石英晶体微天平传感器及其在生物检测中应用的研究进展

姜鹏飞 杨鸿成 季晨阳 陈柱 聂立波

引用本文: 姜鹏飞, 杨鸿成, 季晨阳, 陈柱, 聂立波. 石英晶体微天平传感器及其在生物检测中应用的研究进展[J]. 化学通报, 2018, 81(2): 129-133. shu
Citation:  Jiang Pengfei, Yang Hongcheng, Ji Chenyang, Chen Zhu, Nie Libo. Progress in Quartz Crystal Microbalance and Its Application in Biological Detection[J]. Chemistry, 2018, 81(2): 129-133. shu

石英晶体微天平传感器及其在生物检测中应用的研究进展

    通讯作者: 聂立波, 女, 教授, 主要从事生物检测技术及纳米生物医学材料的研究, E-mail:libonie@aliyun.com
  • 基金项目:

    湖南省自然科学基金项目(2016JJ3053)和湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目(201711535035)资助

摘要: 石英晶体微天平(Quartz crystal microbalance,QCM)是一种具有灵敏度高、免标记、可实时在线检测等优点的重要分析工具。在生物检测领域,QCM与多种信号放大方法相结合,广泛应用于对生物分子的高灵敏检测。新型耗散型QCM(QCM-D)通过对薄膜厚度、粘弹性等的研究,主要用于考察生物分子的吸附分离、构型变化等微观过程。本文主要阐述了QCM及QCM-D生物传感器的构建及其在DNA、蛋白质、细胞和微生物检测中的研究进展。

English

  • 石英晶体微天平(Quartz crystal microbalance,QCM)发展于20世纪60年代初,由石英晶体传感器、信号检测和数据处理等部分组成。最初QCM被用来检测真空或空气条件下刚性薄膜的厚度,后来经过人们的不断研究与探索,使QCM在液相传感体系中得以应用,并引起了各界研究人士对QCM应用领域的深入开发。QCM具有检测成本低、免标记、灵敏度高和可实时在线等特点,深受人们的青睐,被广泛应用于化学、生物、医学、物理、环境等各个领域。

    QCM的原理是基于石英晶体的压电效应[1]。向石英晶体施加机械作用力时,晶体就会在施力的方向上产生电势,形成电场;而将电场施加到石英晶体上时,晶体就会产生机械振动,这就是压电效应。能产生压电效应的晶体具有各向异性。当振动的频率和石英晶片的固有频率一致时,便会产生共振,此时振动最稳定。因此,石英晶片表面吸附物质后,晶体的共振频率发生改变,QCM就是通过这一频率变化来检测物质质量的。

    1959年,Sauerbrey方程[2]的提出解释了石英晶体表面沉积物的质量与晶体振动频率之间的关系:

    $ \Delta f_{\rm m} = - \frac{{f^2_0\Delta m}}{{F_{\rm q}\rho _{\rm q}A}} $

    其中,f0为石英晶体的基频频率,ρqA分别为石英芯片的密度和有效面积,Fq为石英晶体的频率常数,Δm为石英晶体电极表面吸附物质的质量变化,Δfm为振动频率的变化。由式(1)可以看出,晶体表面沉积物的质量变化与晶体的振动频率变化成正比,但该方程只适用于对真空中刚性薄膜的研究。

    1980年,Konash等[3]首次使用QCM在液相体系中进行研究,通过改进电路,使得传感器稳定地在液相体系中振荡。1985年,Kanazawa等[4]提出了液相为牛顿流体时的经验公式:

    $ \mathit{\Delta} {f_1} = - {n^{1/2}}f^{3/2}_0{({\eta _1}{\rho _1}/\pi \mu _{\rm q}\rho _{\rm q})^{1/2}} $

    其中,η1为石英晶体表面液相层的粘度,ρ1为液相层的密度,μq为石英晶体的剪切模量。该式的建立实现了QCM在液相中的应用。Cooper等[5]将(1)、(2)两式结合,给出了石英晶体在液相传感体系中的频率变化与其表面附着物的质量变化之间关系的经验公式:

    $ \mathit{\Delta} f = - f^2_0\left( \frac{\mathit{\Delta} m}{F_{\rm q}\rho _{\rm q}A} +\sqrt {\frac{{{\eta _1}{\rho _1}}}{{{f_0}\pi \mu _{\rm q}\rho _{\rm q}}}} \right) $

