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  异噁唑啉具有较弱的碱性和N-亲核性, 易与较强的甲基化试剂反应生成N-甲基异噁唑啉盐, 异噁唑啉盐在有机合成中表现出潜在的多功能中间体^[1~8]的作用, 引起了科学工作者的广泛关注.有关异噁唑阳离子反应的首次研究信息从早期的文献中找到, Mumm的系列研究证明N-甲基-5-苯基异噁唑啉离子与醋酸根离子很容易发生反应^[9]. Kohler等^{[10, 11]}很早就提出3-位未取代的异噁唑盐与亲核试剂的反应, 经过模拟碱中间体, 如氢氧根离子进攻异噁唑盐3-位碳发生反应, Feinstein等^[12]经过异噁唑盐对蛋白质羧酸侧链的改性研究证明了N-烷基-5-苯基异噁唑盐是激活胰蛋白酶羧酸侧链的合适试剂.异噁唑啉盐分子中正电荷中心与阴离子间的静电作用增强了整个分子的极性, 这有利于异噁唑啉盐分子与酶分子活性结构域的作用.在过去几十年中, N-甲基异噁唑啉盐在有机合成、药物开发、大分子等领域显示出越来越广泛的应用前景.本课题组以硫酸二甲酯作为甲基化试剂, 在盐酸中以三氯化铁作为阴离子交换试剂, 由相应的异噁唑啉制备的2-甲基-3-(1', 2'-二-O-环亚己基二氧乙基)-5-芳基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑四氯化铁酸盐衍生物显示了较强的体外抗癌活性和体外白细胞共同抗原活性^[13].本文由反应的经济性出发, 将廉价、对环境友好的甲基化试剂硫酸二甲基扩展到含有亲水性基团的稠杂异噁唑啉环1a~1g或3a~3g的N-甲基化反应, 合成了14个2-甲基-3-乙氧基羰基-5-芳基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑四氯化铁酸盐衍生物2a~2g和2-甲基-3-羧基-5-芳基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑四氯化铁酸盐衍生物4a~4g, 并对化合物2和4进行了初步药物活性筛选, 期望基于异噁唑啉盐分子的高度正电性、羧基、酯基等取代基的亲水性、强极性的协同作用所导致的分子极性的增大, 不仅提高分子的稳定性, 且引起电性的变化, 从而增强盐分子中异唑啉环或羧基、酯基与细胞DNA分子活性结构域的结合, 通过活性筛选, 获得高活性的前提化合物.研究证实, 细胞分裂周期25B磷酸酯酶 (Cdc25B, cell division cycle 25B phosphatase) 是有效的抗癌药物靶点, 这为解释肿瘤细胞周期紊乱、生长旺盛、过度增殖提供了证据^[14].文献报道, 含SH2结构域蛋白酪氨酸磷酸酯酶-1 (SHP1, SH2-containing protein tyrosine phosphatase-1) 在前列腺细胞的增殖和前列腺癌的发生中起作用. SHP1的缺失和白血病以及淋巴瘤的发生紧密相关.抗SHP1抑制剂的研制为治疗前列腺和白血病的靶向治疗提供了新的手段^[15].化合物2和4合成路线见Scheme 1.

