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• 异噁唑啉是一类具有广泛生物活性的杂环化合物, 含有该结构片段的化合物也大多具有优良的生物活性, 如抗肿瘤、抗炎、抗菌和除草等^[1~3].异噁唑啉常被作为活性分子的母核片段, 已被开发成多种药物和农药, 如非甾体抗炎药伐地考昔, 抗生素苯唑西林、氟氯西林, 除草剂异噁草酮等.异噁唑啉不仅在医药上有着广泛的应用, 还在催化反应、电化学领域等都有广泛的应用^[4~6].因而, 近年来国内外对异噁唑啉, 特别是二氢异噁唑啉的研究日益增多^[7~10].大量研究发现, 二氢异噁唑啉环上带有的取代基对其生理活性有较大影响, 如3, 5-二芳基二氢异噁唑啉类化合物具有很好的免疫抑制活性和降血糖活性, 而3-芳基-5-呋喃基二氢异噁唑啉类化合物则具有较好的抗肿瘤和抗炎活性.如图 1所示, 化合物A具有很好的抗炎活性和镇痛活性^[11], 且活性与药物吲哚美辛和曲马多相当; 化合物C对肿瘤细胞具有显著地抑制活性^[12].

  图 1

  

  图 1.  二氢异噁唑啉衍生物的设计策略

  Figure 1.  Synthetic strategy of dihydroisoxazole derivatives

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  在前期研究中, 本课题组对含哌嗪取代的类天然产物进行了研究, 结果发现含有2-哌嗪基苯乙酮片段的苯并呋喃和查尔酮类化合物均表现出较好的细胞毒活性.如化合物B能有效抑制人肺癌细胞A549和人胃癌细胞SGC7901的增殖^[13]; 化合物D对人肺癌细胞A549、人胃癌细胞SGC7901和人宫颈癌细胞Hela都具有明显的细胞毒活性^[14](图 1).为了寻找具有良好生物活性的异噁唑啉分子, 我们采用活性亚结构拼合方法, 将呋喃环和哌嗪取代的芳环引入到二氢异噁唑啉分子中, 以期望得到具有更优生物活性的化合物, 设计思路见图 1.

  1.   结果与讨论

  1.1   目标化合物的合成

  目标化合物3~12的合成路线如Scheme 1所示.参照文献[15]的方法制备得到4'-(1-哌嗪基)呋喃查尔酮(1)后, 再与盐酸羟胺在碱性条件下经加成和缩合反应生成关键中间体3-[4-(1-哌嗪基)]苯基-5-(2-呋喃基)-4, 5-二氢异噁唑啉(2).在合成化合物2的过程中, 我们发现以NaOH作碱时, 反应效果较好.最后, 采用常规方法对哌嗪环上的NH基团进行衍生化即可得到目标产物.

  Scheme 1

  

  Scheme 1.  二氢异噁唑啉衍生物的合成

  Scheme 1.  Synthesis of dihydroisoxazole derivatives

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  1.2   细胞毒活性测试

  以5-氟尿嘧啶(5-FU)为对阳性对照, 采用噻唑蓝(MTT)法对三种肿瘤细胞株(人宫颈癌细胞Hela、人肺癌细胞A549和人胃癌细胞SGC7901)的体外细胞毒活性进行了测试, 结果见表 1所示.化合物4、6、7和11对肿瘤细胞株表现出良好的选择性抑制活性.其中, 化合物4对A549和SGC7901具有选择性的抑制活性, IC₅₀值分别为2.72和9.06 μmol/L; 化合物7对Hela和SGC7901具有选择性的细胞毒活性, IC₅₀值分别为11.14和19.25 μmol/L; 化合物6和11对三种肿瘤细胞株均表现出良好的细胞毒活性, IC₅₀值为2.57~7.51 μmol/L.

