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• 致病微生物是食品安全和人体健康的重要隐患之一^[1]，例如，大肠杆菌、沙门氏杆菌、金黄色葡萄球菌等经常会引起安全事故。微生物检测常见的方法有聚合酶链式反应(PCR)技术、酶联免疫法、免疫磁珠分离技术、核酸探针技术和生物传感器检测技术等^[2]。检测病原菌的生物传感器是将抗体、抗原以及酶等生物活性材料作为生物识别元件固定在传感器表面，利用抗体和抗原的特异性结合原理，通过生化反应换能器将待测量转变为可输出的定量的物理或化学信号，进而实现对微生物的检测^[3]。

  纳米材料是指三维空间里至少有一维是1~100 nm或者是由它作为基本结构单元所构成的具有纳米效应的材料^[4]。其独特的分子结构使其具有优异的物理、化学性能，纳米材料的量子效应和表面效应对传感器的性能改善具有重要的作用。近年来，多种纳米材料，比如纳米金、纳米银、石墨烯、碳纳米管以及量子点等被应用到电化学生物传感器中^[5]。

  本文主要介绍基于不同纳米材料的电化学生物传感器在病原微生物检测方面的研究进展。

  1.   纳米金属材料电化学传感器

  纳米金属材料既包括金、银、铂等贵金属材料，也包括合金材料。金属纳米材料不仅为生物分子的固定创造了合适的微环境，而且其对微生物分子识别元件的兼容性好，比表面积大，可以用作载体或是起到探针作用；此外，金属纳米材料导电性强，可以增强微生物活性中心与电极表面之间的电子转移，提高电化学反应速率，进而提高检测的灵敏度，也可增强反应的活性，延长生物传感器的使用寿命等^[6]。

  1.1   纳米金材料

  纳米金(AuNPs)具有制备方法简单、生物相容性好、电位范围广、催化活性高等优点^[7]，能与多种生物大分子结合，能有效改善电子的传递效率，还能提高生物分子的固定量等，从而提高了传感器的检测效率，降低检出限，拓宽检测范围。1971年，Faulk首次将AuNPs标记技术带到免疫技术中^[8]，随后陆续发现了AuNPs的催化特性、分子探针以及信号放大等功能，并用来检测细菌、病毒等微生物。

  Liu等^[9]制备了一种检测禽白血病病毒的夹心型电化学免疫传感器。以石墨烯-二甲苯-3, 4, 9, 10-四羧酸纳米复合材料为检测平台，用禽白血病病毒二级抗体和碱性磷酸酶来功能化修饰纳米纤维素-AuNPs复合材料以增强检测信号，从而提升检测的灵敏度，其检出限为101.98 TCID₅₀/mL。王志良等^[10]利用AuNPs的相容性特点来固定人肠道病毒EV71型抗体，以[Fe(CN₆)]^3-/4-为探针来检测人血清蛋白中的EV71病毒，其检出限为0.025μg/mL。Luna等^[11]以AuNPs和半胱氨酸自组装单层为基础，制备了4种用来检测登革热病毒(DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4)的电化学免疫传感器。如图 1所示，根据不同种类病毒发生免疫反应后阳极峰电流的偏差率不同，可以区分出四种亚型病毒。Wang等^[12]用电沉积的AuNPs、HRP标记的抗白痢菌抗体和离子液体(ILs)修饰的丝网印刷碳电极制备了免疫传感器，其中沉积的AuNPs增加了电极上抗体的固定量，ILs可以保持抗体生物活性并提高检测电极的稳定性，在30d后电流响应值仍然高达94.85%。Krithiga等^[13]用果胶-AuNPs复合材料(CCLP-AuNPs)来固定单克隆抗体，将免疫复合物与抗兔IgG HRP结合，通过伏安法和阻抗法来检测铜绿假单胞菌，其检出限为9×10²cfu/mL。

  图 1

  

  图 1.  基于纳米金检测登革热病毒传感器的制备图^[11]

  Figure 1.  Preparation of dengue virus sensor based on nanogold detection^[11]

