固相合成法制备组氨酸-苯丙二肽分子及其自组装研究

引用本文: 薛鹏, 张聖晗, 张翼, 王吉德. 固相合成法制备组氨酸-苯丙二肽分子及其自组装研究[J]. 化学通报, 2017, 80(3): 273-277. shu

Citation: Xue Peng, Zhang Shenghan, Zhang Yi, Wang Jide. Study on the Solid Phase Peptide Synthesis and Self-assembly Properties of Histidine-Diphenylalanine Molecule[J]. Chemistry, 2017, 80(3): 273-277. shu

固相合成法制备组氨酸-苯丙二肽分子及其自组装研究

薛鹏 ^1, ,
张聖晗 ^2, ,
张翼 ^2, ,
王吉德 ^{1,*,
,}

1.
新疆大学石油天然气精细化工教育部重点实验室乌鲁木齐 830046
2.
中南大学化学与化工学院长沙 410083

作者简介: 薛鹏, 男, 28岁, 博士生, 从事超分子合成组装研究;

通讯作者: 王吉德, 男, 博士, 教授, 从事配位化学和催化研究, E-mail:awangjd@sina.cn

基金项目:
国家自然科学基金项目 21261022

国家自然科学基金项目 21162027

摘要: 本文以组装性能良好的苯丙氨酸二肽（FF）为母体分子，用组氨酸对其进行化学修饰，通过多肽固相合成法合成了组氨酸-苯丙二肽（HisFF）凝胶因子。合成的HisFF分子通过质谱、核磁氢谱和液相色谱等确定其精确结构和纯度。通过透射电镜和扫描电镜观察HisFF聚集体的形貌结构。HisFF分子在甲苯、氯仿和乙酸乙酯溶剂中形成的凝胶的强度不同，透射电镜实验结果表明纤维强度和聚集形态也影响其凝胶的强度。通过不同组装方法，HisFF可以在多种溶剂中组装成各种各样的纳米结构。例如，HisFF在丙酮、甲醇和乙酸乙酯溶剂中可组装成纳米颗粒、纳米管和螺旋状纳米纤维；HisFF先经六氟异丙醇溶解再通过溶剂稀释后，可得到不同直径的纳米纤维。

关键词:

English

Study on the Solid Phase Peptide Synthesis and Self-assembly Properties of Histidine-Diphenylalanine Molecule

1.
Key Laboratory of Oil & Gas Fine Chemicals, Ministry of Education, Xinjiang University, Urumqi 830046
2.
College of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083

Corresponding author: Wang Jide, awangjd@sina.cn

Received Date: 18 September 2016
Accepted Date: 24 October 2016

Abstract: Histidine-diphenylalanine (HisFF) tripeptide gelator was synthesized by chemical modification of the well-assembled diphenylalanine (FF) with histidine through solid phase peptide synthesis method. The precise structure and purity of synthetized HisFF molecule were determined by mass spectrometry (MS) and ¹H NMR. The morphology and structures of the HisFF aggregates were observed using TEM and SEM. The strength of HisFF gelated in toluene, chloroform and ethyl acetate were different, and the TEM images showed that the fiber strength and aggregation form also affect the gel stability. HisFF molecule could be assembled into a variety of nanostructures in several different solvents or through different assembly methods. For example, HisFF can be assembled into nanoparticles, nanotubes and helical nanofibers in acetone, respectively, methanol and ethyl acetate. And when it was first dissolved in HFIP then diluted by these solvents, nanofibers with different diameter can be obtained.

Key words:

超分子是一种可以构建不同形貌结构的优良组装模块。超分子凝胶因子由于能在特定条件下自组装成各种形状结构^{[1, 2]}，近年来受到广泛的关注，在生物材料^[3]、传感和催化^[4]、药物缓释^[5]和光电子学^[6]等众多领域具有潜在的应用价值。新型超分子凝胶因子的合成有望为新的软材料的制备创造条件。

2003年，Reches等^{[7, 8]}发现阿尔茨海默病中Aβ淀粉样蛋白的核心片段苯丙二肽分子 (FF) 是一个良好的构建模块^{[7, 8]}，随后，相继出现大量以FF为核心的短肽修饰、形貌组装调控等方面的研究探索。FF分子易于修饰和控制，具有多重刺激响应性和良好生物相容性等特殊性质，广泛应用于纳米功能材料和生物传感等领域。不同功能性官能团的修饰赋予FF基短肽新的功能，其中，α氨基酸修饰FF的报道较为少见。本课题组先前选择带负电荷的脂肪族氨基酸天门冬氨酸 (Asp) 对FF进行修饰，在改善凝胶性能^[9]和催化领域的应用^[10]等方面取得了一定效果。将带有正电荷的杂环族组氨酸 (His) 引入体系，可为短肽的组装提供多种驱动力，有利于得到丰富多样的组装结构。