  表 1

  

  表 1  二氢异噁唑啉衍生物3~12的细胞毒活性(IC₅₀, μmol/L)

  Table 1.  Anticancer activity of dihydroisoxazole derivatives 3~12 (IC₅₀, μmol/L)

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  Compd.	Hela	A549	SGC7901
  3	30.12	＞40	＞40
  4	＞40	2.72	9.06
  5	7.62	＞40	＞40
  6	3.34	7. 51	2.57
  7	11.14	22.80	19.25
  8	＞40	28.65	＞40
  9	36.15	16.38	＞40
  10	＞40	＞40	23.04
  11	3.02	2.98	2.63
  12	＞40	＞40	＞40
  5-FU	10.72	10.55	11.96

  从以上活性结果可以看出, 在含哌嗪取代的3-芳基-5-呋喃基二氢异噁唑啉衍生物分子中, 哌嗪环NH基团上的不同取代基对化合物的细胞毒活性有较大影响.当NH基团被丙酮或芳基乙酮取代时, 细胞毒活性较强, 如化合4、6、7和11; 当被乙酸乙酯取代时, 细胞毒活性很弱, 如化合物3; 当被β-萘乙酮取代时, 对肿瘤细胞没有抑制活性, 如化合物12.另外, 通过比较芳基乙酮苯环上不同取代基及其活性结果, 我们发现, 当苯环上含有卤素或吸电子基团时, 化合物对肿瘤细胞的抑制活性增强, 如化合物6(F)和11 (CN)对三种肿瘤细胞株均显示出优于5-氟尿嘧啶的体外细胞毒作用; 当苯环上含有供电子基团时, 化合物对肿瘤细胞的抑制活性减弱, 如化合物9 (CH₃)和10 (CH₃O).由此, 我们推测除母核结构因素外, 哌嗪环NH基团上的取代基也是目标化合物细胞毒活性的关键因素.

  1.3   化合物4和11对A549细胞凋亡的影响

  大多数抗肿瘤药物均是通过诱导细胞凋亡的方式发挥细胞毒作用.在本研究中, 我们发现化合物4和11对肿瘤细胞A549的选择性抑制活性较强, 为了研究该类化合物是否通过诱导肿瘤细胞凋亡的机制而产生细胞毒活性, 我们采用Annexin-V FITC/PI双染法^[16]对化合物4和11诱导A549细胞凋亡情况进行了检测. A549细胞分别与化合物4 (2和5 μmol/L)和11 (5和10 mol/L)共同孵育24 h后经流式细胞术检测, 结果如图 2和图 3所示.从流式细胞分析结果可以看出, 化合物4和11均能够有效诱导肿瘤细胞A549的死亡, 且随着化合物的浓度增大, 诱导A549细胞的死亡率越高, 并显示出一定的剂量依赖关系.

  图 2

  

  图 2.  化合物4诱导肿瘤细胞株A549凋亡的影响

  Figure 2.  Effects of compound 4 on the apoptosis of A549 cells

  (a) blank, (b) 2 μmol/L, (c) 5 μmol/L

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  图 3

  

  图 3.  化合物11诱导肿瘤细胞株A549凋亡的影响

  Figure 3.  Effects of compound 11 on the apoptosis of A549 cells

  (a) blank, (b) 5 μmol/L, (c) 10 μmol/L

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  2.   结论

  采用活性亚结构拼接的方法, 设计合成了10个未见文献报道的新型含哌嗪取代的3-芳基-5-呋喃基-4, 5-二氢异噁唑啉衍生物3~12.采用MTT法测试了目标化合物的体外细胞毒活性(Hela、A549和SGC7901), 结果表明, 该类化合物普遍具有良好的细胞毒活性, 特别是化合物4、6和11对肿瘤细胞株的体外抑制活性与阳性对照5-氟尿嘧啶相当.流式细胞分析结果表明, 化合物4和11均能有效诱导肿瘤细胞株A549的凋亡, 并显示出较明显的剂量依赖关系.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  Bruker AM 400核磁共振波谱仪, TMS为内标; YANACO显微熔点仪, 温度未校正; AutoSpec Premier P776型双聚焦三扇型磁质谱仪; IR-Presstige-21型傅里叶变换红外光谱仪(岛津公司); 二氧化碳培养箱(美国Thermo-fisher); Epoch连续波长酶标仪(美国Bio-Tek公司); RPMI-1640培养基(Gibco B.R.L公司); 流式细胞仪(美国BD公司); AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒.所有试剂与溶剂均为市售分析纯.