    1996年,Rodahl等[6]运用Navier-Stokes方程解出了有关液相耗散因子变化(ΔD)的方程:

    $ \Delta D = 2{({f_0}/n)^{1/2}}{(\eta {Q_1}/\pi \mu Q_{\rm q})^{1/2}} $

    由此,耗散型石英晶体微天平(Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring,QCM-D)得到快速发展。与传统的QCM技术相比,QCM-D是一种可同时在线监测石英晶体电极表面附着物的质量变化和粘弹性变化的技术,其应用范围也更加广泛。

    由于QCM具有灵敏度高、免标记和可实时在线监测等优点,在生物传感检测中应用广泛,常用于基因、蛋白质、细胞、微生物等的检测和研究。

    目前,QCM已广泛应用于DNA检测,为提高检测灵敏度,研究者通过各种放大方法对信号进行放大。Zhao等[7]开发了一种基于DNA-链酶亲和素树枝状三维结构放大体系的QCM核酸传感器,两种DNA-链酶亲和素通过桥接探针交替杂交,在石英金电极上层层组装形成DNA-链霉亲和素树枝状三维结构,其对P53基因片段的检出限为0.4nmol/L。结合纳米粒子来增加石英芯片的表面质量也是一种有效的放大方法。Zhou等[8]直接在基因链上通过吸附沉积银纳米簇以达到QCM频率信号放大的目的。游离的银离子和靶基因通过静电吸附结合在一起,经过氢醌还原后,银单质吸附沉积到基因链上形成银纳米簇,该方法对目标基因的检出限可达100pmol/L。最近,Liu等[9]基于原位选择性结晶开发了一种新型的超灵敏QCM生物传感体系。如图 1所示,修饰有羧基的报告探针结合Ca2+后,与(NH4)2CO3在电极表面形成CaCO3晶体,极大地提高了检测灵敏度;用末端烷基硫醇进行芯片的封板处理,可以有效抑制非特异性结晶,保证高特异性,对目标基因的检出限可高达2amol/L。

    图 1

    图 1  基于原位选择性结晶的QCM生物传感体系[9]
    Figure 1.  QCM biosensor system based on in-situ selective crystallization[9]

    可以看出,QCM信号放大策略可以结合生物方法和非生物方法,它们都能有效提高检测灵敏度。但一般来说,生物方法的步骤较为繁琐,而非生物方法成本较高,所以开发出成本低、操作简便的信号放大方法是QCM检测的发展方向之一。

    QCM-D传感器在DNA检测中多用于DNA延伸、粘弹性及构型变化等微观过程的研究。Stengel等[10]使用QCM-D对寡核苷酸引物的酶促延伸进行了分析,结果表明,即使低含量DNA聚合酶的存在也会影响频率变化和质量变化之间的线性关系。Trtos等[11]通过对DNA杂交过程中QCM声波能量的耗散和频率变化之比(ΔDf)进行分析,可测出DNA的特定特征,如弯曲角度、长度等,也可区分目标产物是否为特异性结合而非副产物。此外,由于QCM-D技术具有操作简便、灵敏度高等优势,可与其他检测方法联用成为研究微观过程的有效手段。Sun等[12]结合QCM-D和表面等离子体共振(SPR)技术对534个碱基对的连锁顺序杂交进行监测,并展示了如何通过Voigt模型对DNA薄膜和聚合物薄膜的厚度和粘弹性进行评估。

    在蛋白质检测中同样须通过放大方法来增加QCM芯片表面的质量以提高检测灵敏度。三明治夹心测定法是蛋白质检测常用的一种方法,再结合其他信号放大方法,如生物催化沉淀(BCP),可以显著增强QCM检测信号。Akter等[13]开发了基于磁珠辅助双酶催化的高灵敏度QCM免疫传感器,采用修饰有磁珠的抗体与靶蛋白在石英芯片表面形成三明治结构以放大信号,并通过大量附着在磁珠上的辣根过氧化物酶(HRP)和葡萄糖氧化酶(GOx)增强4-氯-1-萘酚(CN)的沉淀进行第二次信号放大,此方法对人免疫球蛋白G(hIgG)的检出限为5.0±0.18pg/mL。Deng等[14]基于氧化石墨烯(GO)构建了QCM免疫传感器,结合石墨烯的吸附作用以及HRP对4-氯-1-萘酚的催化作用,生成的沉淀使共振频率大幅度下降,对兔免疫球蛋白检测的线性范围为0.1ng/mL~10μg/mL。由此可见,生物催化沉淀信号放大方法可以显著提高QCM传感器的灵敏度,且过程简单、反应时间短,这种方法也可以用于其他生物分子的检测,是一种非常有效的信号放大方法。