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  不难发现，Wang等的传感器用IL膜修饰纳米金电极可以维持抗体在测试环境中的活性，从而延长其使用寿命，并且IL膜提供了大量的活性位点，可以用来固定更多HRP标记的抗白痢的底物。Krithiga等的传感器利用CCLP-Au NPs提供更大的比表面积可以增加抗体的固定量，而且利用AuNPs上的IgG-HRP抗体进行信号产生，可以表现出良好的电化学行为。Luna等设计的传感器不仅局限于检测某种微生物，还可以用来区分或筛选不同的微生物。

  1.2   纳米银材料

  纳米银(AgNPs)具有良好的导电性、光学性能、催化性能等，其固定在传感器表面或标记微生物能加快电化学反应。AgNPs与金属氧化物、硅酸盐、聚合物、石墨烯、纤维、树状大分子等相结合制备的纳米复合材料，也被广泛应用于生物传感器的构建中^{[14, 15]}。

  宋新贺等^[16]将碳纳米管作为基底材料，用硫化银纳米球负载AuNPs来标记抗体，该方法相对于传统的AuNPs标记抗体方法，其具有较大的比表面积，可以使电极表面负载更多的AuNPs，而且还能起到信号放大作用，从而使该免疫传感器具有更高的响应电流和更低的检出限，其检出限为4×10²cfu/mL。Abbaspour等^[17]制备了检测金黄色葡萄球菌的电化学免疫传感器，将生物素化的初级金黄色葡萄球菌抗适配体固定在链霉亲和素的磁性微球(MB)上，第二代金黄色葡萄球菌抗体适配体与银纳米颗粒(APT-AgNPs)结合，在MB表面形成了APT/金黄色葡萄球菌/APT-AgNPs多层复合物，通过双适体夹心法检测金黄色葡萄球菌，其检出限为1.0cfu/mL。Valipour等^[18]制备了一种环保的AuNPs免疫传感器，将AgNPs通过Ag-S键固定在石墨烯量子点的-SH基团(gqd-sh)上，从而形成Ag/gqd-sh纳米复合物，并结合核黄素共同构成传感器来检测丙型肝炎病毒核心抗原，其检出限为3fg/mL。Huang等^[19]用H7单克隆抗体修饰金电极检测H7病毒，以AgNPs、石墨烯作为微量标记物，通过采用附着在AgNPs-G表面的H7-AgNPS-G多克隆抗体来进行免疫测定，检出限为1.6pg/mL。

  Abbaspour等的传感器有两种适配体，第一种适配体亲和力高，降低非特异性吸附，第二种适配体与AgNPs结合作为探针，提高了传感器的选择性。Valipour等的传感器优势在于gqd-sh有较大的比表面积，而且AgNPs与抗-HCV氨基的共价键结合比吸附法具有更高的稳定性和重复性。

  1.3   其他金属纳米材料

  铂基纳米材料(PtNCs)以其独特的电子和电催化性能被广泛用到传感器中。Li等^[20]以富勒烯、二茂铁和巯基壳聚糖复合纳米层为免疫平台，然后将表面包覆大量亲和素的Au-SiO₂附着在纳米平台表面，与固定在O157:H7上的生物素发生共价反应，并以负载多功能的PtNCs为探针来检测热灭活的大肠杆菌，检出限为15cfu/mL。

  此外，还有一些双金属或者三金属合金等，这些纳米材料通过创造更多的结构柄、活性中心，表现出更强的电催化活性和生物相容性，而且相较于金或银等贵金属纳米材料，纳米合金的价格比较便宜。

  Yan等^[21]制备了一种无标记的电化学免疫传感器来检测乙型肝炎病毒，利用聚苯乙烯(PS)纳米球作为载体来负载含氮石墨烯量子点的AuPdCu三元金属纳米粒子(AuPdCu/N-GQDs)，该纳米粒子不仅具有催化效应，还能放大检测信号，其检出限为3.3fg/mL。Li等^[22]制备了一种基于金纳米棒和介孔Au@Pd@Pt核壳纳米球信号放大系统检测乙型肝炎病毒的免疫传感器，其中介孔Au@Pd@Pt核壳纳米球作为检测抗体的标记物用于检测乙肝病毒，在20~200 ng/mL范围内该传感器的检出限为6.7fg/mL。