  3.2   实验方法

  3.2.1   4'-(1-哌嗪基)呋喃查尔酮(1)的合成

  合成方法及表征数据与文献[15]一致.

  3.2.2   3-[4-(1-哌嗪基)]苯基-5-(2-呋喃基)-4, 5-二氢异噁唑啉(2)的合成

  称取化合物1 (2.82 g, 10 mmol)和盐酸羟胺(1.04 g, 15 mmol)于100 mL圆底烧瓶中, 加入氢氧化钠(0.8 g, 20 mmol)和40 mL无水乙醇加热回流反应过夜.薄层色谱(TLC)检测原料消失后, 冷却, 加入50 mL水, 并用二氯甲烷(DCM)萃取(20 mL×3).有机相经无水硫酸钠干燥后真空浓缩, 残余物经柱层析(以2% CH₃OH/DCM为洗脱剂)分离得到白色粉末固体2.14 g, 收率72%. m.p. 168~170 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.60 (d, J＝8.9 Hz, 2H), 7.40 (s, 1H), 6.91 (d, J＝8.9 Hz, 2H), 6.40 (d, J＝3.2 Hz, 1H), 6.35 (d, J＝1.9 Hz, 1H), 5.67 (t, J＝9.6 Hz, 1H), 3.58 (d, J＝9.6 Hz, 2H), 3.24 (t, J＝4.8 Hz, 4H), 3.04 (t, J＝5.3 Hz, 4H), 2.02 (s, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 156.1, 152.9, 152.3, 143.1, 128.1, 119.9, 115.1, 110.6, 108.6, 75.3, 49.3, 46.0, 39.4; IR (KBr) ν: 2918, 2825, 1607, 1520, 1361, 1234, 1150, 1011, 899, 822, 741 cm^－1; HRMS-ESI calcd for C₁₇H₂₀N₃O₂ (M+H)⁺ 298.1550, found 298.1545.

  3.2.3   化合物3~12的合成

  称取90 mg (0.3 mmol)化合物2于25 mL圆底烧瓶中, 依次加入10 mL无水DCM, 138 mg (1 mmol) K₂CO₃和0.5 mmol溴代物, 于室温下反应5~12 h. TLC检测反应完成后, 过滤, 滤液直接柱层析(以1% CH₃OH/ DCM为洗脱剂)分离得到目标化合物.

  3-{4-[N-(2-氧代乙醚基)-1-哌嗪基]}苯基-5-(2-呋喃基)-4, 5-二氢异噁唑啉(3):淡黄色固体, m.p. 153~155 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.58 (d, J＝8.9 Hz, 2H), 7.38 (s, 1H), 6.89 (d, J＝8.8 Hz, 2H), 6.38 (d, J＝3.2 Hz, 1H), 6.32~6.33 (dd, J＝1.8, 1.9 Hz, 1H), 5.65 (t, J＝9.6 Hz, 1H), 4.21 (q, J＝7.2 Hz, 2H), 3.56 (d, J＝9.6 Hz, 2H), 3.32 (t, J＝4.6 Hz, 4H), 3.25 (s, 2H), 2.74 (t, J＝4.8 Hz, 4H), 1.294 (t, J＝7.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 170.2, 156.0, 152.3, 142.1, 128.0, 127.9, 115.4, 115.1, 110.5, 108.5, 75.3, 60.7, 59.4, 52.8, 52.7, 48.2, 48.0, 39.3, 14.3; IR (KBr) ν: 2830, 1743, 1611, 1522, 1450, 1364, 1198, 887, 822, 743 cm^－1; HRMS-ESI calcd for C₂₁H₂₅N₃O₄Na (M+Na)⁺ 406.1737, found 406.1737.

