一种苯并噻唑衍生物对H<sub>2</sub>S的荧光识别及细胞成像

引用本文: 何平, 汤立军, 钟克利, 侯淑华, 燕小梅. 一种苯并噻唑衍生物对H₂S的荧光识别及细胞成像[J]. 有机化学, 2017, 37(2): 423-428. doi: 10.6023/cjoc201608003 shu

Citation: He Ping, Tang Lijun, Zhong Keli, Hou Shuhua, Yan Xiaomei. Fluorescence Recognition of H₂S by a Benzothiazole Derivative and Its Live Cell Imaging[J]. Chinese Journal of Organic Chemistry, 2017, 37(2): 423-428. doi: 10.6023/cjoc201608003 shu

一种苯并噻唑衍生物对H₂S的荧光识别及细胞成像

何平 ^a, ,
汤立军 ^{a,*,
,} ,
钟克利 ^a, ,
侯淑华 ^a, ,
燕小梅 ^{b,*,
,}

a.
渤海大学化学化工学院锦州 121013
b.
大连医科大学检验医学院大连 116044

通讯作者: 汤立军, ljtang@bhu.edu.cn; 燕小梅, xmyan1978@sina.com

基金项目:
国家自然科学基金 U1608222

辽宁省高等学校优秀人才支持计划 LR2015001

国家自然科学基金 21476029

摘要: 以3-（2-苯并噻唑基）-2-羟基-5-甲基苯甲醛为原料，合成了一种基于苯并噻唑类衍生物的荧光探针2-（4-叠氮苄氧基）-3-（2-苯并[d]噻唑基）-5-甲基苯甲醛（HBTA），表征了其结构，研究了HBTA对H₂S的识别性质.实验结果表明，HBTA在水溶液中（Tris-HCl 0.01 mol·L^-1，pH=7.4，含0.005 mol·L^-1 CTAB）对H₂S具有良好的选择性和灵敏度，且响应快速，抗干扰能力强，并且在较宽的pH范围内有较好的荧光响应，其检测限为9.09×10^-7 mol·L^-1.细胞成像实验表明，HBTA可用于检测细胞内的H₂S.

关键词:

English

Fluorescence Recognition of H₂S by a Benzothiazole Derivative and Its Live Cell Imaging

He Ping ^a, ,
Tang Lijun ^{a,*,
,} ,
Zhong Keli ^a, ,
Hou Shuhua ^a, ,
Yan Xiaomei ^{b,*,
,}

a.
College of Chemistry and Chemical Engineering, Bohai University, Jinzhou 121013
b.
College of Laboratory Medicine, Dalian Medical University, Dalian 116044

Corresponding author: Tang Lijun, E-mail: ljtang@bhu.edu.cn; Yan Xiaomei, E-mail: xmyan1978@sina.com

Received Date: 04 August 2016
Revised Date: 19 September 2016
Fund Project:
the National Natural Science Foundation of China

the Liaoning Excellent Talents in University

the National Natural Science Foundation of China

Abstract: A new benzothiazole-derived fluorescence probe 2-(4-azidobenzyl) oxy-3-(benzo[d]thiazol-2-yl)-5-methylben-zaldehyde (HBTA) was synthesized from 3-(benzo[d]thiazol-2-yl)-2-hydroxy-5-methylbenzaldehyde, and the structure of HBTA was characterized. The recognition behaviors of HBTA to H₂S were investigated and the results show that HBTA exhibits good selectivity and sensitivity to H₂S with fast response and good anti-interference ability. The probe can be applied to detect H₂S in a broad pH range, and the detection limit of HBTA for H₂S was estimated to be 9.09×10^-7 mol·L^-1. Cell imaging studies reveal that HBTA is capable of detect H₂S in live cells.