  图 图式1  目标化合物的合成 Figure 图式1.  Synthetic route of the target compounds

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  1   结果与讨论

  1.1   合成

  1.2   波谱数据分析

  通过光谱数据对以上化合物的结构进行了表征, 在¹H NMR谱中, 化合物2a~2g在δ 4.28~4.92和1.29~1.37处分别出现了酯基中亚甲基和甲基的峰, 偶合常数分别为6.4~7.2和6.8~7.2 Hz之间; 在δ 3.06~3.25处出现NCH₃上质子的核磁信号; 在δ 5.31~6.77和4.03~4.83处出现了由桥头6a-H和3a-H的相互偶合而产生的两个双重峰, 偶合常数分别为6.8~10.0和6.0~8.6 Hz之间; 在δ 6.96~8.40处出现芳环的吸收峰, 化合物2f羧基中的质子的化学位移值在δ 10.52处.由于芳环上羧基的存在, 化合物2f中NCH₃质子的化学位移在δ 3.25处出现.由于分子中X, NO_2,CO₂H和酯基等较强吸电子基团的存在, 双杂环骈合环系中桥头6a-H和3a-H的化学位移较2a中稍向低场位移, 移动范围分别为δ 0.07~1.35和0.34~0.80, 当芳环上连有NO₂时两个桥头氢的位置显著地向低场移动.在IR谱中, 化合物2a~2g中O—N键的特征吸收峰分别出现在637~769和1375~1395 cm^-1, Ar—O—C键的特征吸收峰出现在1057~1290 cm^-1, 苯环的骨架吸收峰出现在1443~1499 cm^-1, v_C＝N⁺的吸收峰出现在1609~1638 cm^-1, 酰胺的v_C＝O的伸缩振动出现在1713~1721 cm^-1, 芳氢的吸收峰出现在3038~3100 cm^-1, 饱和碳氢的伸缩振动出现在2834~2961 cm^-1.化合物2f羧基中羟基的宽吸收峰在3482 cm^-1.

  在¹H NMR谱中, 化合物4a~4g分别在δ 3.69~4.86和3.39~4.28处出现了由桥头6a-H和3a-H的相互偶合而产生的两个双重峰, 偶合常数分别为6.4~8.4和2.4~13.6 Hz之间, 在δ 6.83~8.38处出现芳环的吸收峰, 羧基中的质子的吸收峰在δ 13.2~9.92处出现, 化合物4f羧基中的质子的化学位移值在δ 13.2处出现, 在δ 3.23~3.24处出现NCH₃上氢的核磁共振信号.由于分子中X, NO₂, CO₂H和酯基等较强吸电子基团的存在, 双杂环骈合环系中桥头6a-H的位置比4a稍微向低场移, 移动范围为δ 0.04~0.51, 3a-H的位置稍微地向高场移动δ 0.06~0.12, 当芳环上连有CO₂H时两个桥头氢的位置稍微地向高场移动.在IR谱中, 化合物4a~4g中O—N键的特征吸收峰分别在638~773 cm^-1和1380~1396 cm^-1范围内, 在1450~1599 cm^-1范围内出现了苯环的骨架振动吸收峰, 在1536~1613 cm^-1范围内出现了v_C＝N的吸收峰, 在1063~1303 cm^-1范围内出现了v_O—C的伸缩振动, 在1013~1036 cm^-1范围内出现v_N—C的伸缩振动, 在1709~1718 cm^-1范围内出现了酰胺的v_C＝O的伸缩振动, 在1780~1825 cm^-1范围内出现了羧基的v_C＝O的伸缩振动, 在3067~3108 cm^-1范围内出现了芳氢的吸收峰, 在2839~2961 cm^-1范围内出现了饱和碳氢的吸收峰, 在3339~3484 cm^-1范围内出现了羧基中v_O—H的吸收峰.

  1.3   实验材料和方法

  化合物2a~2g和4a~4g对Cdc25B和SHP1酶活性的抑制率参照文献[13], 采用实验材料和方法, 按照公式 (1) 和 (2) 进行计算.

  ν_Sample表示加药组的初速度, v_DMSO表示DMSO组 (即不加药组) 的初速度.

  h代表Hill系数.