  相比之下，Yan等的传感器主要是利用了gqd-sh的比表面积大等特性，而且AuPdCu/ N-GQDs@PS可以保证HBS抗体与抗原的成功结合。Li等的传感器中，Au@Pd@Pt核壳纳米球的边角丰富的纳米晶Pt壳原子具有高比表面积，有利于固定更多抗体。

  2.   碳纳米管电化学免疫传感器

  碳纳米管是一种独特的一维管状分子^[23]，根据结构的不同可以分为单壁碳纳米管(SWCNT)和多壁碳纳米管(MWCNT)。碳纳米管有比表面积大、生物相容性好、导电性高、优良的电催化性和化学稳定性等特点，是构建电化学免疫传感器的一种重要材料。

  2.1   单壁碳纳米管

  SWCNT是由单层石墨烯卷曲而成，管径小、比表面积大，可以作为载体来固定致病菌的抗体或抗原。Prieto-Simón等^[24]设计了一种用于检测污水中噬菌体MS2的免疫传感器，采用SWCNT作为载体，通过共价键组装法将SWCNT固定在金电极上，采用间接夹心免疫法检测MS2噬菌体，其检出限为98pfu/mL。Bhardwaj等^[25]制备了无标记的电化学免疫传感器来检测金黄色葡萄球菌。将金黄色葡萄球菌抗体以共价结合方式连接到SWCNT上，并将抗体-SWCNT(Ab-SWCNT)生物复合物固定在电极上来检测细菌浓度，如图 2所示，其检测限为15cfu/mL。Yoo等^[26]制备了一种基于SWCNT检测沙尘颗粒中枯草芽孢杆菌的电化学免疫传感器。其抗体通过蛋白质表面的伯胺基和琥珀酰亚胺上的仲胺基的亲核取代反应固定在1-吡啶丁酸琥珀酰酯上，并连接在SWCNT上，通过定向测量SWCNT上的电阻响应来测定枯草芽孢杆菌，其检出限为10²cfu/mL。

  图 2

  

  图 2.  基于单壁碳纳米管检测金黄色葡萄球菌的传感器制备原理图^[25]

  Figure 2.  Schematic diagram of sensor preparation for detection of Staphylococcus aureus based on single-walled carbon nanotubes^[25]

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  Prieto-Simón等的传感器的抗体的定向固定确保了空间位阻效应的最小化，从而促进了抗原-抗体的相互作用，提高了检测的灵敏度。Bhardwaj等的传感器使用Ab-SWCNT可以减少功能化步骤，避免过多的功能化步骤对疏水屏障的破坏，而且也缩短了功能化时间，提高了生物分子的存活率，从而提高了传感器的稳定性。

  2.2   多壁碳纳米管

  MWCNT是由多个同心管互相围绕而成的。Hassan等^[27]制备了一种用于测定链霉菌活性的电化学传感器，通过循环伏安法来测定活细胞数量，实验表明，在电极基体上加入MWCNT，可以明显改善氧化电流，提高了传感器性能。Gayathri等^[28]制备了一种检测尿道致病性大肠埃希菌(UPEC)的传感器，将硫氰酸染料(Th)固定在功能性MWCNT和壳聚糖复合物上，然后包覆在金电极上，在其表面上依次固定UPEC、牛血清白蛋白、一抗和马萝卜过氧化物酶(HRP)标记的二抗，其检出限为50cfu/mL。杨华等^[29]制备了一种基于MOCPs-MWCNTs的电化学免疫传感器来检测大肠杆菌，其中NaAuCl₄与苯二硫醇(BDT)反应形成金属有机配位聚合物，同时在BDT还原作用下生成大量纳米金，最终将抗体包埋在MOCPs-MWCNTs中，其检出限为40cfu/mL。Viswanathan等^[30]将大肠杆菌、变形杆菌和沙门氏菌的抗体的混合物固定在MWCNT表面，制成免疫传感器，用3种具有可释放金属离子的特异性纳米晶(CuS、PBS和CdS)结合抗体进行夹心免疫测定，用阳极溶出伏安法测定结合抗体纳米晶共轭物中释放的金属离子，可区分出三种细菌。