Key words:

众所周知, 硫化氢 (H₂S) 是一种带有臭鸡蛋气味的有毒气体, 而且也是继CO和NO后, 第三个被定义为内源性气体信号分子^[1].硫化氢气体主要来自于火山喷发以及微生物分解动植物尸体, 哺乳动物细胞自身通过胱硫醚-β-合成酶 (CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶 (CSE)、3-巯基丙酮酸硫基转移酶 (3-MST) 等酶的作用也可以产生硫化氢.过量的硫化氢会刺激眼睛和呼吸道, 严重的可导致意识丧失, 呼吸衰竭甚至死亡^[2].人体内硫化氢的含量与阿尔兹海默氏症、唐氏综合症、糖尿病和肝硬化等疾病也密切相关^[3].此外, 硫化氢能够作为体内的一种抗氧化剂清除多种氧化性物质^[4], 硫化氢也可以起到抑制炎症与保护心血管的作用^[5].由此可见, 对硫化氢的检测具有重要意义.

鉴于H₂S在生物学上的重要性, 科学家们已经开发了多种检测方法, 如比色法、电化学法以及气相色谱法等^[6].相比于这些传统的检测方法, 荧光分析法因其选择性好、灵敏度高、简单快速等优点而被广泛应用.近年来, 基于H₂S的亲核性, 还原性以及对铜离子的选择性结合作用, 人们设计合成了很多检测H₂S的荧光探针^[7].例如, Xian等^[8]利用亲核取代反应设计合成了一种识别H₂S的荧光探针Probe 1, 范方禄等^[9]通过H₂S对叠氮基的还原性设计合成了一种检测H₂S的荧光探针2-(4-叠氮基苯基) 苯并噻唑 (FL), Zeng等^[10]利用S^2-与Cu²⁺的强亲和力, 设计合成了一种识别H₂S的铜配合物型荧光探针L1.但是大多数已报道的H₂S荧光探针仍然存在一些局限性, 如合成路线复杂、发射波长较短、响应时间较长以及不适用于在纯水溶液中对H₂S进行检测等.因此, 设计并合成更为优越的H₂S荧光探针具有重要意义.由于2-(2'-羟基苯基) 苯并噻唑 (HBT) 类化合物大多具有优良的荧光性能, 鉴于此, 我们对HBT的结构进行了简单修饰, 设计合成了荧光探针HBTA (Eq. 1), 并将其用于H₂S的荧光识别.结果表明, HBTA对H₂S具有高度的选择性和灵敏度, 响应快速, 并可用于活细胞荧光成像.

1   结果与讨论

1.1   荧光探针HBTA的光谱性能研究

1.2   探针HBTA对HS^-的细胞成像及其细胞毒性

鉴于HBTA对HS^-的良好识别性质, 我们进而开展了细胞成像实验.将MCF-7细胞与探针HBTA (1.0× 10^-5 mol•L^-1) 在37 ℃共同孵育0.5 h, 然后用磷酸缓冲液 (PBS) 洗涤3次并采集明场和暗场图像.再向孵育过的细胞中加入不同浓度的HS^-, 再于37 ℃下孵育0.5 h并采集明场和暗场图像.探针HBTA单独孵育的MCF-7细胞只有微弱的绿色荧光 (图 8A), 当HS^-的浓度逐渐增加时, 观察到的绿色荧光逐渐增强 (图 8B~8D).这些结果表明探针HBTA具有良好的细胞渗透性, 可以用来检测活细胞中的HS^-.

图 8 MCF-7细胞在HBTA以及不同浓度HS^-存在下的荧光成像 Figure 8. Fluorescence imaging of MCF-7 cells incubated with HBTA and different concentrations of HS^-

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为了更好地证明探针HBTA在生物体内的潜在应用, 用CCK-8法在MCF-7细胞中对探针HBTA进行了细胞毒性测试.实验结果 (图 9) 表明, 探针HBTA在细胞中培养24 h后, 低浓度的HBTA (＜1.0×10^-5 mol•L^-1) 对细胞生长起到了增殖作用, 而当HBTA浓度高于1.0×10^-5 mol•L^-1时, 对细胞生长具有一定的抑制作用, 并且这种抑制作用随时间的延长而逐渐增强.经计算HBTA的IC₅₀值为2.31×10^-4 mol•L^-1, 说明低浓度的HBTA对细胞的毒性很小, 因而探针HBTA适用于长时间地对活细胞中H₂S的检测.

