酶法合成头孢丙烯工艺研究

引用本文: 吕海军, 康彩红, 刘磊, 于奕峰, 陈爱兵, 刘红厚, 刘欢, 张焕鹏, 康笑. 酶法合成头孢丙烯工艺研究[J]. 化学通报, 2017, 80(9): 858-862. shu

Citation: Lv Haijun, Kang Caihong, Liu Lei, Yu Yifeng, Chen Aibing, Liu Honghou, Liu Huan, Zhang Huanpeng, Kang Xiao. Study on the Enzymatic Synthesis of Cefprozil[J]. Chemistry, 2017, 80(9): 858-862. shu

酶法合成头孢丙烯工艺研究

吕海军 ^1, ,
康彩红 ^1, ,
刘磊 ^{1,2,
,} ,
于奕峰 ^1, ,
陈爱兵 ^1, ,
刘红厚 ^3, ,
刘欢 ^1, ,
张焕鹏 ^1, ,
康笑 ^1,

1.
河北科技大学化学与制药工程学院河北省药物化工工程技术研究中心石家庄 050018
2.
河北科技大学河北省药用分子化学重点实验室石家庄 050018
3.
河北华石生物科技有限公司石家庄 050035

通讯作者: 刘磊, 女, 博士, 教授, 主要从事π功能分子、纳米能源材料的合成和药物及中间体合成。E-mail:liulei@hebust.edu.cn

基金项目:

河北省自然科学基金项目（B2014208121）、河北科技大学大学生创新创业训练计划项目（201510082017）和河北科技大学五大平台开放基金（2015PT37）资助

摘要: 采用酶催化法，以7-氨基-3-[（Z）-烯丙-1-基]-3-头孢环-4-羧酸（7-APCA）为母核，D-对羟苯甘氨酸甲酯（D-HPGME）为酰基供体，水作溶剂，在固定化青霉素G酰化酶的催化作用下合成头孢丙烯。本研究中催化酶的载体采用氨基和环氧载体，筛选合适的酶活，考察反应pH、温度、投酶量、投料比、底物浓度等多个因素对酶法合成头孢丙烯的影响。通过对酶法合成头孢丙烯的工艺条件的优化，为头孢丙烯绿色生产技术的推行打下基础。

关键词:

English

Study on the Enzymatic Synthesis of Cefprozil

1.
Hebei Research Center of Pharmaceutical and Chemical Engineering, College of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018
2.
Hebei Key Laboratory of Molecular Chemistry for Drug, Hebei Research Center of Pharmaceutical and Chemical Engineering, Shijiazhuang 050018
3.
Hebei Huashi Bio-Tech Co. Ltd, Shijiazhuang 050035

Corresponding author: Liu Lei, liulei@hebust.edu.cn

Received Date: 01 March 2017
Accepted Date: 03 May 2017
Available Online: 18 September 2017

Abstract: Cefprozil was synthesized using 7-amino-3-[(Z)-all-1-yl]-3-cephem-4-carboxylic acid (7-APCA) as the nucleus, D-hydroxyphenylglycine methyl ester (D-HPGME) as acyl donor, water as solvent via the enzymatic method under the catalysis of immobilized penicillin G acylase. In the study, the carrier of the catalytic enzyme is amino and epoxy polymer. The research screened the appropriate enzyme activity and investigated the influence of several factors including pH, temperature, enzyme dosage, feed ratio and substrate concentration on the synthesis of cefprozil. The data obtained through optimized experiment of synthesizing cefprozil by penicillin G acylase (PGA) lay the foundation for the implementation of the green production technology of cefprozil.

Key words:

头孢丙烯(Cefprozil)是1983年Bristol-Myers公司东京研究所^[1]研制的、被美国FDA批准的第一个用于治疗儿童鼻窦炎和中耳炎的第二代新型广谱口服头孢菌素类抗生素。该药的杀菌机制是阻碍细菌细胞壁合成^[2]。临床用于敏感菌所致的呼吸道感染、无合并症的皮肤及软组织感染等。

头孢丙烯抗菌活性强，尤其对革兰阳性菌有较强的抑制作用，抗菌谱较头孢克洛或头孢呋辛广，疗效高，毒副作用少，药物吸收好^[3]，是目前国内外需求量较大的产品之一。近年来国内市场对头孢丙烯的需求量不断扩大，因此有必要对头孢丙烯的合成工艺进行探索和研究。

