量高、机械稳定性高、安全无毒、绿色环保等优点，是较为理想的固定化酶载体材料。以HPD-750树脂为载体材料固定化脂肪酶^[18]和多酚氧化酶^[19]已见报道，但目前仍鲜见以HPD-750为载体材料固定化果胶酶的报道。

  本文优化了以HPD-750大孔树脂为载体通过物理吸附固定化果胶酶的条件，对以HPD-750大孔树脂为载体的固定化果胶酶的性能进行评价，并将其与工业中广泛使用的D311大孔树脂、合成高分子材料聚丙烯酰胺^{[20, 21]}与天然高分子材料海藻酸钠微球^{[22, 23]}等材料固定化果胶酶的实验结果进行对比，为今后固定化酶载体材料的筛选提供理论依据。

  1.   材料与方法

  1.1   材料与仪器

  果胶、果胶酶、海藻酸钠均购于西安裕华生物科技有限公司；HPD-750大孔树脂(陕西乐博生化科技有限公司)；D311大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂(郑州勤实科技有限公司)；D-半乳糖醛酸(北京索莱宝科技有限公司)；柠檬酸、柠檬酸钠、酒石酸钾钠、无水硫酸钠、3, 5-二硝基水杨酸、苯酚、结晶氯化钙、戊二醛50%水溶液均为分析纯级，购于天津市致远化学试剂有限公司；实验用水为蒸馏水。

  1780-紫外可见分光光度(日本岛津有限公司)；PHB-8型pH计(上海佑科仪器仪表有限公司)。

  1.2   实验方法

  1.2.1   HPD-750大孔树脂预处理

  大孔树脂用无水乙醇浸泡12h，然后用蒸馏水冲洗至无醇，保存于4℃冰箱备用。

  1.2.2   果胶酶的固定化

  取适量处理好的HPD-750、D311大孔树脂、聚丙烯酰胺和海藻酸钠微球，用滤纸擦干表面水分，分别称取0.5g放入PE管中，加入一定量pH为4.0的酶液，放入水浴锅在一定温度下吸附一定时间。吸附完成后，用缓冲液冲洗载体以洗去未被固定的果胶酶，于4℃冰箱中保存备用。按照下式计算固定化酶活性^[24]。采用3, 5-二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖的含量^[25]。

  $ U=\frac{(A 1-A 2-b) N}{K t} $

  (1)

  式中，U为固定化果胶酶活性；A₁为待测样吸光度；A₂为空白样吸光度；b为标准曲线回归方程截距；N为稀释倍数；K为标准曲线斜率；t为反应时间(h)

  酶活性单位^[24]：1.00mL酶液在一定温度和pH条件下，1h分解果胶产生1.0mg D-半乳糖醛酸为1个酶活性单位，即1U。

  1.2.3   相对酶活力

  各实验在其最优条件下的最高活性为参考，定义为100%。相对酶活力由下式计算^[25]。

  $ 相对酶活力 = \frac{{特定条件下的酶活力}}{{最佳条件下的酶活力}} \times 100\% $

  (2)

  2.   结果与分析

  2.1   固定化果胶酶的单因素条件优化

  2.1.1   pH的选择

  在固定化温度为50℃、加酶量为0.01g/mL、固定化时间为4h的条件下，分别选取果胶酶溶液的pH为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0进行酶活力的测定。由图 1可以看出，果胶酶活力呈现先增加后减小的趋势，在pH为4.0时酶活力达到最大值3599U/mg，当pH大于4.0之后，酶活力迅速降低。主要是因为pH过高或过低时，蛋白质分子可能发生变性，使酶的生物活性丧失，酶的活性降低。因此，选定pH 4.0是固定化酶的适宜反应pH。

  图 1

  

  图 1.  pH对果胶酶活力的影响

  Figure 1.  Effect of pH on pectinase activity

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  2.1.2   固定化温度的选择

  在pH为4.0、加酶量为0.01g/mL、固定化时间为4h的条件下，分别在30、35、40、45、50、55、60 ℃进行固定化，测试酶活力，实验结果如图 2所示。由图可知，固定化温度低于45℃时，果胶酶活力值随着温度的上升而逐渐增加，在温度为45℃时达到最大值4934U/mg；固定化温度高于45℃时，果胶酶活力迅速下降。这是因为温度过高时，酶分子蛋白会被破坏，造成酶活力降低。因此45℃为果胶酶固定化的适宜反应温度。