图 9 利用CCK-8试剂盒检测不同浓度的HBTA在24和48 h内对MCF-7细胞的生长抑制作用 Figure 9. Inhibition effects of different concentration HBTA on MCF-7 cell growth in 24 and 48 h using CCK-8 assay

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1.1.3   不同浓度的H₂S对探针光谱的影响

为了验证探针HBTA的灵敏度, 在Tris-HCl缓冲液中, 测试了HS^-在不同浓度条件下的荧光光谱图, 如图 5所示.当逐渐增大HS^-浓度时, HBTA溶液在556 nm处的荧光强度逐渐增强, 当加入1.5×10^-4 mol•L^-1的HS^-后, 荧光强度基本保持不变, 说明反应体系已经达到饱和.与无NaHS存在时相比, 此时的荧光强度约增强了4.6倍.根据滴定实验发现, 探针HBTA溶液的荧光强度与HS^-浓度 (0~1.0×10^-5 mol•L^-1) 有较好的线性关系 (线性相关系数: R²=0.99493), 表明探针HBTA可以用来定量检测H₂S.根据文献的计算方法LOD=3σ/ρ(σ是空白样的标准偏差, ρ是荧光强度与NaHS浓度线性关系的斜率)^[15], 探针HBTA对H₂S的检测限为9.09×10^-7 mol•L^-1.此外, HBTA对NaHS响应也较快.如图 6所示, 向HBTA (1.0×10^-5 mol•L^-1) 中加入1.5×10^-4 mol•L^-1的NaHS, 12 min后反应体系的荧光强度基本恒定, 说明此时NaHS与HBTA的反应已达终点.依据公式I_t=I_max+A×exp (-k×t) 计算了准一级反应的反应速率常数^[16].在公式中, I_t代表t时刻556 nm处的荧光强度, I_max代表 556 nm处的最大荧光强度.计算出的一级反应速率常数k为0.275 min^-1.

图 5 探针HBTA (1.0×10^-5 mol•L^-1) 在不同浓度的HS^- (0~1.5×10^-4 mol•L^-1) 中的荧光光谱图 Figure 5. Fluorescence spectra of HBTA (1.0×10^-5 mol/L) in the presence of HS^- (0~1.5×10^-4 mol•L^-1)

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图 6 Tris-HCl溶液中HBTA对HS^-的准一级反应动力学曲线 Figure 6. Kinetic study of the response of HBTA to HS^- under pseudo-first-order conditions in Tris-HCl solution

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1.1.2   探针HBTA识别H₂S的抗干扰性能

为了验证探针HBTA对其他阴离子的抗干扰能力, 我们进行了竞争性实验, 结果如图 4所示.当探针HBTA溶液的浓度为1.0×10^-5 mol•L^-1时, 分别加入1.5×10^-4 mol•L^-1的各种其它离子, 荧光强度无明显变化.继续向测试液中加入1.5×10^-4 mol•L^-1的HS^-后, 荧光强度显著增强, 表明其他共存的阴离子对HS^-的识别过程无明显干扰, 说明探针HBTA对HS^-的识别具有较强的抗干扰能力.

图 4 干扰离子 (1.5×10^-4 mol•L^-1) 和NaHS (1.5×10^-4 mol• L^-1) 共存时探针HBTA ((1.0×10^-5 mol•L^-1) 在Tris-HCl溶液中的荧光发射光谱的变化 (λ_em=556 nm) Figure 4. Fluorescence intensity (556 nm) changes of HBTA (1.0×10^-5 mol•L^-1) in Tris-HCl solution upon individual addition of 1.5×10^-4 mol/L of miscellaneous anions and followed by further addition of 1.5×10^-4 mol•L^-1 of HS^-

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1.1.4   pH对探针HBTA和HBTA+HS^-荧光光谱的影响

为了考察pH对探针实际应用的影响, 实验测定了不同pH值对探针HBTA与HBTA+HS^-的荧光强度的影响.如图 7所示, HBTA在pH 2~4的范围内基本没有荧光, 在pH 4~8之间显示出微弱荧光, 在碱性条件下HBTA的荧光略有增强.加入HS^-后, HBTA在pH 7~13范围内产生强而稳定的荧光响应信号, 这表明HBTA可以在较宽的pH范围内对H₂S进行检测.

