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• 谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的具有生物活性的小肽类物质^[1]。GSH能够保护红细胞膜上蛋白质的巯基处于还原状态，防止溶血，还可以保持其正常发挥运输氧的能力，能够与进入机体的有毒化合物(如丙烯腈、氟化物、一氧化碳)、重金属离子等直接结合，将其转化为无害的物质并排出体外，起到中和解毒的作用^[2]。鉴于其在维持生命运行中起着非常重要的生理作用，GSH作为药物已广泛应用于临床慢性肝病的保肝治疗^[3]。因此建立快速直观的GSH含量测定方法无论是在药物质量控制还是临床使用中都具有重要意义。

  当前GSH含量测定的方法有多种，包括HPLC法^{[4, 5]}、毛细管电泳法^[6]、酶循环法^[7]、电化学法^[8]、分光光度法^[9]以及近来发展的荧光猝灭-恢复法^[10]等。这些方法或多或少地存在样品前处理复杂、操作耗时、仪器价格昂贵等的不足。相对于这些方法，酶法具有特异性强、定量准确、快速简便等特点而优势明显。然而其不足之处是天然的生物酶易受外界环境影响失活而导致定量不准。因此，开发天然酶的替代品或构建稳定性强的模拟酶是GSH含量测定的可行方向。

  近年来，随着纳米材料研究的不断深入，纳米酶作为一类新型的模拟酶材料具有制备简便、性质稳定、催化活性高、环境耐受性强等优点，被广泛应用到各种基于酶法物质的含量测定中^[11]。其中氧化石墨烯(GO)是一类具有优良的类过氧化物酶活性的二维纳米材料^[12]，可在H₂O₂存在下与底物3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺(TMB)快速反应生成蓝色产物；加之它简单易制且非常稳定，其在模拟酶功能的可视化检测方面潜力巨大[^13~15]。GSH具有可还原H₂O₂从而抑制催化反应发生的性质。本研究拟利用该性质，把GSH引入GO催化H₂O₂和TMB的反应中，通过抑制催化反应产物进行间接定量，构建GSH的可视化含量测定方法。

  1.   实验部分

  1.1   仪器与试剂

  Phenix UV1700PC型紫外分光光度计；SIL-20A型液相色谱仪；Inert Sustain系列C₁₈反相色谱柱；Qilinbeier Vortex-5涡旋混合器；H²O³-PRO保温计量槽；Sartorius PB 10型pH计。

  羧基化氧化石墨烯(GO-COOH，先丰纳米材料科技有限公司)；3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺(TMB，上海源叶生物科技有限公司)；L-还原型谷胱甘肽标准品(L-GSH，北京拜尔迪生物技术有限公司)；谷胱甘肽片(0.1g，重庆药友制药有限责任公司，批号18040250)；色谱级甲醇(Thermo Fisher)；谷氨酸(Glu)、L-组氨酸(L-His)、L-苯丙氨酸(L-Phe)、亮氨酸(Leu)、α-丙氨酸(α-Ala)、酪氨酸(Tyr)、L-天冬氨酸(L-Asp)均购自惠兴生化试剂有限公司。实验过程中所用化学试剂除特殊说明外，均为分析纯。实验用水为超纯水。

  GO-COOH纳米酶溶液的制备：取2mL GO-COOH溶液(2mg/mL)，混悬于6mL水中，超声1h，即得。

  GSH片的处理及片剂溶液的制备：取GSH片研细，精密称取细粉加入100mL容量瓶中，加适量水，超声溶解后稀释并定容。使用滤纸过滤后，续滤液再次使用0.45μm滤膜过滤，稀释5倍即得。