  杨华等的传感器MOCPs-MWCNTs修饰于金电极的表面，不仅能够增强电子传递效率，还能够通过嵌入方式增加捕获抗体的固定效率与稳定性。Hassan等的传感器是通过细菌细胞代谢活性与碳纳米管修饰电极的交流来测定活链霉菌细胞的电化学活性，即活菌细胞越多，产生氧化电流越高，可以用来区分活菌与死菌。

  3.   石墨烯电化学免疫传感器

  石墨烯是一种由碳原子以sp²杂化轨道组成的呈蜂巢晶格状的二维材料，是目前世界上最薄且最坚硬的纳米材料，具有独特的电性能、导热性能和光学性能，其还具有表面积大、吸附力强、生物相容性高等优异特性，在电化学分析领域中可用来构建基于抗原-抗体相互作用的电化学免疫传感器^[31]。

  石墨烯主要以氧化物(GO)形式应用到电化学免疫传感器中。Xie等^[32]制备了一种用于检测H5亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器，如图 3所示，实验结果表明该传感器灵敏度要比不含GO的传感器高256倍。Jijie等^[33]用还原氧化石墨烯/聚乙烯亚胺(rGO/PEI)薄层来修饰金电极，通过用芘-聚乙二醇部分修饰免疫传感器来抑制非特异性吸附，从而实现了对大肠杆菌UTI89快速高灵敏度的特异性检测，检出限为10cfu/mL。谢爱娟等^[34]将GO还原成rGO，用电化学聚合法在rGO表面形成聚邻苯二胺膜来修饰电极，构建了免疫传感器，检出限为0.08ng/mL。

  图 3

  

  图 3.  基于石墨烯检测禽流感H5亚型病毒传感器制备图^[32]

  Figure 3.  Preparation of avian influenza H5 subtype virus sensor based on graphene^[32]

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  Navakul等^[35]提出了一种基于阻抗法的登革热病毒检测和抗体筛选新技术，在该技术中，DENV作为一种组件，通过自组装过程去功能化修饰石墨烯聚合物，来改善传感器表面的特异性和灵敏性，其检出限为0.12pfu/mL。Pandey等^[36]通过自组装的石墨烯包铜辅助半胱氨酸分级结构(rGO-CysCu)修饰金电极，以此制备了一种用于大肠杆菌定量检测的电化学免疫传感器(如图 4所示)，检出限为3.8cfu/mL。

  图 4

  

  图 4.  基于石墨烯材料检测大肠杆菌的传感器制备图^[36]

  Figure 4.  Sensor preparation diagram for detection of E.coli based on grapheme material^[36]

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  不难发现，功能化修饰材料的不同，石墨烯发挥的作用也大不相同，比如Navakul的传感器与DENV直接在溶液中移动时相比，DENV周围单体的自组装可以更有效地完成，去病毒后，GO-聚合物表面能够识别和选择性结合DENV的区域，因此可以发挥其筛选不同病毒(DENV各种亚型，以及h5n1亚型)的作用。Pandey等的传感器的独特三维结构和高亲水性可增强抗体与底物之间的粘附力，而且半胱氨酸层作为一个多功能界面，很容易与靶向分子进行功能化修饰，可以保持抗体的生物活性并改善合成材料的水溶性，极大地提高了检测大肠杆菌的灵敏度与精确度。

  4.   纳米氧化物电化学传感器

  纳米氧化物包括金属和非金属纳米氧化物，常见的纳米氧化物材料有ZnO、Al₂O₃、Fe₃O₄等，这些材料或作为载体，或用来起催化作用，也有些纳米氧化物材料由于具有超顺磁性^[37]，可以起到固定更多抗体的作用。