图 7 HBTA及HBTA+HS^-在不同pH值时荧光强度的变化 (λ_ex=440 nm) Figure 7. Change in fluorescence intensity of probe HBTA and HBTA+HS^- under different pH (λ_ex=440 nm)

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1.1.1   荧光探针HBTA对阴离子的选择性

为了确定化合物HBTA对阴离子的识别性能, 我们考察了HBTA (1.0×10^-5 mol•L^-1) 对常见阴离子以及巯基氨基酸 (1.5×10^-4 mol•L^-1) 的荧光响应 (图 1).在实验中, 为了提高探针HBTA在Tris-HCl缓冲体系中的溶解度, 我们加入了0.005 mol•L^-1的表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 作为助溶剂^[11].采用NaHS作为H₂S供体进行探针对H₂S响应性能的研究, 这是因为在生理条件下 (pH=7.4) H₂S主要以HS^-形式存在, 细胞内HS^-与H₂S的比例约为3:1^[12], 因此NaHS被广泛用作水溶液中H₂S的来源^[13].在Tris-HCl缓冲体系中, HBTA在556 nm处具有较弱的荧光发射, 当加入HS^-后, HBTA溶液的荧光发射显著增强, 加入谷胱甘肽时荧光略有增强, 而加入其他阴离子 (包括AcO^-, Br^-, Cl^-, ClO^-, CN^-, NO₂^-, NO₃^-, SO₃^2-, F^-, CO₃^2-, I^-, SO₂^4-, PO₄^3-, SCN^-, HPO₄^2-, HPO₄^2-, HSO₃^-, HCO₃^-, SO₂O₃^2-, PPi) 和巯基氨基酸 (Cys, Hcy) 时, 其荧光光谱未发生显著改变.因此HBTA可以作为一种高选择性检测H₂S的荧光增强型探针.此外, 加入H₂S后的HBTA溶液与同等浓度的化合物1溶液具有几乎相同的荧光光谱 (图 1插图), 表明HBTA与H₂S反应后, 释放出了化合物1.

图 1 探针HBTA (1.0×10^-5 mol•L^-1) 加入各种阴离子及含巯基氨基酸 (1.5×10^-4 mol•L^-1) 的荧光光谱变化 (λ_ex=440 nm) Figure 1. Fluorescence spectrum changes of HBTA (1.0×10^-5 mol•L^-1) in Tris-HCl upon individual addition of 1.5×10^-4 mol•L^-1 different anions and biothiols (Cys, Hcy, GSH) (λ_ex=440 nm)

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为了进一步验证探针HBTA与NaHS的反应, 我们在DMSO/H₂O (V:V=1:1) 溶液中尝试了HBTA与NaHS的反应, 并用薄层色谱进行跟踪 (图 2).如图 2所示, 反应混合物中出现于化合物1相对应的组分, 并具有相同的R_f值.为进一步确证, 我们分离了该产物并与化合物1进行了核磁共振氢谱对照 (图 3).结果显示, 该分离产物与化合物1具有相同的氢谱谱图.以上结果表明, HBTA与HS^-反应后释放出了化合物1. HBTA中的叠氮基首先被H₂S还原为氨基, 进而发生消除反应释放出化合物1, 其机理如Scheme 1所示^[14].

图 2 化合物1和反应混合物的TLC对照 Figure 2. TLC comparison of compound 1 with the reaction mixture of HBTA and HS^-

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图 3 化合物1 (a) 与探针HBTA与NaHS反应的分离产物 (b) 的核磁共振氢谱 (DMSO-d₆) 对照 Figure 3. ¹H NMR spectra (in DMSO-d₆) comparison of compound1(a), and the product obtained after reaction of the probe HBTA with NaHS (b)

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图图式1 HBTA对H₂S的识别机理 Figure 图式1. Sensing mechanism of HBTA to H₂S

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2   结论

合成了一种新型的荧光增强型的反应型荧光探针HBTA, 通过H₂S引发HBTA的还原、消除串联反应释放出前体化合物1.探针HBTA对H₂S具有良好的选择性与灵敏度, 且响应较快, 对H₂S的检测限为9.09× 10^-7 mol•L^-1.此外, HBTA可用于活细胞内H₂S的检测, 具有潜在的应用价值.

