抗坏血酸(Ascorbic acid，AA)即维生素C，在机体的氧化还原代谢反应中具有重要的调节作用。人体内缺乏AA会使胶原蛋白合成受阻，诱发坏血病甚至死亡[1, 2]。然而，AA不能在体内合成，人体的摄入主要来源于蔬菜、水果或维生素C片。因此，准确测定AA的含量，对人体抗老化和疾病预防具有十分重要意义。目前，测定AA的分析方法包括容量滴定法[3]、比色法[4]、高效液相色谱法[4, 5]、电化学法[6, 7]、磷光法[8]、荧光法[9, 10]、表面增强共振拉曼散射法[11]、电化学发光法[12]和流动注射法[13]等。和上述方法相比，比色法因具有分析成本低、步骤简单、肉眼可辨等优点而被广泛采用[14~17]。为了进一步提高方法的灵敏度，各种不同的纳米材料被引入到比色分析中。Li等[15]利用AA的还原性在酸性条件下合成了蓝色的MoO3纳米片，该纳米片的颜色与AA浓度相关，可用于定量检测AA的含量。Tan等[16]以Cu-MOF为前驱体一步合成Cu/C复合物，该复合物具有类过氧化物酶性质，在过氧化氢存在时把3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺(TMB)氧化为蓝色，而AA的加入能阻断此氧化过程，据此建立了一种AA检测新方法。受此启发，Fan等[17]设计了Co3O4/石墨烯微球类酶材料用于AA的检测。上述分析方法在一定程度上提高了AA检测的灵敏度，然而它们仍然存在材料合成步骤复杂或者类酶材料的催化效率不如蛋白酶高效等不足，从而限制了其进一步应用。
近年来，羟基氧化钴纳米片(Cobalt oxyhydroxide nanoflakes，CNF)作为一种二维材料在分析测试领域展现出了广阔的应用前景[18, 19]。CNFs有一定的氧化性，能与强还原性物质反应而导致自身降解[20~23]。Li等[20]首次发现CNFs具有特异性氧化AA的性质，设计了一种基于长余辉稀土荧光纳米复合物荧光信号增强的AA检测新方法。基于同样的设计思路，Li等[21]合成了一种碳量子点修饰的CNFs复合探针用于监测鼠脑中AA的含量。Meng等[22]合成了一种CNFs包覆的双光子荧光纳米探针，用于细胞中AA的双光子成像。Ji等[23]首次发现CNFs可直接氧化TMB变色，据此发展了一种AA比色检测新方法。上述研究主要利用了CNFs被特异性还原降解的性质，借助加入信号探针或显色剂来实现AA的信号读出，而这有可能导致背景信号升高而降低检测灵敏度。此外，由CNFs降解产生的Co2+在信号发生机制中的潜在应用价值关注尚且不够。因此，设计基于CNFs的AA检测新方法仍然具有重要的应用价值。
本文报道了一种基于Co2+介导信号转换AA比色检测新方法。在AA的存在下，CNFs还原成Co2+，Co2+与SCN-强烈螯合形成稳定的蓝色阴离子络合物[Co(NCS)4]2-。利用Co2+和SCN-之间的螯合作用实现信号的转换是一种简便、高效、易于实现的信号产生机制，将为开发新的AA比色检测方法提供有益的借鉴。
HITACHI H-8100透射电子显微镜(TEM，日本日立公司)；Cary 100 UV-Vis分光光度计(美国Varian公司)。
AA(分析纯，购自天津凯通化学试剂有限公司)；维生素C片(100mg/片)购自本地药房；吐温-80(Tween-80，上海国药试剂有限公司)；氯化钴(CoCl2)、次氯酸钠、硫氰酸铵(NH4SCN)等试剂均为分析纯级，购自天津市大茂化学试剂厂，使用时未经进一步纯化。实验用水为三重蒸馏水。AA(0.1mol/L)、Tween-80(10(wt)%)、NH4SCN (3mol/L)均用三重蒸馏水配制并放置于4℃冰箱备用。
根据文献[20, 22]报道的方法合成CNFs，具体步骤为：将125μL 1mol/L的NaOH溶液加入到500μL 10mmol/L CoCl2溶液中，混合液超声处理1min。然后，将25μL 0.9mol/L次氯酸钠溶液加入到混合液中，继续超声处理10min。所得产物用蒸馏水重复离心洗涤三次，最后分散在1mL水中。
20μL的CNFs悬浮液和180μL不同浓度的AA溶液在离心管内混合反应5min，先后加入80μL Tween-80和30μL NH4SCN，补加蒸馏水至500μL，混匀，立即测量625nm处的吸收值。所有测试均在室温下进行。
将20μL CNFs悬浮液分别与葡萄糖(Glu)、果糖(Flu)、蔗糖(Suc)、乳糖(Lac)、多巴胺(DA)和谷胱甘肽(GSH)等潜在干扰物在离心管中混合，反应5min后依次加入80μL Tween-80和30μL NH4SCN。最后，补加蒸馏水至500μL，立即测定625nm处的吸收值。干扰物的终浓度均为3mmol/L。作为对照，AA终浓度为0.4mmol/L。
取一片维生素C片剂在研钵中研磨成粉末，溶于100mL水中，其AA的理论含量为5.68mmol/L。分别吸取10μL维生素C片剂溶液与低、中、高三个浓度水平的AA标准溶液混合，然后分别吸取20μL CNF悬浮液添加到上述混合物中，反应5min后依次添加80μL Tween-80和30μL NH4SCN到混合物中，补加蒸馏水至500μL。最后，立即测定625nm处的吸收值，每个浓度平行进行6次，计算回收率。
实验合成的CNFs的TEM形貌如图 1所示，所得材料呈片状六边形结构，边长约60nm，其形貌与文献报道一致[20, 22, 23]。UV-Vis谱中CNFs在406nm处有一强吸收峰(图 1(C))，可归属为β-CoOOH的特征吸收[24]。上述结果表明CNFs被成功合成。