目前，头孢丙烯的生产以化学法为主^{[4, 5]}，合成过程长，步骤多，反应条件苛刻，产生三废多，污染大。酶法与化学法相比，具有工艺简单、条件温和、成本低、杂质少、绿色环保^[6]等优点。国际上，一些大制药公司已经开展酶法合成的技术研究^[7]。本文以7-氨基-3-[(Z)-烯丙-1-基]-3-头孢环-4-羧酸(7-APCA)为底物、D-对羟苯甘氨酸甲酯(D-HPGME)为酰基供体、水作溶剂，固定化青霉素G酰化酶(PGA)催化合成头孢丙烯。筛选合适酶活的催化剂并分别采用氨基和环氧载体固载，考察了反应pH、温度、投酶量、投料比、底物浓度等多个因素对酶法合成头孢丙烯的影响。该合成路线(如图 1所示)原料简单易得，反应条件温和，绿色环保。

图1 头孢丙烯的HPLC图谱 Figure1. HPLC chromatogram of cefprozil

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图式 1 酶催化合成头孢丙烯 Scheme1. Enzymatic synthesis of cefprozil

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1   实验部分

1.1   仪器与试剂

Agilent 1260 LC高效液相色谱仪(美国，安捷伦公司)；FA2004N电子分析天平(上海精密仪器有限公司天平厂)；SHA-CA双数显水浴恒温振荡器(金坛市恒丰仪器制造有限公司)；PHS-3C雷磁pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。

固定化青霉素G酰化酶^[8]由河北华石生物科技有限公司提供，母核7-APCA购自湖北威德利有限公司，头孢丙烯购自武汉大华伟业医药化工有限公司，侧链D-HPGME购自武汉鸿睿康试剂有限公司，D-对羟苯甘氨酸(D-HPG)购自武汉远成共创科技有限公司。其他所用试剂均为市售分析纯级。

1.2   色谱条件

参照中国药典，采用3.5μm Agilent Eclipse Plus色谱柱(4.6×100mm)，检测波长为225nm，流速为1.0mL/min，进样量为20μL，柱温为20℃。流动相为2.3%的磷酸二氢铵缓冲液(95%)和乙腈(5%)。

1.3   酶活测定方法

向100mmol/L 7-APCA和120mmol/L D-HPGME溶液中加入适量固定化酶，在pH 6.0、25℃下搅拌反应30min，HPLC监测生成头孢丙烯的浓度。在规定的测定条件下，每分钟每克酶将1μmol 7-APCA转化成头孢丙烯，称之为一个合成用固定化青霉素酰化酶活性单位。

1.4   PGA对头孢丙烯的合成催化能力测试方法的确定

以氨基载体和环氧载体固载PGA为催化剂制备头孢丙烯，合成过程中有两个副反应^[9]：反应起始时，酰基供体浓度较高，发生酰基供体水解反应；合成后期产物积累，发生产物水解反应。反应体系中生成的头孢丙烯与HPG的物质的量之比称为S/H^{[10, 11]}。评估反应的S/H已经成为快速筛选具有高效催化活力酰化酶的方法之一。为了更客观地评价PGA催化合成头孢丙烯的能力，本文采用S/H来考察各因素对PGA合成头孢丙烯的影响。

1.5   实验方法

酶催化合成：在烧杯中加入7-APCA和水，滴加7-APCA的25%氨水溶液，加入D-HPGME，滴加6mol/L盐酸至合适pH后，再加入一定酶活的PGA。反应过程中，用25%氨水或6mol/L盐酸控制pH，用水浴锅控温，通过检测7-APCA的转化率判断反应终点，转化率≥98%时终止反应。

分离：通过筛网分离酶与反应悬浊液，悬浊液进行抽滤，固定化酶先用滤液反复冲洗至洗液基本清亮，再用少量水冲洗(可套用到下一批次)。

重结晶：合并滤液及滤饼，磁力搅拌下加6mol/L盐酸酸化，溶液澄清后，抽滤，去除杂质。搅拌下滴加25%氨水，调pH到2，有晶体析出，继续滴加氨水至溶液pH为5，大量晶体析出，过滤，在65℃下真空干燥2h，得到类白色或淡黄色或淡橙黄色固体。