  图 2

  

  图 2.  固定化反应温度对果胶酶活力的影响

  Figure 2.  Effect of immobilization reaction temperature on pectinase activity

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  2.1.3   加酶量的选择

  在pH为4.0、固定化温度为45℃、固定化时间为4h的条件下，加酶量分别为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20g/mL，测定所得固定化酶的活力，实验结果如图 3所示。底物浓度一定的条件下，随着酶浓度的增加，果胶酶活力也随之增加。在酶浓度达到0.16g/mL时，果胶酶活力达到最大值5481U/mg，随后酶活力基本不变。这是因为底物浓度是有限的，大孔树脂酶的负载量也是一定的，当酶浓度达到0.16g/mL时，酶的负载量达到最大值，底物与酶分子的活性中心结合达到饱和，其酶活力最大。所以，适宜固定化酶浓度为0.16g/mL。

  图 3

  

  图 3.  加酶量对果胶酶活力的影响

  Figure 3.  Effect of enzyme amount on pectinase activity

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  2.1.4   固定化时间的选择

  在pH为4.0、固定化温度为45℃、加酶量为0.16g/mL的条件下，分别固定化2、4、6、8、10、12h，测定所得固定化酶的活力，结果如图 4所示。由图可知，固定化时间为4h时，酶活力达到最大值5445U/mg。随着固定化时间的增加，酶活力逐渐下降，可能是随着固定化时间的延长，固定后的果胶酶从大孔中脱落，造成酶活力降低。所以，4h为适宜的固定化时间。

  图 4

  

  图 4.  固定化反应时间对果胶酶活力的影响

  Figure 4.  Effect of immobilization reaction time on pectinase activity

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  2.2   正交试验优化固定化条件

  采用正交设计实验对固定化条件进行验证，设计了以下四因素三水平的正交试验(如表 1所示)。正交试验方案与分析见表 2，从表 2中可以看出，固定化时间对实验结果影响最大；其次是反应液pH、固定化温度和果胶酶浓度。由正交试验得出最佳试验方案为A₂B₂C₂D₁。

  表 1

  

  表 1  试验因素水平表

  Table 1.  Experimental factors and levels

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  	A 温度/℃	B pH	C 时间/h	D 酶浓度/(g·mL-1)
  1	40	4.5	6	0.16
  2	45	4.0	4	0.14
  3	50	3.5	2	0.18

  表 2

  

  表 2  实验方案与结果

  Table 2.  Experimental scheme and results

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  	试验因素				酶活力 /(U·g-1)
  	A	B	C	D
  1	1	1	1	1	4.762
  2	1	2	2	2	4.505
  3	1	3	3	3	4.078
  4	2	2	2	1	5.143
  5	2	1	3	3	3.725
  6	2	3	1	2	5.137
  7	3	1	3	2	3.532
  8	3	2	1	3	4.475
  9	3	3	2	1	4.171
  Ij	13.344	12.019	14.374	14.076
  Ⅱj	14.004	14.123	13.819	13.174
  Ⅲj	12.78	13.386	11.335	12.278
  Rj	1.826	2.104	3.039	1.798

  对酶活力实验数据进行方差分析^[26]，计算结果如下。

  总平均值：

  y=1/9(4.762+4.505+5.143+ 3.725+5.137+4.475+4.171)=4.392

  则总偏差平方和：

  $ S=\sum\limits_{j=1}^{4}\left(\bar{x}_{i}-\bar{x}\right)^{2}=\sum\limits_{j=1}^{4} S_{i}=8.61 $

  因素A引起的偏差平方和为：

  $ S_{A}=1 / 3\left(\mathrm{I}_{j}^{2}+\mathrm{II}_{j}^{2}+\mathrm{III}_{j}^{2}\right)-\frac{T^{2}}{9} $

  同理S_A=5.56，S_B=0.76，S_C=1.75，S_D=0.54

  表 3

  