  SHP1可以影响生长激素抑制素 (SS) 在前列腺的作用.这种酶在前列腺细胞的增殖和前列腺癌的发生中起作用.因此它的存在可以决定了SS作为潜在的治疗前列腺的方法.有研究发现SHP1的缺失和白血病以及淋巴瘤的发生紧密相关. SHP1过表达导致细胞中磷蛋白间变性淋巴瘤激酶的磷酸化降低, 同时减少了细胞增殖和癌细胞的发生, SHP1可能是间变性大细胞淋巴瘤 (ki-1淋巴瘤) 生物学中一个重要的酶, 也是一个潜在的治疗靶点.通过小干扰RNA (siRNA) 技术可以明显的减少心肌梗塞的体积.通过SHP1可以与细胞因子受体连接, 使Jak去磷酸化, SHP1结构域缺陷的小鼠, 各类血细胞异常.说明胞质酪氨酸磷酯酶与血细胞分化有关.

  1.4   生物活性和构效关系

  国家新药筛选中心对化合物2和4分别进行了体外Cdc25B磷酸酯酶抑制活性筛选和SHP1抑制活性筛选, 测试数据见表 1.从表 1中可以看出, 正钒酸钠 (Na₃VO₄) 是蛋白酪氨酸磷酸酶的广谱抑制剂, 以它作为阳性对照, 分别进行了化合物2和4对Cdc25B磷酸酯酶和SHP1活性抑制试验.当样品浓度为20 μg/mL时, 被筛选的化合物2a~2g和4a~4g对Cdc25B磷酸酯酶活性的抑制率分别为97.32%~99.94%和97.45%~99.92%.化合物2和4对SHP1活性均有一定的抑制作用, 其抑制率分别为52.18%~97.15%和15.21%~99.45%.根据初步体外抗癌和抗前列腺疾病活性测试结果, 可得出化合物2a~2g中, 一个较强吸电子性基团NO₂若在苯环上时, 衍生物对Cdc25B和SHP1的抑制作用小于其他对位取代衍生物; 同一个模型的测试中较强供电子基团如CH₃或Br在苯环时, 衍生物对Cdc25B或对SHP1的抑制活性最大.化合物4a~4g中, 同一个模型的测试中较强供电子基团如OCH₃或Cl在苯环时, 衍生物对Cdc25B或对SHP1的抑制活性最大.

  表 1  化合物2和4对Cdc25B磷酸酯酶和SHP-1抑制率^a Table 1.  Inhibition rate of target compounds 2 and 4 against Cdc25B phosphatase and SHP-1

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  Compound	Inhibition rate/%
  	Cdc25B	SHP-1
  2a	99.857	55.88
  2b	99.942	75.72
  2c	99.918	90.36
  2d	99.832	71.66
  2e	97.316	52.18
  2f	99.935	88.91
  2g	98.591	97.15
  4a	99.436	47.11
  4b	97.451	15.21
  4c	99.924	29.52
  4d	99.194	99.45
  4e	99.844	98.97
  4f	99.917	99.21
  4g	99.872	83.66
  a阳性对照物为正矾酸钠 (Na3VO4), 其IC50分别为 (1.86±0.16) 和 (14.16±1.32) μmol/mL.化合物2a~2g和4a~4g抑制Cdc25B磷酸酯酶和SHP-1的浓度均为20 μg/mL.

  表 1  化合物2和4对Cdc25B磷酸酯酶和SHP-1抑制率^a
  Table 1.  Inhibition rate of target compounds 2 and 4 against Cdc25B phosphatase and SHP-1

  曾经对原料化合物1和3分别进行了体外Cdc25A磷酸酯酶抑制活性筛选和体外人白血病细胞株 (HL-60) 抑制活性筛选.化合物1a, 1d, 1e和化合物3d, 3e对Cdc25A磷酸酯酶具有不同程度的抑制作用:当质量浓度为20 μg/mL时, 化合物1a, 1d和1e的抑制率分别为18.92%, 22.49%和56.43%, 化合物3d, 3e的抑制率分别为61.47%, 66.23%.