  1.2   实验过程

  1.2.1   GO-COOH过氧化物酶活性及GSH抑制过氧化物酶活性

  参照文献^[11]条件，设置三组反应。类过氧化物酶活性反应组：在370μL醋酸缓冲液(pH 4，25mmol/L)中，依次加入40μL 0.5mg/mL GO-COOH溶液、50μL 250mmol/L H₂O₂溶液和40μL 10mmol/L TMB溶液(反应体系总体积为500μL)，充分混合均匀后，在35℃条件下反应10min，波长652nm下测量吸光度，平行测定3次，取平均值；空白对照组：以醋酸缓冲液代替GO-COOH溶液，其他条件同上；GSH抑制反应组：在与反应组相同的体系内加入25μL GSH标准品溶液，其他条件同上。比较三组反应的变色情况及吸光度值关系。

  1.2.2   谷胱甘肽标准曲线的绘制

  配制不同浓度梯度的GSH标准品。在345μL醋酸缓冲液中加入25μL各浓度的GSH标准品溶液、40μL 0.5mg/mL GO-COOH溶液、50μL 10mmol/L H₂O₂溶液和40μL 10mmol/L TMB溶液混合，优化条件下反应后，按照1.2.1方法测定吸光度值。

  1.2.3   实际样品的测定

  采用标准添加法测量实际样品。在320μL醋酸缓冲液中加入25μL各浓度的GSH标准溶液与40μL 0.5mg/mL GO-COOH溶液、50μL 10mmol/L H₂O₂溶液、40μL 10mmol/L TMB溶液混合，同时加入25μL GSH片剂溶液，混合后优化条件下反应，按1.2.1方法测定吸光度值。

  1.2.4   液相色谱方法

  采用C₁₈色谱柱(4.6×250mmol/L，5μmol/L)，流动相A为三蒸水，流动相B为甲醇，4%甲醇等度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长210nm，进样体积20μL。将各浓度梯度的GSH标准品溶液过滤后进样，以GSH浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线并考察线性。

  2.   结果与讨论

  2.1   GO-COOH的纳米酶活性及GSH对催化反应的抑制

  以GO-COOH为纳米酶，H₂O₂和TMB为底物，GSH为抑制物，考察了纳米酶的催化反应以及GSH对催化反应的抑制情况。如图 1所示，a、b、c三条曲线分别对应图片中a、b、c三个反应，可见没有GO-COOH时溶液是透明的，表明催化反应无法发生(a)；加入GO-COOH后，由于其类过氧化物酶活性可将H₂O₂催化为羟基自由基进而氧化TMB，生成蓝色产物(b)；在反应体系中进一步加入GSH后，由于GSH会还原部分H₂O₂而降低其含量，从而导致产物颜色明显变浅(c)。

  图 1

  

  图 1.  GO-COOH的过氧化物酶活性以及加入GSH后的抑制情况

  (a) TMB+H₂O₂+GSH+醋酸缓冲液；
  (b) GO-COOH+TMB+H₂O₂+醋酸缓冲液；
  (c) GO-COOH+TMB+H₂O₂+GSH+醋酸缓冲液

  Figure 1.  The peroxidase activity of GO-COOH and inhibition effect in the presence of GSH

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  2.2   反应条件优化

  2.2.1   反应时间的选择

  考察了反应时间对吸光度的影响，结果如图 2所示。可发现吸光度值随时间的延长而增加，在10min后变化减缓。因此反应时间设定为10min。

  图 2

  

  图 2.  吸光度随反应时间变化曲线

  Figure 2.  The time-dependent absorbance changes of the inhibition system

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  2.2.2   pH选择

  考察不同pH对反应体系的影响，结果如图 3所示。在pH 4时吸光度差值最大，因此选用pH 4为测定反应条件。

  图 3

  

  图 3.  pH对抑制反应的影响

  Figure 3.  pH effects of the inhibition system

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  2.2.3   H₂O₂的优化

  鉴于该反应的基本原理是基于GSH消耗反应体系中的H₂O₂从而抑制催化反应的发生，因此对H₂O₂浓度进行了优化。结果如图 4所示，H₂O₂浓度为0.5mmol/L时抑制率最大，但由于H₂O₂浓度在0.5mmol/L时吸光度值总体偏小，不利于后续的检测，因此最终选用的H₂O₂浓度为1mmol/L。