  表 3  方差分析

  Table 3.  Analysis of variance

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  试验条件	偏差平方和	自由度	F值	F临界值	显著性
  A	5.56	2	1.94		-
  B	0.76	2	0.26	3.46*	-
  C	1.75	2	0.61		-
  D	0.54	2	0.19		-
  总和ST	8.61	8
  注：-表示无影响；*表示F0.10=(2，6)时的临界值；与F分布表的临界值3.46进行比对，结果因素A、B、C、D的F值均小于3.46，说明各因素对试验结果影响均不显著。

  2.3   酶促反应机理

  以底物果胶浓度为横坐标、还原糖浓度为纵坐标作图，如图 5所示，随着果胶浓度的增加，还原糖含量逐渐增加。当果胶浓度达到一定程度时，还原糖含量不再增加，这时出现了底物过饱和现象，当底物浓度低时，固定化酶分子的活性位点未被底物饱和，但当底物的分子数目增加时，固定化酶分子活性位点和底物结合直至过饱和，固定化酶不再有活性位点可以结合，这时固定化酶充分发挥了作用^[27]。

  图 5

  

  图 5.  底物浓度和产物关系曲线

  Figure 5.  Relationship between substrate concentration and product

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  2.4   固定化果胶酶的稳定性

  游离和固定化果胶酶的稳定性包括四个方面：酸碱稳定性、热稳定性、储存稳定性和循环稳定性。

  2.4.1   酸碱稳定性

  由图 6可知，固定化酶和游离酶的最佳使用pH为4.0。pH高于或低于4.0，两者的酶活力均下降。但是，固定化果胶酶与游离酶相比，在偏酸或偏碱的条件下都能保持更高的酶活力，说明固定化酶具有更好的pH适用范围。

  图 6

  

  图 6.  pH对固定化酶和游离酶的影响

  Figure 6.  Effect of pH on immobilized and free enzymes

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  2.4.2   热稳定性

  由图 7可知，游离酶及固定化酶的最适宜反应温度均为45℃。当温度从45℃升高到60℃时，两者的酶活力均下降，但是游离酶的活性下降较快。在温度为60℃时，固定化酶活力保持在97%。说明与游离酶相比，固定化酶的耐热性更好。因此，固定化过程大大提高了果胶酶的热稳定性。

  图 7

  

  图 7.  温度对固定化酶和游离酶活性的影响

  Figure 7.  Effect of temperature on immobilized and free enzymes

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  2.4.3   储存稳定性

  将固定化酶和游离酶储存于4℃冰箱中，在不同的储存时间对酶活力进行测定。由图 8可知，随着储存时间的延长，固定化酶和游离酶的酶活力逐渐下降。但是在储存25d后，固定化酶活力依然保持在60%左右。因此，果胶酶经固定化后具有更好的储存稳定性。

  图 8

  

  图 8.  储存稳定性

  Figure 8.  Storage stability

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  2.4.4   固定化果胶酶的使用寿命评价

  由图 9可知，随着使用次数的增加，固定化酶活力逐渐下降，在循环使用10次之后酶活力依然保持在80%以上。与游离酶相比，固定化酶体现了可重复利用的优势，提高了果胶酶的重复利用率。

  图 9

  

  图 9.  固定化酶循环使用次数

  Figure 9.  Cycle usage of immobilized enzyme

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  2.4.5   不同载体固定化果胶酶性能评价

  从表 4中可以看出，HPD-750大孔树脂固定化酶循环使用10次之后，酶活力依然保持在80%以上；4℃冰箱保存25d后，酶活力依然保持在60%以上。与D311大孔树脂和合成聚丙烯酰胺载体材料相比，HPD-750大孔树脂固定化酶活力高，操作稳定性好。与海藻酸钠微球相比，HPD-750大孔树脂固定化酶机械性能较稳定，储存稳定性好。通过对影响固定化酶的温度、pH、加酶量、固定化时间等因素的研究，综合考虑酶活力和循环使用寿命以及其他性质(如硬度、机械强度等)，筛选出HPD-750大孔树脂为最佳固定化载体。

  表 4

  

  表 4  固定化酶载体比较

  Table 4.  Comparison of immobilized enzyme carriers

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  	循环 次数	酶活力 保留值 /(U/mg)	储存 时间 /d	相对酶 活力 /%	硬度
  D311树脂	10	2462	25	35	较硬
  聚丙烯酰胺	10	4500	25	54	较差，易碎
  海藻酸钠微球	10	6300	25	57	差，易碎
  HPD-750树脂	10	5143	25	60	较硬