CNFs能够特异性地将AA氧化成脱氢抗坏血酸，而自身被还原降解释放出Co2+，这为设计基于Co2+介导的信号转换AA比色分析新方法提供了可能。基于上述设想的AA分析原理如图 2所示。在没有目标分子AA存在时，CNFs不被降解，没有Co2+释放出来，加入NH4SCN和Tween-80后不能形成蓝色的阴离子络合物[Co(SCN)4]2-，在625nm处没有明显的吸收信号产生[25]。向CNFs溶液中加入AA后，二者发生氧化还原反应，AA被氧化成脱氢抗坏血酸，CNFs被还原降解而释放出大量的Co2+，加入Tween-80和NH4SCN后，Co2+与NH4SCN电离出的硫氰酸根离子(SCN-)形成[Co(SCN)4]2-络合物而显蓝色，在625nm处产生明显的吸收信号，从而实现了基于Co2+介导的信号转换的AA比色测定。如图 3所示，CNFs水溶液呈黄褐色(图 3插图a)，在考察的光谱范围内有弱且平缓的吸收(图 3曲线1)；向CNFs水溶液中加入AA后，溶液迅速变为无色(图 3插图b)，此时CNFs的吸收消失(图 3曲线2)，证明CNFs与AA发生反应而降解。没有AA存在时，向CNFs溶液中加入Tween-80和NH4SCN，混合液颜色变化不大(图 3插图c)，在625nm处呈现较弱的吸收信号(图 3曲线3)。当向CNFs溶液中先后加入AA、Tween-80和NH4SCN后，混合溶液首先变无色，随后迅速变蓝(图 3插图d)，在625nm处产生较强的吸收信号(图 3曲线4)。上述实验结果清楚地表明，钴离子可以作为一种信号转换单元用于AA的比色分析，证实了实验提出的检测原理的可行性。
为了达到最优的分析性能，实验首先对CNFs与AA的反应时间进行了优化。如图 4(A)所示，当二者反应时间为5min时，CNFs与AA的反应基本达到平衡，继续增加反应时间，625nm处的吸收信号增加不大。因此，在后续实验中选择CNFs与AA反应的优化时间为5min。由于NH4SCN电离出的SCN-和Co2+形成显蓝色的阴离子络合物[Co(NCS)4]2-，实验考察了NH4SCN加入量的影响。当NH4SCN的加入体积达到30μL时(图 4(B))，体系响应信号基本达到最大值。然而[Co(SCN)4]2-在稀的水溶液中易水解而不稳定，导致体系变色不明显，非离子表面活性剂Tween-80的加入可使其在水溶液中稳定存在，有利于提高显色灵敏度[26]。如图 4(C)所示，当Tween-80的加入量增加到80μL时，体系在625nm处的吸收值达到最大。因此，在后续实验中选择NH4SCN和Tween-80的加入体积分别为30μL和80μL。
在优化的条件下，实验考察了所提出方法对AA的分析性能。图 5(A)为加入不同浓度的AA时体系的吸收光谱。随着AA浓度在0~3.00 mmol/L之间逐渐增加，体系在625nm处的吸收信号相应地增强。图 5(B)插图给出了AA的定量分析校正曲线，在0.03~0.45 mmol/L浓度范围内，体系在625nm处的吸收强度和AA的浓度成线性关系，线性方程为A625nm=0.638c(mmol/L)+0.042，相关系数R=0.993，信噪比为3时检出限为1.5μmol/L。
为评估分析方法对AA的特异性，考察了蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖等还原性糖类以及多巴胺、谷胱甘肽等还原性分子的潜在干扰影响。如图 6所示，尽管所加干扰物的浓度高于AA，其在625nm处未产生明显的吸收信号；相反，在AA存在下检测体系的吸收信号显著增强。实验结果表明检测体系吸收信号的增强是由AA特异性引起的，证明了该方法对AA的高选择性，有望用于复杂体系中AA的监测。
以当地药房购买的维生素C片剂为基质，通过测定在维生素C片剂溶液中加入的不同浓度AA的含量，验证所提方法的实用性与可靠性。测试结果根据回归方程计算，列于表 2。实验测试的回收率在93.5%~109.4%之间，RSD为4.3%~7.8% (n=6)。上述结果表明，本文所提出的AA比色分析新方法具有较高的准确性和实用性。
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| 方法 | 线性范围 | 检出限/(μmol/L) | 参考文献 |
| Electrochemistry | 0.5~95μmol/L | 0.31 | [6] |
| Electrochemiluminescence | 3.77~26.4μmol/L | 0.29 | [12] |
| Flow Injection | 2.84~28.4μmol/L | 0.40 | [13] |
| Colorimetry | 1~100mmol/L | 90.0 | [15] |
| Colorimetry | 0.01~1mmol/L | 1.41 | [16] |
| Colorimetry | 30~140μmol/L | 0.19 | [17] |
| Fluorometry | 1~100μmol/L | 0.59 | [20] |
| Fluorometry | 0.1~20μmol/L | 0.05 | [21] |
| Fluorometry | 1~20μmol/L | 0.17 | [22] |
| Colorimetry | 0.5~50μmol/L | 0.14 | [23] |
| Colorimetry | 30~450μmol/L | 1.5 | 本工作 |
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| 编号 | 加入量/(mmol/L) | 回收量/(mmol/L) | 回收率/% | RSD/% |
| 1 | 0.00 | 0.12 | 109.4 | 7.8 |