    在非生物放大方法中,大多利用纳米粒子的自身质量来增大QCM芯片表面的质量。Luo等[15]利用QCM对损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVEC-C)释放的可溶性血栓调节蛋白(TM)进行检测。利用空间位阻效应,结合在芯片表面的金纳米颗粒的量由靶蛋白浓度决定,对血栓调节蛋白的检出限可达2ng/mL。最近,Liao等[16]提出了一种新的QCM检测信号放大方法,如图 2所示,结合磁珠和外部磁场来增大石英芯片的共振频率变化。未施加外部磁场时,对癌胚抗原的检出限为0.86ng/mL,施加外部磁场后,检出限可达0.013ng/mL。这种利用磁场效应来放大信号的方法过程简单易控,且成本较低。

    图 2

    图 2  基于磁珠的QCM免疫传感器示意图[16]
    Figure 2.  Schematic illustration of QCM immune sensor based on magnetic bead[16]

    酶是生命体新陈代谢不可或缺的一部分,在对酶进行检测时,纳米粒子和生物催化沉淀同样是非常理想的信号放大手段。Stoytcheva等[17]构建了一种新型QCM传感器,采用Ag纳米颗粒负载的明胶沉积在QCM芯片表面作为胰蛋白酶底物,对胰蛋白酶活性进行评估。在胰蛋白酶底物降解期间,较重的银纳米颗粒会随着降解产物一起从敏感层分离,导致芯片表面质量急剧降低,引起QCM频率信号的响应,对胰蛋白酶的检出限可达7.5×10-4U/mL。Zhang等[18]构建了QCM-溶菌酶传感体系,结合滚环扩增(RCA)和生物催化沉淀两种有效的放大方法,对目标蛋白的检出限可达到0.3fmol/L。

    QCM-D在蛋白质检测中主要用于蛋白质构象、吸附等方面的研究。Fernández等[19]利用QCM-D研究4种不同羟基磷灰石粉末上的纤维连接蛋白和纤维蛋白原的吸附和构象变化,结果表明,在羟基磷灰石的合成样品上吸附的蛋白质较多并会产生扩展构象。Phan等[20]结合QCM-D技术和椭圆偏振光谱法研究了牛血清白蛋白在各种自组装单分子层表面的吸附和分离情况,包括中性、带电亲水性和疏水性表面,结果显示,牛血清白蛋白对带电的表面表现出较强的吸附特性。

    QCM在细胞检测中多用于细胞浓度的测定。Zhou等[21]在磁性纳米粒子表面修饰透明质酸,与细胞膜表面过表达的CD44受体特异性结合,筛选并分离人急性淋巴白血病细胞(CCRF-CEM),应用QCM进行检测,检出限为8×103cells/mL。Zhang等[22]构造了QCM细胞传感器,结合叶酸和壳聚糖,利用QCM检测乳腺癌细胞(MCF-7),检出限为430cells/mL。Shan等[23]基于经典的“金标银染”信号放大方法构建了QCM细胞传感器,如图 3所示,在CCRF-CEM被修饰有氨基苯硼酸的金纳米颗粒(APBA-AuNPs)标记后,还原的银单质吸附聚集在AuNPs表面,从而增大芯片表面质量,对CCRF-CEM细胞的检出限为1160cells/mL。

    图 3

    图 3  用于分析白血病细胞的QCM生物传感器示意图[23]
    Figure 3.  Schematic representation of the fabrication of the QCM biosensor for analysis of the leukemia cells[23]