  研究结果表明Cdc25的基因产物Cdc25磷酸酯是一种双特异性酪氨酸磷酸酯酶, 有Cdc25A, Cdc25B和Cdc25C等3种同源物, 在氨基酸序列水平上大约有50%的同源性, 最高的同源性在它们的催化区域内. Cdc25A和Cdc25B在多种癌症中过表达, 但Cdc25C与癌症发生的相关性不大^[17].由此, 对目标化合物2和4进行了Cdc25B磷酸酯酶系抑制活性进行筛选, 测试结果与原料化合物1和3比较并提出了初步的结论.结果表明, 同样的测试条件下, 即当样品浓度为20 μg/mL时, 在化合物1a~1g中, 除1e对Cdc25A磷酸酯酶活性的抑制率为56.43%外, 其余化合物对Cdc25A磷酸酯酶活性的抑制率都小于50%.化合物2a~2g对Cdc25B磷酸酯酶活性的抑制效果普遍大于其化合物1a~1g.化合物4a~4g对Cdc25B磷酸酯酶活性的抑制率在97.45%~99.92%之间, 大于其原料化合物3a~3g, 这是由于异噁唑环中的N原子被甲基化后, 异噁唑环的电子密度下降, 正电荷分散, 有利于分子稳定性的提高, 并且异噁唑啉盐分子中正电荷中心与阴离子间的静电作用增强了整个分子的极性.另外, 稠杂异噁唑啉环上的羧基、酯基等亲水性基团具有较强的氢键性, 有利于异噁唑啉盐分子与Cdc25B磷酸酯酶和SHP1活性结构域的作用.

  1.1.1   原料化合物的合成

  5-芳基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]-异噁唑-3-甲酸乙酯衍生物1a~1g和5-芳基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]-异噁唑-3-甲酸衍生物3a~3g参照文献[16], 在三乙胺的作用下, 分别以a-氯代肟基乙酸乙酯和a-氯代肟基乙酸产生的氧化腈为偶极体, N-芳基马来酰亚胺为亲偶极体, 通过1, 3-偶极环加成反应获得, 并对上述化合物Cdc25B磷酸酯酶的抑制活性和人白血病细胞生长的抑制活性进行了体外抗癌活性筛选.

  1.1.2   目标化合物的合成

  以反应的经济性出发, 根据异噁唑啉的弱碱性和N-亲核性, 将廉价并对环境友好的 (CH₃)₂SO₄作为稠杂异噁唑啉的N-甲基化试剂, 得到的N-甲基异噁唑啉甲硫酸盐在盐酸中用阴离子交换试剂FeCl₃•6H₂O处理, 转化为N-甲基异噁唑四氯化铁酸盐衍生物2和4.化合物2a~2g的反应结果显示, 芳环上含溴原子的异噁唑啉盐较含氯原子的异噁唑啉盐产率略高.芳环上带有推电子基团的甲基异噁唑啉盐中, 产率p-CH₃OC₆H₄＞p-CH₃C₆H₄＞C₆H₅, p-BrC₆H₄＞p-ClC₆H₄, 芳环上连有NO₂, CO₂H等吸电子基团的异噁唑啉盐与其它异噁唑啉盐相比, 其溶解性都很低, 这是由于NO₂, CO₂H等基团的极性导致整个分子的极性的增高, 从而降低了溶解性.基团体积大小也会影响反应时间和产率, 如p-COOH, p-NO₂等体积较大的基团的异噁唑啉的N-甲基化, 所需反应时间较长、产率也较低.

  合成异噁唑盐衍生物4a~4g的反应结果显示, 芳环无取代的异噁唑啉比芳环取代的异噁唑啉产率低.芳环上连有强吸电子基团NO₂的异噁唑啉盐产率不仅小于芳环上连有推电子基团的异噁唑啉盐, 而且还小于带吸电子基团CO₂H的异噁唑啉盐; 芳环上连有NO₂, CO₂H等吸电子基团的异噁唑啉在弱极性溶剂 (如CHCl₃) 中的溶解性比其它异噁唑啉都差.是因NO₂, CO₂H这一类的基团的极性导致整个分子的极性的增高, 从而降低了溶解性.由于异噁唑啉和异噁唑啉盐的极性差异大, 有利于产物的分离和纯化.