  3-{4-[N-(2-氧代丙基)-1-哌嗪基]}苯基-5-(2-呋喃基)-4, 5-二氢异噁唑啉(4):黄褐色固体, m.p. 160~162 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.59 (d, J＝6.5 Hz, 2H), 7.41 (d, J＝5.3 Hz, 1H), 6.92 (d, J＝8.0 Hz, 1H), 6.91 (s, 1H), 6.40 (d, J＝3.5 Hz, 1H), 6.37 (d, J＝1.8 Hz, 1H), 5.61~5.68 (dd, J＝9.4 Hz, 8.7 Hz, 1H), 3.59 (t, J＝9.4 Hz, 2H), 3.31 (s, 2H), 3.27 (d, J＝5.7 Hz, 4H), 2.65 (s, 4H), 2.17 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 206.1, 156.0, 152.3, 152.2, 143.1, 128.0, 115.4, 115.1, 110.5, 108.5, 75.3, 68.0, 53.2, 53.1, 48.1, 48.0, 39.2, 27.8; IR (KBr) ν: 2830, 1720, 1609, 1522, 1443, 1360, 1236, 1148, 1013, 887, 822, 745 cm^－1; HRMS-ESI calcd for C₂₀H₂₄-N₃O₃ (M+H)⁺ 354.1812, found 354.1814.

  3-{4-[N-(2-氧代苯乙基)-1-哌嗪基]}苯基-5-(2-呋喃基)-4, 5-二氢异噁唑啉(5):淡黄色固体, m.p. 154~156 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.02 (d, J＝7.1 Hz, 2H), 7.55~7.60 (m, 3H), 7.48 (t, J＝7.8 Hz, 2H), 7.39 (s, 1H), 6.92 (d, J＝9.0 Hz, 2H), 6.39 (d, J＝3.2 Hz, 1H), 6.33~6.34 (dd, J＝1.8 Hz, 1.9 Hz, 1H), 5.66 (t, J＝9.6 Hz, 1H), 3.88 (s, 2H), 3.57 (d, J＝9.6 Hz, 2H), 3.36 (t, J＝4.9 Hz, 4H), 2.78 (t, J＝5.1 Hz, 4H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 196.3, 156.1, 152.4, 152.2, 143.1, 136.1, 136.5, 128.7, 128.2, 128.1, 119.9, 115.1, 110.5, 108.6, 75.3, 64.4, 53.3, 48.1, 39.3; IR (KBr) ν: 2835, 1697, 1611, 1522, 1449, 1389, 1221, 974, 893, 820, 737, 689 cm^－1; HRMS-ESI calcd for C₂₅H₂₆N₃O₃ (M+H)⁺ 416.1969, found 416.1967.

  3-{4-[N-(4'-氟-2-氧代苯乙基)-1-哌嗪基]}苯基-5-(2-呋喃基)-4, 5-二氢异噁唑啉(6):灰白色固体, m.p. 169~171 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.08 (d, J＝5.1 Hz, 2H), 7.61 (d, J＝8.6 Hz, 2H), 7.41 (s, 1H), 7.13~7.16 (dd, J＝8.5, 5.5 Hz, 2H), 6.93 (d, J＝8.6 Hz, 2H), 6.40 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.63~5.67 (dd, J＝9.5, 4.4 Hz, 1H), 3.84 (s, 2H), 3.59 (d, J＝5.2 Hz, 1H), 3.56 (d, J＝4.1 Hz, 1H), 3.33 (s, 4H), 2.75 (s, 4H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 194.8, 167.1 (d, J＝253.8 Hz, C—F), 156.0, 152.3, 52.2, 143.0, 131.0, 130.9, 128.0, 119.8, 115.8, 115.6, 115.1, 110.5, 108.5, 75.2, 64.5, 53.2, 48.0, 39.2; IR (KBr) ν: 2830, 1695, 1599, 1504, 1383, 1362, 1225, 1153, 978, 897, 822, 741 cm^－1; HRMS-ESI calcd for C₂₅H₂₅-N₃O₃F (M+H)⁺ 434.1874, found 434.1870.