本文在组装性能优良的FF模块上，通过经典多肽固相合成法修饰组氨酸，合成组氨酸-苯丙氨酸二肽分子 (HisFF)，并对HisFF的凝胶性能进行研究。同时，考察HisFF短肽分子在不同方法、不同溶剂条件下自组装的形貌，有利于研究超分子自组装的影响因素，调控出均一结构纳米材料。

1   实验部分

1.1   仪器与试剂

6210型质谱仪 (美国AGILENT公司)；DRX 300核磁共振谱仪 (美国BRUKER公司)；LC-300液相色谱仪 (美国Waters公司)；UV-2450紫外可见分光光度计 (日本岛津公司)；EQUINOX55傅里叶变换红外光谱仪 (德国BRUKER公司)；902超低温冰箱 (美国THERMO公司)；JEM-2010型扫描电镜 (SEM，日本JEOL公司)；T20 TECNAI G2透射电镜 (TEM，美国FEI公司)；PHSJ-4A酸度计 (上海雷磁公司)。

Fmoc-Phe-Wang Resin、Fmoc-Phe-OH (宁波康贝生化)；六氟异丙醇 (HFIP)、二氮杂二环 (DBU)、苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯 (HBTU)、三氟乙酸 (TFA)、乙二硫醇和苯甲硫醚 (阿拉丁试剂公司)；N-甲基吗啡啉 (NMM)(安耐吉试剂公司)；茚三酮 (国药沪试公司)；乙酸乙酯 (EA)、N，N-二甲基甲酰胺 (DMF)、四氢呋喃 (THF)、甲苯、甲醇、乙腈等均为市售分析纯试剂。

1.2   HisFF固相合成方法

通过经典固相法合成HisFF (合成路线如图式1)。实验全程持续通入氮气保护，搅拌。合成步骤主要分为合成、裂解和纯化三部分。

图图式1 HisFF的合成路线 Figure 图式1. The synthetic route of HisFF

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1.3   HisFF凝胶制备与特性测试

1.4   HisFF形貌组装

称量1mg HisFF，加入10μL HFIP，超声溶解后，分别配制10mg/mL的丙酮、甲醇、乙醇、THF、EA和乙腈溶液及2mg/mL的乙腈溶液和50mg/mL的HFIP、二次水溶液。室温静置1h后，取10μL溶液滴加在硅片上，干燥后进行电镜分析。同样条件下，对比单一溶剂 (不加HFIP溶剂) 时组装的形貌。

1.2.2   树脂裂解

配置裂解液 (TFA 92.5%，乙二硫醇2.5%，苯甲硫醚2.5%，水2.5%；体积比)，充分混合均匀，置于2~8℃环境下冷冻30min以上；向合成得到的树脂中加入配置好的裂解液 (10mL/g)。置于25℃下，于摇床中振荡反应2.5h，用砂芯漏斗 (3#) 过滤，弃去滤渣，滤液沉淀到乙酸乙酯中，离心后真空干燥，得到多肽粗品。

1.2.1   短肽的固相合成

称取0.6mmol Fmoc-Phe-Wang树脂 (取代度为0.75mmol/g) 加入固相合成管中，用50mL DMF溶胀3h，然后用DMF洗涤；加入50mL 20%的DBU/DMF溶液，30min后减压抽滤，除去反应液后用DMF洗涤；向合成管中加入18mmol Fmoc-Phe-OH、15mL DMF和17.1mmol HBTU，待彻底溶解后加入36mmol NMM，反应1h，取少量产物做茚三酮显色试验 (呈阴性则反应完成)。偶联成功后分别用DMF和MeOH洗涤。再重复偶联氨基酸，加入50mL 20% DBU/DMF溶液，30min后真空抽滤，向反应器中加入18mmol Fmoc-His-OH、15mL DMF和17.1mmol HBTU，待彻底溶解后加入36mmol NMM，反应1h后，再做茚三酮显色试验直到完成偶联。整个序列合成完成后，用DMF和MeOH洗涤，真空干燥后备用。

1.2.3   短肽纯化及结构确证

将多肽粗品用少量乙腈和水溶解，用0.45μm有机滤膜过滤，滤液进入制备型HPLC进行分离制备，收取目标峰。通过质谱确定产物的分子量 (质谱条件如下：离子源：ESI (+)；扫描范围 (m/z)：200~2000；毛细管电压：3500V；干燥温度：330℃；干燥气流速：9.0L/min；喷雾器压力：35.0psi)，并用HPLC检测其化学纯度。得到上述多肽制备液后，将样品溶液置于冻干瓶中，在液氮中预冻10min后冷冻干燥24h，得到多肽粉末，取少量粉末做¹H NMR分析测试。