3   实验部分

3.1   仪器与试剂

400 NMR核磁共振仪 (美国Agilent公司); Bruker micrOTOF-Q高分辨质谱仪 (Bruker Daltonik, 不来梅, 德国); 荧光分光光度计 (970CRT, 上海三科); pH计Model PHS-25B (中国, 上海); DFM-60荧光倒置显微镜 (Leica, 德国).所有试剂和溶剂均为市售分析纯, NaHS作为H₂S的等效试剂, 乙醇、DMF使用前按照标准方法干燥处理.化合物1^[17]和2^[18]根据文献方法合成.

3.2   实验方法

3.2.3   HBTA细胞毒性测定方法

MCF-7的培养条件:含有体积分数为10%的小牛血清的DMEM-F12培养基在37 ℃, 体积分数为5% CO₂环境中培养.待细胞长到70%~80%的融合度时, 去掉培养液, 质量分数为0.25%的胰酶蛋白消化后, 进行实验操作.

细胞毒性实验:胰酶消化后的MCF-7细胞接种于96孔板, 每孔控制细胞数目为10⁴个, 待贴壁后加入不同浓度的HBTA (0×10^-6, 0.1×10^-6, 1×10^-6, 10×10^-6, 50×10^-6, 100×10^-6, 500×10^-6 mol•L^-1), 培养24和48 h后按cell counting kit-8 (CCK-8) 试剂盒 (凯基, KGA317) 说明进行操作, 37 ℃孵育2 h后利用酶标仪在450 nm检测其OD值.

辅助材料 (Supporting Information) 2-(4-叠氮苄氧基)-3-(2-苯并[d]噻唑基)-5-甲基苯甲醛 (HBTA) 的¹H NMR, ¹³C NMR以及HRMS谱图.这些材料可以免费从本刊网站 (http://sioc-journal.cn/) 上下载.

3.2.2   荧光光谱测定方法

探针HBTA以DMSO为溶剂配制成1.0×10^-3 mol•L^-1的溶液, 然后用Tris-HCl缓冲液 (0.01 mol•L^-1, pH=7.4, 含5 mmol•L^-1 CTAB) 稀释成1.0×10^-5 mol• L^-1溶液; 以二次蒸馏水为溶剂, 采用钠盐或钾盐配制5.0×10^-3 mol•L^-1的各种阴离子 (HS^-, AcO^-, Br^-, Cl^-, ClO^-, CN^-, NO₂^-, NO₃^-, SO₃^2-, F^-, CO₃^2-, I^-, SO₄^2-, PO₄^3-, SCN^-, HPO₄^2-, H₂PO₄^-, HSO^-3, HCO₃^-, S₂O₃^2-, PPi, Cys, Hcy, GSH).荧光光谱测定均在室温条件下进行.样品池为1 cm×1 cm×4 cm石英比色皿, 灵敏度设置为3, 激发狭缝宽10 nm, 发射狭缝宽2 nm, 激发波长440 nm, 于440~800 nm范围内检测荧光光谱.

3.2.1   2-(4-叠氮苄氧基)-3-(2-苯并[d]噻唑基)-5-甲基苯甲醛 (HBTA) 的合成

将化合物2 (200 mg, 1.34 mmol) 溶解在5 mL DMF中, 随后, 加入化合物1(269 mg, 1.0 mmol) 和K₂CO₃ (278 mg, 2.01 mmol), 混合物在室温条件下反应, 薄层色谱 (TLC) 跟踪直至化合物1消失.反应混合物用乙酸乙酯萃取 (50 mL×3), 有机相用水洗多次后用无水硫酸钠干燥, 过滤, 旋干.粗产品用乙醇重结晶, 得到白色针状固体273 mg, 产率68%. m.p. 139.3~140.0 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 10.21 (s, 1H), 8.42 (d, J=2.4 Hz, 1H), 8.13 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.94 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.77 (d, J=2.4 Hz, 1H), 7.56~7.53 (m, 1H), 7.46~7.42 (m, 1H), 7.37 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.01 (d, J=8.4 Hz, 2H), 4.99 (s, 2H), 2.48 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ:189.09, 161.88, 156.96, 152.34, 140.61, 136.65, 136.00, 135.32, 131.75, 131.73, 130.26, 130.06, 128.17, 126.42, 125.49, 123.22, 121.56, 119.20, 78.91, 20.75; HRMS (ESI⁺) calcd for C₂₂H₁₆N₄NaO₂S [M+Na⁺] 423.0892, found 423.0929.
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图 1 探针HBTA (1.0×10^-5 mol•L^-1) 加入各种阴离子及含巯基氨基酸 (1.5×10^-4 mol•L^-1) 的荧光光谱变化 (λ_ex=440 nm)