| 2 | 0.10 | 0.20 | 93.5 | 4.3 |
| 3 | 0.20 | 0.33 | 103.6 | 6.5 |
本文提出了一种基于Co2+介导信号转换AA比色分析新方法。本方法充分利用了CNFs的氧化性和Co2+与SCN-之间强的螯合作用，对AA具有高的灵敏度和选择性，检测限为1.5μmol/L。这种比色分析新方法具有操作简单、成本低廉和易于实施的优势，有望为与AA相关的食品检测和临床诊断提供技术支持。
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图 1 羟基氧化钴的透射电镜表征(A, B)和紫外-可见吸收表征(C)
Figure 1 Transmission electron microscopy images (A), (B) and UV-Vis absorption spectrum (C) of the synthesized CNFs
图 3 CNFs(曲线1)、CNFs+AA(曲线2)、CNFs+SCN-+Tween-80(曲线3)和CNFs+SCN-+Tween-80+AA(曲线4)的可见吸收光谱(AA的浓度为1mmol/L)，插图中光学照片a、b、c、d分别对应曲线1、2、3、4
Figure 3 UV-Vis absorption spectra of CNFs(line 1); CNFs+AA(line 2), CNFs+SCN-+Tween-80(line 3) and CNFs+SCN-+Tween-80+AA(line 4). The inset optical photographs of a, b, c and d correspond to the lines of 1, 2, 3 and 4, respectively. The concentration of AA is 1 mmol/L
图 4 实验条件的优化(AA的终浓度均为1mmol/L)：(A) CNFs与AA反应时间的影响，NH4SCN和Tween-80加入体积分别为50和100μL；(B) NH4SCN加入体积的影响；(C) Tween-80加入体积的影响
Figure 4 Optimization of experimental conditions: (A) Influence of incubation time between CNFs and AA, where the volume of ammonium thiocyanate and Tween-80 are 50 μL and 100 μL, respectively; Influence of ammonium thiocyanate (B) and Tween-80(C). The final concentration of AA is 1 mmol/L
图 5 (A) 不同浓度AA下体系的吸收光谱；(B)625nm处的吸光度与AA浓度的关系曲线，插图为线性校正曲线
Figure 5 (A) Absorption spectra of the detection system in the presence of different concentrations of AA; (B) Curve of colorimetric signal (A625nm) versus the concentration of AA, inset is the calibration curve for AA
表 1 方法检出限比较
Table 1. Comparison of detection of limit
| 方法 | 线性范围 | 检出限/(μmol/L) | 参考文献 |
| Electrochemistry | 0.5~95μmol/L | 0.31 | [6] |
| Electrochemiluminescence | 3.77~26.4μmol/L | 0.29 | [12] |
| Flow Injection | 2.84~28.4μmol/L | 0.40 | [13] |
| Colorimetry | 1~100mmol/L | 90.0 | [15] |
| Colorimetry | 0.01~1mmol/L | 1.41 | [16] |
| Colorimetry | 30~140μmol/L | 0.19 | [17] |
| Fluorometry | 1~100μmol/L | 0.59 | [20] |
| Fluorometry | 0.1~20μmol/L | 0.05 | [21] |
| Fluorometry | 1~20μmol/L | 0.17 | [22] |
| Colorimetry | 0.5~50μmol/L | 0.14 | [23] |
| Colorimetry | 30~450μmol/L | 1.5 | 本工作 |
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表 2 实际样品中AA的回收实验
Table 2. Recovery experiment of AA in real samples
| 编号 | 加入量/(mmol/L) | 回收量/(mmol/L) | 回收率/% | RSD/% |
| 1 | 0.00 | 0.12 | 109.4 | 7.8 |
| 2 | 0.10 | 0.20 | 93.5 | 4.3 |
| 3 | 0.20 | 0.33 | 103.6 | 6.5 |
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