  2   结论

  本文以廉价、环境友好的硫酸二甲酯作为异噁唑啉的N-甲基化试剂, 并在盐酸中三氯化铁作为阴离子交换试剂, 合成了14个分别含有羧基、酯基的N-甲基异噁唑四氯化铁酸盐衍生物2a~2g和4a~4g, 其合成操作简便、试剂廉价、环境友好、易处理等特点.所合成的目标化合物中除了4a~4c对前列腺疾病低活性外, 其余化合物显示了较强的体外抗癌和抗前列腺疾病活性, 通过比较得知异噁唑啉盐对Cdc25B磷酸酯酶活性的抑制效果普遍大于其相应的原料化合物异噁唑啉.

  3   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  熔点仪用X-6精密显微熔点测定仪 (温度计未经校正); BRUKER EQUINOX55型红外光谱仪 (KBr压片); Varian Inova-400型核磁共振谱仪 (TMS为内标, DMSO-d₆为溶剂); Perkin-Elmer 2400CHN型元素分析仪. TLC:薄层板用青岛海洋化工厂生产的硅胶GF₂₅₄加0.5% CMC自制, 凉干后不经活化直接使用, 于紫外灯下观察.柱层析硅胶100~200目, 展开剂V(二氯甲烷):V(甲醇)＝8:2. 5-芳基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]-异噁唑-3-甲酸乙酯衍生物1a~1g和5-芳基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]-异噁唑-3-甲酸衍生物3a~3g参照文献[16]方法制备; 硫酸二甲酯用前重蒸处理, 其它试剂及溶剂均为市售分析纯.

  3.2   2-甲基-3-乙氧基羰基-5-芳基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑四氯化铁酸盐衍生物2a~2g的合成

  在50 mL圆底烧瓶中加入3.04 mmol 5-芳基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]-异噁唑-3-甲酸乙酯衍生物1a~1g, 7.60 mmol硫酸二甲酯和2~5 mL的CHCl₃(或DMF), 在温度100~102 ℃条件下搅拌24~29 h.用薄层色谱[展开剂为V(二氯甲烷):V(甲醇)＝4:1]监测反应.反应完毕后, 蒸除CHCl₃后, 依次加6~12 equiv. 1 mol•L^-1 HCl和4.56 mmol FeCl₃•6H₂O.剧烈振荡5 min, 静置过夜, 移去水层, 固体用H₂O洗到滤液至中性, 晾干, 烘干, 粗产物用少量CH₂Cl₂溶解, 硅胶柱层析纯化, 洗脱剂为V(CH₂Cl₂):V(CH₃OH)＝4:1, 收集R_f为056~0.70的组分, 浓缩得纯化合物2a~2g.

  2-甲基-3-乙氧基羰基-5-苯基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑四氯化铁酸盐 (2a):浅棕红色固体, 产率31%. m.p. 167~168 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.50~6.99 (m, 5H, ArH), 5.42 (d, J＝7.6 Hz, 1H, 6a-H), 4.46 (q, J＝7.2 Hz, 2H, CH₂CH₃), 4.03 (d, J_{3a, 6a}＝6.4 Hz, 1H, 3a-H), 1.33 (t, J＝6.8 Hz, 3H, CH₂CH₃), 2.97 (s, 3H, NCH₃); IR (KBr) ν: 3067, 2934, 1781, 1714, 1597, 1499, 1457, 1387, 1290, 1195, 1070, 755, 693 cm^-1. Anal. calcd for C₁₅H₁₅N₂O₅FeCl₄: C 35.96, H 3.02, N 5.59; found C 36.07, H 3.17, N 5.67.