1.3.2   最小胶凝浓度的测定

最小成胶浓度 (MGC) 是表征凝胶因子凝胶能力的重要指标^{[11, 12]}。取适量HisFF短肽，加入50μL HFIP完全溶解，再混合1mL溶剂置于密封瓶中，超声诱导组装凝胶。所得到的稳定的凝胶时所需凝胶剂HisFF的最小浓度，即为该温度下该凝胶因子的MGC。

1.3.3   临界溶解温度的测定

选择MGC HisFF凝胶，从室温开始缓慢升温 (10℃/h)，当观察到凝胶由固态胶体状缓慢变为溶液状态，保持温度，至凝胶完全变为溶液，此温度即为临界溶解温度。

1.3.1   HisFF凝胶制备

将HisFF配制成浓度为0.2mol/L的HFIP溶液。取50μL母液，然后用不同有机溶剂将溶液稀释至最终浓度为5mmol/L。超声5min得到有机凝胶。

2   结果与讨论

2.1   HisFF的合成与表征

粗产品通过制备型HPLC进行提纯得后到纯品。在其质谱图 (图 1) 中，[M+1]⁺=450，可知被分析物的相对分子质量为449，与目标产物HisFF分子量符合。纯化后的产物进行¹H NMR (溶剂D₂O) 分析 (图 2)，进一步确证其结构。

图 1 HisFF分子的质谱图 Figure 1. MS of HisFF molecule

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图 2 HisFF分子的核磁氢谱 Figure 2. ¹H NMR of HisFF molecule

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利用HPLC对经提纯后的产品进行纯度分析。由图 3可知，HisFF的保留时间为9.062min，纯度高达99.07%。

图 3 HisFF分子高效液相色谱图 Figure 3. HPLC of HisFF molecule

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2.2   HisFF凝胶

HisFF凝胶因子在甲苯和氯仿溶剂中均可以形成无色透明的凝胶，其中甲苯凝胶具有较好的稳定性，而氯仿凝胶则较易坍塌。图 4为不同溶剂中成胶后的TEM照片，甲苯中，HisFF凝胶为纤维交缠的三维网状结构，而氯仿中HisFF凝胶则有明显的重叠，部分结构堆积重叠，使其较易坍塌，机械稳定性差。HisFF在单独的乙酸乙酯溶剂中，也可形成脆弱的乳白色凝胶，但在半小时内坍塌。薄弱且聚集的纤维结构，是导致凝胶机械强度较差的原因。由此可知，纤维强度和聚集形态影响凝胶的强度。

图 4 HisFF不同有机溶剂凝胶的TEM图像 Figure 4. TEM images of HisFF organogel in different solvents

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由图 5可知，室温下，在凝胶因子的甲苯溶液浓度≥5mg/mL时，体系呈现凝胶状态；浓度小于5mg/mL时，为溶胶状态。HisFF纤维横向交联形成的三维网络结构，最大程度地阻止溶剂的流动，从而成为胶状物。HisFF甲苯凝胶的临界成胶浓度为5mg/mL。

图 5 HisFF甲苯溶胶-凝胶 (浓度为1~7 mg/mL) Figure 5. HisFF sol-gel in toluene (c_HisFF=1~7 mg/mL)

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绝大部分超分子凝胶都表现出敏感的温度响应。这是由于温度升高，分子运动加快，使部分凝胶因子分子无法参与组装，分子间非共价键作用力无法作为主要驱动力来维持组装结构形貌。实验结果证明，HisFF甲苯凝胶是可逆温敏性凝胶，临界溶解温度为353K (图 6)。将HisFF甲苯溶胶置于室温环境下冷却，凝胶又能重新凝固为固态。

图 6 HisFF甲苯凝胶的温度响应 Figure 6. The temperature response of HisFF toluene gel

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2.3   HisFF在不同溶剂中自组装

大量研究人员通过有机溶剂来调控多肽的自组装行为^{[11, 12]}。传统的方法是用少量溶液溶解多肽分子，然后加入其他溶剂作为共溶剂来促进多肽分子组装。也有一些工作是利用纯有机溶剂诱导组装，通常情况下会得到不同的结构。例如，FF溶于HFIP后，用水稀释促进组装，可以得到纳米管或纳米线形貌^{[13, 14]}；而在纯水溶剂中，会组装成纳米纤维^[15]。选择HisFF直接溶解在纯溶剂中和先用HFIP溶解再稀释两种方法，用多种有机溶剂诱导HisFF结构自组装形貌，结果发现，在相同浓度和静止时间下，部分溶剂对调控HisFF组装形貌影响较大。