2   结果与讨论

本工艺通过筛选合适大小的酶活，分别采用氨基载体和环氧载体两种载体，考察了反应pH、温度、投酶量、投料比、底物浓度等多个因素对酶法合成头孢丙烯的影响，从而确定较为适宜的酶法合成头孢丙烯的实验条件。

2.1   酶活的影响

7-APCA浓度为100mmol/L，D-HPGME浓度为200mmol/L，酶与7-APCA的质量比为1.25:1，水作溶剂，加入不同活性的酶。在25℃水浴摇床中反应，用25%氨水或6mol/L盐酸控制pH在6~7之间。反应开始后每隔0.5h或1h取样，进行HPLC检测，转化率≥98%时终止反应。

酶的活性过高和过低对反应均不利。酶活过低，反应时间较长；酶活过大，加快侧链分解程度，S/H降低(图 3)。综合反应时间和S/H，本文合成头孢丙烯采用活性为144U的酶。

图3 酶活对酶促合成头孢丙烯的影响 Figure3. Effect of enzyme activity on enzymatic synthesis of cefprozil

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2.2   反应pH的影响

7-APCA浓度为100mmol/L，D-HPGME浓度为200mmol/L，酶与7-APCA质量比为1.25:1，水作溶剂，25℃水浴摇床中反应，分别控制pH为5.5~6.0、6.0~6.5、6.5~7.0、7.0~7.5、7.5~8.0。结果显示，S/H随pH的增大而降低，但pH太低，会导致酶活性降低甚至失活，使反应时间加长；pH在6.5以上时会加速侧链的分解速率，导致S/H随pH升高而下降(图 4)。因此，酶催化合成头孢丙烯时控制pH为6.0~6.5。

图4 反应pH对酶促合成头孢丙烯的影响 Figure4. Effect of pH on enzymatic synthesis of cefprozil

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2.3   反应温度的影响

7-APCA浓度为100mmol/L，D-HPGME浓度为200mmol/L，酶与7-APCA质量比为1.25:1，水作溶剂，控制pH在6.0~6.5之间，分别在15、20、25、30、35和40℃的水浴锅中反应，考察温度对反应的影响。结果显示，S/H随着反应温度的升高而降低，但温度太低，底物转化缓慢，导致反应时间加长；反应温度过高，侧链加速水解，S/H降低(图 5)。综合反应时间和S/H，采用氨基载体和环氧载体配比酶合成头孢丙烯时，控制25℃下反应较适宜。

图5 反应温度对酶促合成头孢丙烯的影响 Figure5. Effect of reaction temperature on enzymatic synthesis of cefprozil

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2.4   投酶量的影响

7-APCA浓度为100mmol/L，D-HPGME浓度为200mmol/L，水作溶剂，酶与7-APCA的质量比分别为1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1和1.5:1。在25℃水浴摇床中反应，控制pH在6.0~6.5之间。反应开始后每隔0.5h或1h取样，进行HPLC检测，转化率≥98%，终止反应。

结果显示，随着投酶量的增大，反应到达终点所需时间缩短，但是增加投酶量会加大侧链分解程度，降低S/H(图 6)。综合反应时间和S/H，氨基载体配比酶合成头孢丙烯的酶/7-APCA比以1.2:1较为适宜；环氧载体配比酶合成头孢丙烯的酶/7-APCA比以1.1:1较为适宜。

图6 投酶量对酶促合成头孢丙烯的影响 Figure6. Effect of enzyme dosage on enzymatic synthesis of cefprozil

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2.5   投料比的影响

7-APCA浓度为100mmol/L，水作溶剂，D-HPGME/7-APCA摩尔比分别设定1.1、1.2、1.3、1.4、1.5和1.6，酶/7-APCA质量比为1.2:1，25℃水浴摇床中反应，控制pH在6.0~6.5之间。结果显示，S/H随投料比的增大而减小(图 7)。综合成本和S/H，氨基载体配比酶合成头孢丙烯的投料比以1.2:1较为适宜；环氧载体配比酶合成头孢丙烯的投料比以1.1:1较为适宜。

图7 投料比对酶促合成头孢丙烯的影响 Figure7. Effect of feed ratio on enzymatic synthesis of cefprozil