  2-甲基-3-乙氧基羰基-5-对甲苯基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑四氯化铁酸盐 (2b):棕色固体, 产率52%. m.p. 118~119 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.95~6.96 (m, 4H, ArH), 5.46 (d, J＝7.0 Hz, 1H, 1H, 6a-H), 4.30 (q, J＝7.4 Hz, 2H, CH₂CH₃), 4.06 (d, J_{3a, 6a}＝7.2 Hz, 1H, 3a-H), 3.06~3.16 (m, 6H, ArCH₃and NCH₃), 1.37 (t, J＝7.2 Hz, 3H, CH₂CH₃); IR (KBr) ν: 3038, 2957, 1715, 1514, 1447, 1391, 1204, 1057, 762, 665 cm^-1. Anal. calcd for C₁₆H₁₇N₂O₅FeCl₄: C 37.32, H 3.33, N 5.44; found C 37.59, H 3.45, N 5.48.

  2-甲基-3-乙氧基羰基-5-对甲氧基苯基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑四氯化铁酸盐 (2c):浅棕黄色固体, 产率62%. m.p. 137~138 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.95~6.90 (m, 4H, ArH), 5.31 (d, J_{6a, 3a}＝6.8 Hz, 1H, 6a-H), 4.28 (q, J＝7.2 Hz, 2H, CH₂CH₃), 4.05 (d, J_{3a, 6a}＝7.6 Hz, 1H, 3a-H), 3.85 (s, 3H, OCH₃), 3.06 (s, 3H, NCH₃), 1.29 (t, J＝7.6 Hz, 3H, CH₂CH₃); IR (KBr) ν: 3081, 2959, 2841, 1783, 1713, 1609, 1514, 1443, 1395, 1254, 1199, 1060, 761, 665 cm^-1. Anal. calcd for C₁₆H₁₇N₂O₆FeCl₄: C 36.19, H 3.23, N 5.28; found C 36.43, H 3.16, N 5.50.

  2-甲基-3-乙氧基羰基-5-对氯苯基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑四氯化铁酸盐 (2d):棕黄色固体, 产率56%. m.p. 74~75 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆)δ: 8.32~6.96 (m, 4H, ArH), 5.79 (d, J_{6a, 3a}＝10.0 Hz, 1H, 6a-H), 4.92 (d, J_{6a, 3a}＝10.0 Hz, 1H, 3a-H), 4.37 (q, J＝6.8 Hz, 2H, CH₂CH₃), 1.32 (t, J＝6.8 Hz, 3H, CH₂CH₃), 3.17 (s, 3H, NCH₃); IR (KBr) ν: 3100, 2961, 1721, 1598, 1539, 1494, 1389, 1201, 1090, 761, 687 cm^-1. Anal. calcd for C₁₅H₁₄N₂O₅FeCl₅: C 33.65, H 2.64, N 5.23; found C 33.46, H 2.67, N 5.31.

  2-甲基-3-乙氧基羰基-5-对硝基苯基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑四氯化铁酸盐 (2e):反应溶剂为DMF, 棕黄色固体, 产率29%. m.p. 151~152 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.40~7.62 (m, 4H, ArH), 6.77 (d, J_{6a, 3a}＝9.6 Hz, 1H, 6a-H), 4.33 (q, J＝6.8 Hz, 2H, CH₂CH₃), 4.73 (d, J_{3a, 6a}＝8.6 Hz, 3a-H), 1.37 (t, J＝6.8 Hz, 3H, CH₂CH₃), 2.12 (s, 3H, NCH₃); IR (KBr) ν: 3093, 2935, 1717, 1682, 1598, 1505, 1384, 1179, 1112, 750, 688, 650 cm^-1. Anal. calcd for C₁₅H₁₄N₃O₇FeCl₄: C 33.00, H 2.58, N 7.70; found C 33.11, H 2.66, N 7.91.