  3-{4-[N-(4'-氯-2-氧代苯乙基)-1-哌嗪基]}苯基-5-(2-呋喃基)-4, 5-二氢异噁唑啉(7):淡黄色固体, m.p. 138~140 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.99 (d, J＝8.3 Hz, 2H), 7.61 (d, J＝8.4 Hz, 2H), 7.45 (d, J＝8.3 Hz, 2H), 7.41 (s, 1H), 6.92 (d, J＝8.4 Hz, 2H), 6.40 (d, J＝4.4 Hz, 1H), 6.34~6.35 (dd, J＝1.4 Hz, 1.7 Hz, 1H), 5.67 (t, J＝9.5 Hz, 1H), 3.83 (s, 2H), 3.58 (t, J＝9.5 Hz, 2H), 3.32 (s, 4H), 2.74 (s, 4H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 195.2, 156.0, 152.2, 152.1, 143.0, 139.8, 134.3, 129.7, 128.9, 128.0, 119.8, 115.0, 110.5, 108.5, 75.2, 64.5, 53.2, 48.0, 39.2; IR (KBr) ν: 2830, 1695, 1611, 1587, 1520, 1383, 1217, 1092, 976, 897, 824, 743 cm^－1; HRMS-ESI calcd for C₂₅H₂₅N₃O₃Cl (M+H)⁺ 450.1579, found 450.1579.

  3-{4-[N-(4'-溴-2-氧代苯乙基)-1-哌嗪基]}苯基-5-(2-呋喃基)-4, 5-二氢异噁唑啉(8):黄色固体, m.p. 181~183 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.88~7.91 (m, 2H), 7.60 (d, J＝8.6 Hz, 2H), 7.59 (d, J＝6.6 Hz, 2H), 7.40 (s, 1H), 6.91 (d, J＝8.6 Hz, 1H), 6.90 (d, J＝6.8 Hz, 1H), 6.40 (s, 1H), 6.34 (s, 1H), 5.61~5.67 (m, 1H), 3.82 (s, 2H), 3.58 (d, J＝3.8 Hz, 3.8 Hz, 1H), 3.56 (d, J＝3.8 Hz, 1H), 3.33 (d, J＝3.0 Hz, 4H), 2.75 (d, J＝3.6 Hz, 4H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 195.4, 156.0, 152.3, 152.2, 143.1, 134.7, 132.0, 129.8, 128.6, 128.0, 119.9, 115.1, 110.5, 108.5, 75.3, 64.5, 53.2, 48.0, 39.2; IR (KBr) ν: 2830, 1693, 1609, 1585, 1520, 1385, 1219, 1151, 1070, 1011, 974, 893, 822, 743 cm^－1; HRMS-ESI calcd for C₂₅H₂₅N₃O₃Br (M+H)⁺ 494.1074, found 494.1070.