    QCM-D能够以一种动态的、无标记、非侵入的方式监测细胞的吸附脱附、构型变化等相互作用。Chronaki等[24]采用QCM-D技术对正常甲状腺和间变性甲状腺癌细胞的粘附模式进行了研究。Kao等[25]利用QCM-D记录石英晶片表面的频率和能量耗散变化,分析了晶片表面电位对NIH3T3细胞模型的粘附动力学的影响。结果表明,细胞较容易吸附在表面电位较高的晶片上,而对于表面电位较低的晶片,会更多地沉积ECM蛋白,然后细胞通过ECM层进行吸附。Zhu等[26]利用QCM-D检测脂质囊泡和骨髓基质干细胞的动态吸附行为,不同的粘附性能由ΔDf表征,结果显示,脂质双分子层在一定程度上阻止了细胞粘附,RGD功能化的脂质双分子层促进了细胞的粘附。Stratton等[27]使用QCM-D技术对前列腺癌细胞(PC3)的微泡释放进行研究,证实了BzATP对PC3细胞具有刺激作用并使其释放微泡,通过计算得出每个微泡的质量为0.24pg。

    相比DNA和蛋白质,微生物本身的质量要大得多。QCM传感器在微生物检测应用中,在保证特异性和灵敏度的同时,多追求实现省时、高效检测。Hong等[28]提出了一种用于快速检测嗜水气单胞菌的QCM免疫传感体系,检测时间仅需5min,且特异性好,对嗜水气单胞菌的检出限为6×106CFU/mL。Farka等[29]对快速检测微生物的QCM免疫传感器进行了研究,分析结果表明,通过Sulfo-SMCC将抗体结合到芯片上,可以在10min内对大肠杆菌菌株做出检测,检出限为8×104CFU/mL。Masdor等[30]研究了基于三明治金纳米粒子放大技术的QCM免疫传感体系,其对空肠弯曲杆菌的检出限为150CFU/mL,与未经纳米材料放大的检测方法相比,灵敏度得到了极大提高,但检测速度相对较慢。

    在细菌粘附研究方面,Wang等[31]通过QCM-D研究不同糖共聚物表面的细菌粘附,结果表明,铜绿假单胞菌PAO1比大肠杆菌K-12更能粘附在具有强接触点硬度的糖聚合物表面上,其对糖聚合物的附着高度依赖于钙离子的存在。

    检测灵敏度是生物传感器最重要的性能之一,研究者常通过各种信号放大方法来提高检测灵敏度。近年来,QCM作为一种免标记、高灵敏度的质量检测仪器,结合金纳米颗粒、磁性纳米粒子、银纳米簇等纳米放大方法以及酶催化等生物放大方法,已开发和构建出多种超灵敏传感体系,使QCM检测灵敏度不断提高,这对疾病的早期诊断与预防有着重要意义。QCM-D的出现,使QCM不再局限于单纯的质量检测,可进一步对生物分子的表面吸附与脱附、表面反应、构型变化以及流体粘弹性等微观行为进行研究。近几年关于QCM-D技术的一系列研究成果表明此技术的发展已逐渐成熟,应用范围也越来越广泛。

    总之,QCM传感器拥有着广阔的发展前景,从其研究历程来看,基于QCM技术构建的生物传感体系正朝着超灵敏度和高特异性的方向发展,所涉及的研究领域也更加广阔。不过,要想同时实现以上特点并非易事,且现有的QCM生物传感体系中绝大多数成本都比较高,不便推广使用,今后QCM生物传感器的发展应集中在以下几个方面:(1)设计出新型简便且运作成本较低的信号放大体系,进一步提高检测灵敏度;(2)市场上QCM芯片的价格比较昂贵,长期使用耗费过大,故应发展可重复利用的传感层,使其可循环使用,降低开发成本,便于推广或商业化;(3)开发出对多种目标同时在线检测以及现场快速检测的便携式传感器,缩短检测时间,提高检测效率;(4)除了质量以外,温度、外部震动等因素也能引起石英晶片共振频率的变化,应通过控温、减震等设计,尽量减小环境因素的影响,提高QCM检测的稳定性。

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  • 图 1  基于原位选择性结晶的QCM生物传感体系[9]

    Figure 1  QCM biosensor system based on in-situ selective crystallization[9]

    图 2  基于磁珠的QCM免疫传感器示意图[16]

    Figure 2  Schematic illustration of QCM immune sensor based on magnetic bead[16]

    图 3  用于分析白血病细胞的QCM生物传感器示意图[23]

    Figure 3  Schematic representation of the fabrication of the QCM biosensor for analysis of the leukemia cells[23]

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  • 发布日期:  2018-02-01
  • 收稿日期:  2017-08-20
  • 接受日期:  2017-10-31
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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