  2-甲基-3-乙氧基羰基-5-对羧基苯基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑四氯化铁酸盐 (2f):反应溶剂为DMF, 淡黄色固体, 产率43%. m.p. 200~201 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.52 (bs, 1H, CO₂H), 8.10~7.13 (m, 4H, ArH), 4.76 (d, J_{6a, 3a}＝9.2 Hz, 1H, 6a-H), 4.34 (q, J＝6.4 Hz, 2H, CH₂CH₃), 3.89 (d, J_{3a, 6a}＝10.4Hz, 1H, 3a-H), 1.32 (t, J＝7.2 Hz, 3H, CH₂CH₃), 3.25 (s, 3H, NCH₃); IR (KBr) ν: 3482, 3040, 2957, 1717, 1607, 1512, 1437, 1382, 1284, 1181, 1019, 769, 699, 637 cm^-1. Anal. calcd for C₁₆H₁₅N₂O₇FeCl₄: C 35.26, H 2.77, N 5.14; found C 35.33, H 2.90, N 5.35.

  2-甲基-3-乙氧基羰基-5-对溴苯基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑四氯化铁酸盐 (2g):棕红色固体, 产率57%. m.p. 143~144 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.32~6.96 (m, 4H, ArH), 6.30 (d, J_{6a, 3a}＝8.2 Hz, 1H, 6a-H), 4.92 (q, J＝7.2 Hz, 2H, CH₂CH₃), 4.01 (d, J_{3a, 6a}＝6.8 Hz, 1H, 3a-H), 1.32 (t, J＝6.8 Hz, 3H, CH₂CH₃), 3.17 (s, 3H, NCH₃); IR (KBr) ν: 3096, 2957, 1719, 1541, 1491, 1387, 1208, 1095, 1070, 768, 664 cm^-1. Anal. calcd for C₁₅H₁₄N₂O₅BrFeCl₄: C 31.07, H 2.43, N 4.83; found C 31.21, H 2.53, N 4.94.

  3.3   2-甲基-3-羧基-5-芳基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3′, 4′-d]异噁唑四氯化铁酸盐衍生物4a~4g的合成

  在50 mL圆底烧瓶中加入2.47 mmol 2-甲基-5-芳基-3a, 6a-二氢-4, 6二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑-3-甲酸衍生物3a~3g, 6.18 mmol (2.5 equiv.) 硫酸二甲酯和2~5 mL的CHCl₃, 在100~102 ℃下搅拌23~27 h.用薄层色谱[展开剂为: V(二氯甲烷):V(甲醇)＝9.2:0.8]鉴测反应.反应完毕后, 蒸除CHCl₃后, 依次加6~12 equiv. 1 mol•L^-1 HCl和3.69 mmol FeCl₃•6H₂O.静置过夜, 移去水层, 固体用H₂O洗到滤液至中性, 晾干, 烘干, 粗产物用少量CH₂Cl₂溶解, 硅胶柱层析纯化, 洗脱剂为V(CH₂Cl₂):V(CH₃OH)＝9:1, 收集R_f为052~0.67的组分, 浓缩得到化合物4a~4g.

  2-甲基-3-羧基-5-苯基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑四氯化铁酸盐 (4a):棕黄色固体, 产率44%. m.p. 113~114 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.32 (bs, 1H, CO₂H), 7.53~6.98 (m, 5H, ArH), 4.35 (d, J_{6a, 3a}＝6.4 Hz, 1H, 6a-H), 4.02 (d, J_{3a, 6a}＝7.6 Hz, 1H, 3a-H), 3.23 (s, 3H, NCH₃); IR (KBr) ν: 3470, 3067, 2953, 1780, 1714, 1597, 1499(s), 1457, 1386, 1290, 1190, 1072, 1028, 759, 697 cm^-1. Anal. calcd for C₁₃H₁₁N₂O₅FeCl₄: C 33.02, H 2.34, N 5.92; found C 32.71, H 2.49, N 5.97.