  3-{4-[N-(4'-甲基-2-氧代苯乙基)-1-哌嗪基]}苯基-5-(2-呋喃基)-4, 5-二氢异噁唑啉(9):黄色固体, m.p. 170~172 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.92 (d, J＝8.2 Hz, 2H), 7.59 (d, J＝8.9 Hz, 2H), 7.39 (s, 1H), 7.26 (d, J＝8.2 Hz, 2H), 6.91 (d, J＝9.0 Hz, 2H), 6.39 (d, J＝3.2 Hz, 1H), 6.33~6.3 4 (dd, J＝1.8, 1.8 Hz, 1H), 5.66 (t, J＝9.6 Hz, 1H), 3.85 (s, 2H), 3.57 (d, J＝9.6 Hz, 2H), 3.37 (q, J＝5.4 Hz, 4H), 2.78 (q, J＝5.3 Hz, 4H), 2.40 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 195.8, 156.1, 152.4, 152.2, 144.3, 143.1, 133.6, 129.3, 128.3, 128.0, 119.8, 115.4, 115.1, 110.5, 108.5, 75.3, 64.3, 53.3, 53.3, 48.18, 48.0, 39.3, 21.7; IR (KBr) ν: 2835, 1684, 1607, 1520, 1437, 1389, 1227, 1163, 974, 806, 748 cm^－1; HRMS-ESI calcd for C₂₆H₂₈N₃O₃ (M+H)⁺ 430.2125, found 430.2122.

  3-{4-[N-(4'-甲氧基-2-氧代苯乙基)-1-哌嗪基]}苯基-5-(2-呋喃基)-4, 5-二氢异噁唑啉(10):淡黄色固体, m.p. 156~158 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.02 (d, J＝9.0 Hz, 2H), 7.59 (d, J＝9.0 Hz, 2H), 6.88~6.94 (m, 4H), 6.38~6.39 (m, 1H), 6.33~6.34 (dd, J＝1.8, 1.8 Hz, 1H), 5.66 (t, J＝9.6 Hz, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.81 (s, 2H), 3.57 (d, J＝9.6 Hz, 2H), 3.36 (q, J＝5.4 Hz, 4H), 2.77 (q, J＝5.3 Hz, 4H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 194.8, 163.8, 156.1, 152.4, 143.1, 130.59, 128.0, 115.4, 115.1, 113.8, 110.5, 108.5, 75.3, 64.3, 55.6, 53.3, 48.1, 39.3; IR (KBr) ν: 2837, 1676, 1601, 1514, 1441, 1310, 1260, 1157, 974, 887, 820 cm^－1; HRMS-ESI calcd for C₂₆H₂₈N₃O₃ (M+H)⁺ 446.2074, found 446.2074.

  3-{4-[N-(4'-氰基-2-氧代苯乙基)-1-哌嗪基]}苯基-5-(2-呋喃基)-4, 5-二氢异噁唑啉(11):灰白色固体, m.p. 177~179 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.99 (d, J＝8.4 Hz, 2H), 7.63 (d, J＝8.3 Hz, 2H), 7.46 (d, J＝8.8 Hz, 2H), 7.26 (s, 1H), 6.77 (d, J＝8.8 Hz, 2H), 6.26 (d, J＝3.2 Hz, 1H), 6.21 (d, J＝1.9 Hz, 1H), 5.53 (t, J＝9.6 Hz, 1H), 3.71 (s, 2H), 3.44 (d, J＝9.6 Hz, 2H), 3.20 (t, J＝4.5 Hz, 4H), 2.63 (t, J＝4.7 Hz, 4H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 195.3, 156.1, 152.3, 152.2, 143.1, 132.5, 128.9, 128.1, 128.0, 115.2, 110.6, 108.6, 75.4, 64.9, 53.3, 48.1, 39.3; IR (KBr) ν: 2831, 1697, 1609, 1520, 1387, 1258, 1234, 1013, 978, 887, 818, 746 cm^－1; HRMS-ESI calcd for C₂₆H₂₄N₄-O₃Na (M+Na)⁺ 463.1741, found 463.1741.