  张新爱等^[38]将大肠杆菌抗体和二茂铁甲酸固定在SiO₂修饰的纳米ZnO上作为标记物，通过脉冲伏安法测定电极表面的电流信号，检测乳制品中的大肠杆菌数，其检出限为100cfu/mL。Han等^[39]制备了一种基于PDMS的微流控电化学免疫传感器，可以同时检测H1N1、H5N1和H7N9病毒，每种病毒的检出限为1pg/mL。Tan等^[40]制备了一种基于PDMS的纳米孔Al₂O₃膜的微流控免疫传感器，用来检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，通过自组装(3-缩水甘油丙基)三甲氧基硅烷单层作为交联剂，将抗体固定在氧化铝表面，其检出限为10²cfu/mL。Chan等^[41]将磁珠与大肠杆菌结合，在外加磁场作用下，磁性珠结合细菌细胞成功地聚集在纳米孔氧化铝膜上，形成抗体修饰的磁性珠-大肠杆菌-抗体的夹心复合物，通过测量纳米孔膜阻抗谱的变化，来检测细菌浓度，其检出限为10cfu/mL。Cheng等^[42]制备了基于Fe₃O₄纳米材料的安培免疫传感器来检测大肠杆菌，其中Fe₃O₄磁性核、普鲁士蓝、N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷层以及AuNPs壳组成四层功能磁性纳米粒子，并将免疫磁珠涂覆在电极表面，检出限为4.3×10²cfu/mL。

  Chan等的传感器中，修饰性纳米磁珠的加入可以增大传感器的比表面积，从而固定更多的抗体，提高灵敏度。Cheng等的传感器设计相对复杂，但是其操作较为简便，传感器可以通过简单地关闭电源来循环使用，是一种环保传感器。不难发现，这一类传感器中大多都应用了微流控技术，使得传感器更加微型化与集成化。

  5.   结语

  本文综述了近年来纳米电化学生物传感器在微生物检测方面的研究进展，介绍了基于纳米金属、碳纳米管、石墨烯及纳米氧化物材料所构建的传感器的特性。其中，纳米材料既可用来作基底材料，也可作为载体、探针或是起到催化作用；纳米材料可以通过改善传感器的比表面积来固定更多生物分子识别元件，通过特异性反应达到富集被测物的目的；此外，纳米材料还可以通过减少非特异性吸附来提高传感器的灵敏度，降低其检出限，扩大其检测范围。而且不难发现，这些传感器不再是局限于某种纳米材料的单独使用，而是多种纳米材料的同时使用，这也可以使传感器的性能得到更大的改善。但有些传感器仍存在结构复杂、制备使用困难或纳米材料昂贵等缺点，而且大多数传感器缺乏智能性。

  随着新型纳米材料的不断发现以及电化学测试技术、微加工技术、微流控技术和人工智能技术的不断提高，基于纳米材料的电化学传感器将会更加灵敏，将会朝着微型化、集成化、多功能化、智能化方向发展，并将在食品安全、生物医学、环境检测、生物战剂等方面发挥更重要的作用。

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  图 1  基于纳米金检测登革热病毒传感器的制备图^[11]

  Figure 1  Preparation of dengue virus sensor based on nanogold detection^[11]

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  图 2  基于单壁碳纳米管检测金黄色葡萄球菌的传感器制备原理图^[25]

  Figure 2  Schematic diagram of sensor preparation for detection of Staphylococcus aureus based on single-walled carbon nanotubes^[25]

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  图 3  基于石墨烯检测禽流感H5亚型病毒传感器制备图^[32]

  Figure 3  Preparation of avian influenza H5 subtype virus sensor based on graphene^[32]

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  图 4  基于石墨烯材料检测大肠杆菌的传感器制备图^[36]

  Figure 4  Sensor preparation diagram for detection of E.coli based on grapheme material^[36]

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