通过样品的SEM图 (图 7) 发现，浓度为10mg/mL的HisFF丙酮溶液，可组装成直径约为50nm的纳米球粒；而将HFIP溶解的HisFF再由丙酮稀释成同等浓度，会组装成较粗的纤维短棒。浓度为10mg/mL的HisFF甲醇溶液，可组装成直径约为4μm的微米管；而将HFIP溶解的HisFF再由甲醇稀释成同等浓度，微米管会变成纳米纤维。同样，浓度为10mg/mL的HisFF EA溶液，可组装成螺旋状纳米纤维；而将HFIP溶解的HisFF再由EA稀释成同等浓度，螺旋纳米纤维消失，网状的纳米纤维粘联在一起。

图 7 HisFF在丙酮、甲醇和EA中通过不同方法自组装后的SEM图 Figure 7. SEM of HisFF self-assembly in acetone, methanol and EA via different methods

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在THF中，10mg/mL的HisFF为可组装成直径约为50nm的纳米纤维；在乙醇中可组装成较细、密集的纳米纤维；在乙腈中，可组装成较粗的纳米短纤。而先将HisFF溶解在HFIP后，再由上述3种溶剂稀释至同浓度，其形貌没有明显变化。

图 8 HisFF在THF、乙醇和乙腈溶剂中通过不同方法自组装的SEM图 Figure 8. SEM of HisFF self-assembly in THF, ethanol and acetonitrile via different methods

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HisFF的自组装是在大量氢键和π-π堆积等分子间弱相互作用力下协同完成的，它们引导HisFF的自组装，任何影响驱动力的因素的改变，都可能对组装的形貌结构产生影响。在制样方法及溶液浓度相同的情况下，HisFF水溶液随着静置时间的增加，其组装的形貌也有所不同。配制50mg/mL的HisFF水溶液，室温静置1h促进HisFF组装，大量氢键和苯环π-π堆积作用力为HisFF分子组装提供了驱动力，此时得到了团聚在一起的直径较细且相互交叉较少的纤维。随着孵化时间的增加，由于HisFF分子与水分子形成分子间氢键，促进其在水溶液中一直不断地完成自组装过程，产生的结构由简单到复杂，直到其内能趋于稳定，整个自组装过程比较缓慢。常温孵化一星期，大量细长纤维不断聚集，紧密排列组成粗纤维而析出。局部放大后可以看到粗纤维是由大量细小纤维紧密排列组成。组成网状粗纤维的孔隙较大，导致无法束缚水分子，未能形成凝胶 (图 9)。

图 9 HisFF水溶液自组装后的SEM图 Figure 9. SEM images of HisFF self-assembly in water solution

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3   结论

本文通过经典多肽固相合成法合成了HisFF有机凝胶因子，其可以在多种溶剂中形成凝胶，并且，该凝胶因子在不同溶剂、不同组装方法条件下，可以组装成不同的形貌。这一新型超分子凝胶因子的合成有望为新的软材料的制备创造条件。
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图式1 HisFF的合成路线

Scheme 1 The synthetic route of HisFF

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图 1 HisFF分子的质谱图

Figure 1 MS of HisFF molecule

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图 2 HisFF分子的核磁氢谱

Figure 2 ¹H NMR of HisFF molecule

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图 3 HisFF分子高效液相色谱图

Figure 3 HPLC of HisFF molecule

色谱柱：Venusil C18(5μm，250mm×4.6mm)；流速：1mL/min；流动相：0.1%TFA/高纯水 (A) 和0.1% TFA 80%乙腈+20%高纯水 (B)；梯度洗脱：26%~46%，20min，测定波长：220nm

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图 4 HisFF不同有机溶剂凝胶的TEM图像

Figure 4 TEM images of HisFF organogel in different solvents

c=5mg/mL；a：甲苯；b：氯仿；c：EA

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图 5 HisFF甲苯溶胶-凝胶 (浓度为1~7 mg/mL)

Figure 5 HisFF sol-gel in toluene (c_HisFF=1~7 mg/mL)

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图 6 HisFF甲苯凝胶的温度响应

Figure 6 The temperature response of HisFF toluene gel

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图 7 HisFF在丙酮、甲醇和EA中通过不同方法自组装后的SEM图

Figure 7 SEM of HisFF self-assembly in acetone, methanol and EA via different methods

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图 8 HisFF在THF、乙醇和乙腈溶剂中通过不同方法自组装的SEM图

Figure 8 SEM of HisFF self-assembly in THF, ethanol and acetonitrile via different methods

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图 9 HisFF水溶液自组装后的SEM图

Figure 9 SEM images of HisFF self-assembly in water solution

c=50 mg/mL，a：静置1h，b：孵化1周，内插图为局部放大图

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