  3-{4-[N-(2-氧代-β-萘乙基)-1-哌嗪基]}苯基-5-(2-呋喃基)-4, 5-二氢异噁唑啉(12):淡黄色固体, m.p. 161~163 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.56 (s, 1H), 8.06 (d, J＝8.5 Hz, 1H), 7.96 (d, J＝7.9 Hz, 1H), 7.89 (t, J＝8.9 Hz, 2H), 7.54~7.59 (m, 4H), 7.38 (s, 1H), 6.90 (d, J＝8.3 Hz, 2H), 6.38 (s, 1H), 6.33 (s, 1H), 5.65 (t, J＝9.5 Hz, 1H), 4.00 (s, 2H), 3.55 (d, J＝9.6 Hz, 2H), 3.34 (s, 4H), 2.80 (s, 4H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 196.2, 156.1, 152.3, 152.2, 143.0, 135.8, 133.4, 132.5, 129.9, 129.7, 128.7, 128.5, 127.8, 126.9, 123.9, 119.8, 115.1, 110.5, 108.5; IR (KBr) ν: 2839, 1688, 1605, 1520, 1364, 1236, 1155, 1001, 905, 820, 743 cm^－1; HRMS-ESI calcd for C₂₉H₂₈N₃O₃ (M+H)⁺ 466.2155, found 466.2155.

  3.3   细胞毒活性

  以5-氟尿嘧啶(5-FU)为对阳性对照, 采用MTT法测定目标化合物的体外细胞毒活性.取对数生长期的肿瘤细胞(5×10⁴个/mL)接种于96孔板中, 培养过夜后加入化合物, 设置6个浓度梯度, 每个浓度3个复孔.作用48 h后, 每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT, 继续培养4 h, 于3000 r/min离心10 min, 吸弃培养液, 加入150 μL DMSO, 酶标仪570 nm波长测定吸光度, 计算IC₅₀值.

  3.4   细胞凋亡

  参照AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书, 取对数期细胞A549消化制成细胞悬液, 加入1 mL 4×10⁵个/mL肿瘤细胞于六孔细胞培养板内过夜培养, 加入活性化合物(0、2、5、10 μmol/L)孵育24 h后收集经不同浓度处理后的细胞, 用冷PBS洗1遍后置0 ℃水浴中, 加500 μL Annexin Binding Buffer轻轻重悬细胞, 再加入5 μL Annexin V和5 μL PI, 轻轻混匀细胞, 冰浴中避光放置10 min后, 进行流式细胞仪检测.

  辅助材料(Supporting Information)   文中所有化合物的IR、¹H NMR和¹³C NMR及HRMS谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

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  图 1  二氢异噁唑啉衍生物的设计策略

  Figure 1  Synthetic strategy of dihydroisoxazole derivatives

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  Scheme 1  二氢异噁唑啉衍生物的合成

  Scheme 1  Synthesis of dihydroisoxazole derivatives

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  图 2  化合物4诱导肿瘤细胞株A549凋亡的影响

  Figure 2  Effects of compound 4 on the apoptosis of A549 cells

  (a) blank, (b) 2 μmol/L, (c) 5 μmol/L

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  图 3  化合物11诱导肿瘤细胞株A549凋亡的影响

  Figure 3  Effects of compound 11 on the apoptosis of A549 cells

  (a) blank, (b) 5 μmol/L, (c) 10 μmol/L

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  表 1  二氢异噁唑啉衍生物3~12的细胞毒活性(IC₅₀, μmol/L)

  Table 1.  Anticancer activity of dihydroisoxazole derivatives 3~12 (IC₅₀, μmol/L)

  Compd.	Hela	A549	SGC7901
  3	30.12	＞40	＞40
  4	＞40	2.72	9.06
  5	7.62	＞40	＞40
  6	3.34	7. 51	2.57
  7	11.14	22.80	19.25
  8	＞40	28.65	＞40
  9	36.15	16.38	＞40
  10	＞40	＞40	23.04
  11	3.02	2.98	2.63
  12	＞40	＞40	＞40
  5-FU	10.72	10.55	11.96

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