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2.6   底物浓度的影响

底物7-APCA的浓度分别为100、200、300、400、500、600、700 mmol/L，D-HPGME/7-APCA=1.2:1，水作溶剂，酶/7-APCA质量比为1.2:1，25℃水浴摇床中反应，控制pH在6.0~6.5之间。转化率≥98%时终止反应。结果显示，S/H随着底物浓度的增大先增后减，底物浓度低于500mmol/L时，S/H随底物浓度增大而增大(图 8)，超过500mmol/L后又出现下降趋势。故综合考虑，采用氨基载体和环氧载体配比酶合成头孢丙烯时底物浓度均控制为500mmol/L。

图8 底物对酶促合成头孢丙烯的影响 Figure8. Effect of substrates on enzymatic synthesis of cefprozil

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2.7   结构鉴定

产物头孢丙烯(一水合物)用氘代水溶解，加适量碳酸钠促溶。¹H NMR (500MHz，D₂O) δ：7.19 (d，J=8.5Hz，2H)，6.69 (d，J=8.5Hz，2H)，5.90 (d，J=11.1Hz，1H)，5.70 (dd，J=11.4、7.1 Hz，1H)，5.65 (d，J=4.5Hz，1H)，5.10 (d，J=4.6Hz，1H)，4.51 (s，1H)，3.48 (d，J=17.9Hz，1H)，3.26 (d，J=17.9Hz，1H)，1.60 (dd，J=7.0、1.6 Hz，3H)。IR(KBr) ν/cm^-1：3536(酚O-H伸缩振动)；3219(酰胺N-H伸缩振动)；1759(羧酸C=O伸缩振动)；1683(酰胺C=O伸缩振动)。

3   结论

在合成工艺中，温度、pH、投酶量以及投料比对催化合成头孢丙烯的S/H影响均很大。氨基载体配比酶合成头孢丙烯的较适宜条件为：温度25℃，pH=6.0~6.5，酶/7-APCA质量比1.2:1，D-HPGME:7-APCA=1.2:1；底物7-APCA的浓度为500mmol/L，此工艺条件下S/H可达5以上，收率为63%~72%；环氧载体配比酶合成头孢丙烯的较适宜条件为：温度25℃，pH=6.0~6.5，酶/7-APCA质量比1.3:1，D-HPGME:7-APCA=1.1:1；底物浓度500mmol/L，此工艺条件下S/H可达8以上，收率为76%~80%，纯度为90%~93%。由此可见，环氧载体较氨基载体酶更有优势。

酶法合成头孢丙烯工艺中存在以下三个影响合成头孢丙烯的S/H及摩尔收率的主要问题。第一，反应速率前快后慢，接近终点时反应缓慢，其原因可能是产物积聚对酶带来抑制作用。第二，环氧载体的酶硬度小^[11]，易碎，易着色。第三，7-APCA的溶解度随着反应液pH的增大而降低，而D-HPGME溶解度随着反应液pH的增大而增大，pH=6.5时，D-HPGME的溶解度远大于7-APCA，故在反应过程中会导致大量D-HPGME分解。若以上三个问题能得到有效解决，将对酶法合成头孢丙烯产生有益的影响。
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图 1 头孢丙烯的HPLC图谱

Figure 1 HPLC chromatogram of cefprozil

1 顺式头孢丙烯；2 反式头孢丙烯

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图式 1 酶催化合成头孢丙烯

Scheme 1 Enzymatic synthesis of cefprozil

注：图中E代表青霉素G酰化酶

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图 3 酶活对酶促合成头孢丙烯的影响

Figure 3 Effect of enzyme activity on enzymatic synthesis of cefprozil

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图 4 反应pH对酶促合成头孢丙烯的影响

Figure 4 Effect of pH on enzymatic synthesis of cefprozil

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图 5 反应温度对酶促合成头孢丙烯的影响

Figure 5 Effect of reaction temperature on enzymatic synthesis of cefprozil

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图 6 投酶量对酶促合成头孢丙烯的影响

Figure 6 Effect of enzyme dosage on enzymatic synthesis of cefprozil

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图 7 投料比对酶促合成头孢丙烯的影响

Figure 7 Effect of feed ratio on enzymatic synthesis of cefprozil

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图 8 底物对酶促合成头孢丙烯的影响

Figure 8 Effect of substrates on enzymatic synthesis of cefprozil

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