Figure 1 Fluorescence spectrum changes of HBTA (1.0×10^-5 mol•L^-1) in Tris-HCl upon individual addition of 1.5×10^-4 mol•L^-1 different anions and biothiols (Cys, Hcy, GSH) (λ_ex=440 nm)

Inset: Fluorescence color changes of HBTA solution before and after addition of HS^- under illumination at 365 nm with a portable UV lamp (left) and comparative compound 1 and HBTA+HS^- (right)

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图 2 化合物1和反应混合物的TLC对照

Figure 2 TLC comparison of compound 1 with the reaction mixture of HBTA and HS^-

Left: 254 nm, right: 365 nm. Spots on the TLC plate are: (a) reaction mixture of probe HBTA and NaHS, (b) probe HBTA, and (c) compound 1

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图 3 化合物1 (a) 与探针HBTA与NaHS反应的分离产物 (b) 的核磁共振氢谱 (DMSO-d₆) 对照

Figure 3 ¹H NMR spectra (in DMSO-d₆) comparison of compound1(a), and the product obtained after reaction of the probe HBTA with NaHS (b)

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图式1 HBTA对H₂S的识别机理

Scheme 1 Sensing mechanism of HBTA to H₂S

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图 4 干扰离子 (1.5×10^-4 mol•L^-1) 和NaHS (1.5×10^-4 mol• L^-1) 共存时探针HBTA ((1.0×10^-5 mol•L^-1) 在Tris-HCl溶液中的荧光发射光谱的变化 (λ_em=556 nm)

Figure 4 Fluorescence intensity (556 nm) changes of HBTA (1.0×10^-5 mol•L^-1) in Tris-HCl solution upon individual addition of 1.5×10^-4 mol/L of miscellaneous anions and followed by further addition of 1.5×10^-4 mol•L^-1 of HS^-

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图 5 探针HBTA (1.0×10^-5 mol•L^-1) 在不同浓度的HS^- (0~1.5×10^-4 mol•L^-1) 中的荧光光谱图

Figure 5 Fluorescence spectra of HBTA (1.0×10^-5 mol/L) in the presence of HS^- (0~1.5×10^-4 mol•L^-1)

Inset: fluorescence intensity of HBTA as a function of NaHS concentration (0~1.0×10^-5 mol•L^-1). λ_ex=440 nm

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图 6 Tris-HCl溶液中HBTA对HS^-的准一级反应动力学曲线

Figure 6 Kinetic study of the response of HBTA to HS^- under pseudo-first-order conditions in Tris-HCl solution

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图 7 HBTA及HBTA+HS^-在不同pH值时荧光强度的变化 (λ_ex=440 nm)

Figure 7 Change in fluorescence intensity of probe HBTA and HBTA+HS^- under different pH (λ_ex=440 nm)

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图 8 MCF-7细胞在HBTA以及不同浓度HS^-存在下的荧光成像

Figure 8 Fluorescence imaging of MCF-7 cells incubated with HBTA and different concentrations of HS^-

From A to D, the concentrations of HS^- are 0, 10, 30, and 50×10^-6 mol•L^-1, respectively

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图 9 利用CCK-8试剂盒检测不同浓度的HBTA在24和48 h内对MCF-7细胞的生长抑制作用

Figure 9 Inhibition effects of different concentration HBTA on MCF-7 cell growth in 24 and 48 h using CCK-8 assay

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