  3.   结论

  以HPD-750为载体固定化果胶酶具有较好的固定化效果。与游离酶相比，固定化果胶酶的pH适用范围更广泛，在pH 3.0~5.5范围内相对酶活力保持在80%以上；固定化酶的热稳定性也有了很大提升，在温度为60℃时，固定化酶活力依然保持在97%。与工业中广泛使用的D311大孔树脂、合成高分子材料聚丙烯酰胺及天然高分子材料海藻酸钠微球的固定化果胶酶的研究结果进行对比，在循环使用10次之后，虽然HPD-750固定化酶活力不是最高，但其仍保持较好的机械性能，且储存25d后，HPD-750固定化酶活力最高，同时树脂保存完整。实验结果表明，以HPD-750为载体的固定化果胶酶的酶活力更高，操作稳定性和储存稳定性更好。由此可见，HPD-750大孔树脂可作为一种效果较好的固定化酶载体，在工业中应用前景广阔。

  
  
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• 

  图 1  pH对果胶酶活力的影响

  Figure 1  Effect of pH on pectinase activity

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  图 2  固定化反应温度对果胶酶活力的影响

  Figure 2  Effect of immobilization reaction temperature on pectinase activity

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  图 3  加酶量对果胶酶活力的影响

  Figure 3  Effect of enzyme amount on pectinase activity

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  图 4  固定化反应时间对果胶酶活力的影响

  Figure 4  Effect of immobilization reaction time on pectinase activity

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  图 5  底物浓度和产物关系曲线

  Figure 5  Relationship between substrate concentration and product

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  图 6  pH对固定化酶和游离酶的影响

  Figure 6  Effect of pH on immobilized and free enzymes

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  图 7  温度对固定化酶和游离酶活性的影响

  Figure 7  Effect of temperature on immobilized and free enzymes

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  图 8  储存稳定性

  Figure 8  Storage stability

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  图 9  固定化酶循环使用次数

  Figure 9  Cycle usage of immobilized enzyme

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  表 1  试验因素水平表

  Table 1.  Experimental factors and levels

  	A 温度/℃	B pH	C 时间/h	D 酶浓度/(g·mL-1)
  1	40	4.5	6	0.16
  2	45	4.0	4	0.14
  3	50	3.5	2	0.18

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  表 2  实验方案与结果

  Table 2.  Experimental scheme and results

  	试验因素				酶活力 /(U·g-1)
  	A	B	C	D
  1	1	1	1	1	4.762
  2	1	2	2	2	4.505
  3	1	3	3	3	4.078
  4	2	2	2	1	5.143
  5	2	1	3	3	3.725
  6	2	3	1	2	5.137
  7	3	1	3	2	3.532
  8	3	2	1	3	4.475
  9	3	3	2	1	4.171
  Ij	13.344	12.019	14.374	14.076
  Ⅱj	14.004	14.123	13.819	13.174
  Ⅲj	12.78	13.386	11.335	12.278
  Rj	1.826	2.104	3.039	1.798

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  表 3  方差分析

  Table 3.  Analysis of variance

  试验条件	偏差平方和	自由度	F值	F临界值	显著性
  A	5.56	2	1.94		-
  B	0.76	2	0.26	3.46*	-
  C	1.75	2	0.61		-
  D	0.54	2	0.19		-
  总和ST	8.61	8
  注：-表示无影响；*表示F0.10=(2，6)时的临界值；与F分布表的临界值3.46进行比对，结果因素A、B、C、D的F值均小于3.46，说明各因素对试验结果影响均不显著。

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  表 4  固定化酶载体比较

  Table 4.  Comparison of immobilized enzyme carriers

  	循环 次数	酶活力 保留值 /(U/mg)	储存 时间 /d	相对酶 活力 /%	硬度
  D311树脂	10	2462	25	35	较硬
  聚丙烯酰胺	10	4500	25	54	较差，易碎
  海藻酸钠微球	10	6300	25	57	差，易碎
  HPD-750树脂	10	5143	25	60	较硬

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