  图 4

  

  图 4.  H₂O₂浓度对反应的影响

  Figure 4.  Effect of hydrogen peroxide concentration on GSH detection

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  2.3   标准曲线的绘制

  配制不同浓度的GSH标准品溶液，按1.2.2方法测定吸光度值并绘制线性曲线。结果如图 5(a)所示，GSH在1~50 μmol/L范围内时线性关系良好，相关系数r为0.9934。与其他方法相比^{[4, 5, 7]}，纳米酶法具有操作简单、分析速度快、成本低的优势，并且线性检测范围有所扩大。通过颜色的变化，可进行可视化直观的含量检测。

  图 5

  

  图 5.  GSH的标准曲线(a)及变色情况(b)

  Figure 5.  Linear calibration plot for detection of GSH(a) and color variation (b)

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  2.4   干扰试验

  选取各种类型的氨基酸进行干扰试验。其中GSH的反应浓度为50μmol/L，而干扰氨基酸的反应浓度为500μmol/L，结果如图 6所示。包括谷氨酸在内的7种常见氨基酸不会干扰反应的发生，表明该催化反应具有良好的选择性。

  图 6

  

  图 6.  检测GSH的选择性

  Figure 6.  Selectivity for detection of GSH

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  2.5   实际样品的测定

  在上述线性范围内采用标准添加法对实际样品GSH片剂进行含量测定，同时利用液相色谱方法进行对比，结果如表 1所示。纳米酶法测定的结果与理论值的相对误差为1.8%。液相法测量的GSH片剂浓度为20.84μmol/L，二者均处于可接受范围内。向片剂溶液中添加GSH标准品溶液，测定后计算回收率，结果均符合要求。

  表 1

  

  表 1  GSH片含量测定结果

  Table 1.  Results of GSH content determination

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  	理论值/(μmol /L)	纳米酶法/(μmol /L)	相对误差/%	添加量/(μmol /L)	测得量/(μmol /L)	回收率/%
  GSH片剂	20.00	19.64	1.80	30.00	50.97	104.4
  				30.00	48.59	96.5
  				20.00	41.74	110.5
  				20.00	37.33	88.4

  3.   结论

  利用GO-COOH的类过氧化物酶活性，以及GSH定量抑制酶促反应的特点，成功地建立了GSH制剂含量测定的新方法。相关研究为纳米酶开拓新应用的同时，也为制剂的含量测定提供了新的思路。

• 1. [1]

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  图 1  GO-COOH的过氧化物酶活性以及加入GSH后的抑制情况

  Figure 1  The peroxidase activity of GO-COOH and inhibition effect in the presence of GSH

  (a) TMB+H₂O₂+GSH+醋酸缓冲液；
  (b) GO-COOH+TMB+H₂O₂+醋酸缓冲液；
  (c) GO-COOH+TMB+H₂O₂+GSH+醋酸缓冲液

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  图 2  吸光度随反应时间变化曲线

  Figure 2  The time-dependent absorbance changes of the inhibition system

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  图 3  pH对抑制反应的影响

  Figure 3  pH effects of the inhibition system

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  图 4  H₂O₂浓度对反应的影响

  Figure 4  Effect of hydrogen peroxide concentration on GSH detection

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  图 5  GSH的标准曲线(a)及变色情况(b)

  Figure 5  Linear calibration plot for detection of GSH(a) and color variation (b)

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  图 6  检测GSH的选择性

  Figure 6  Selectivity for detection of GSH

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  表 1  GSH片含量测定结果

  Table 1.  Results of GSH content determination

  	理论值/(μmol /L)	纳米酶法/(μmol /L)	相对误差/%	添加量/(μmol /L)	测得量/(μmol /L)	回收率/%
  GSH片剂	20.00	19.64	1.80	30.00	50.97	104.4
  				30.00	48.59	96.5
  				20.00	41.74	110.5
  				20.00	37.33	88.4

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