  2-甲基-3-羧基-5-对甲苯基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑四氯化铁酸盐 (4b):棕红色固体, 产率49%. m.p. 141~142 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.48 (bs, 1H, CO₂H), 7.29~7.16 (m, 4H, ArH), 3.69 (d, J_{6a, 3a}＝8.4 Hz, 1H, 6a-H), 3.38~3.40 (m, 1H, 3a-H), 3.23 (s, 3H, NCH₃); IR (KBr) ν: 3455, 3093, 2925, 2885, 1825, 1709, 1586, 1518, 1450, 1391, 1287, 1179, 1075, 1036, 766, 710, 685 cm^-1. Anal. calcd for C₁₄H₁₃N₂O₅FeCl₄: C 34.53, H 2.69, N 5.75; found C 34.07, H 2.43, N 5.93.

  2-甲基-3-羧基-5-对甲氧基苯基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑四氯化铁酸盐 (4c):棕黄色固体, 产率67%. m.p. 110~111 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 9.92 (bs, 1H, CO₂H), 7.42~6.89 (m, 4H, ArH), 4.55 (d, J_{6a, 3a}＝7.2 Hz, 1H, 6a-H), 4.03 (d, J_{3a, 6a}＝2.4 Hz, 1H, 3a-H), 3.85 (s, 3H, OCH₃), 3.24 (s, 3H, NCH₃); IR (KBr) ν: 3468, 3081, 2959, 2839, 1782, 1713, 1609, 1514, 1443, 1395, 1254, 1199, 1060, 721, 665 cm^-1. Anal. calcd for C₁₄H₁₃N₂O₆FeCl₄: C 33.43, H 2.61, N 5.57; found C 33.11, H 2.83, N 5.78.

  2-甲基-3-羧基-5-对氯苯基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑四氯化铁酸盐 (4d):棕黄色固体, 产率55%. m.p. 57~58 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.7 (s, 1H, CO₂H), 7.59~7.36 (m, 4H, ArH), 4.39 (d, J_{6a, 3a}＝6.4 Hz, 1H, 6a-H), 4.13 (d, J_{3a, 6a}＝7.2 Hz, 1H, 3a-H), 3.23 (s, 3H, NCH₃); IR (KBr) ν: 3462, 2955, 2855, 1782, 1714, 1540, 1494, 1456, 1398, 1229, 1090, 1066, 1008, 773, 652 cm^-1. Anal. calcd for C₁₃H₁₀N₂O₅FeCl₅: C 30.78, H 1.99, N 5.52; found C 30.33, H 2.21, N 5.68.

  2-甲基-3-羧基-5-对硝基苯基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑四氯化铁酸盐 (4e):棕黑色固体, 产率45%. m.p. 233~234 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.57 (bs, 1H, CO₂H), 8.38~7.63 (m, 4H, ArH), 4.80~4.82 (m, 1H, 6a-H), 4.02 (d, J_{3a, 6a}＝6.4 Hz, 1H, 3a-H), 3.24 (s, 3H, NCH₃); IR (KBr) ν: 3484, 3086, 2923, 2852, 1781, 1718, 1613, 1597, 1497, 1380, 1344, 1257, 1177, 1110, 1014, 701, 689 cm^-1. Anal. calcd for C₁₃H₁₀N₃O₇FeCl₄: C 30.15, H 1.95, N 8.11; found C 30.5, H 1.67, N 8.18.

  2-甲基-3-羧基-5-对羧基苯基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑四氯化铁酸盐 (4f):橙红色固体, 产率62%. m.p. 195~196 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.2 (bs, 1H, CO₂H), 8.11~7.14 (m, 4H, ArH), 4.85~4.87 (m, 1H, 6a-H), 3.90 (d, J_{3a, 6a}＝13.6 Hz, 1H, 3a-H), 3.23 (s, 3H, NCH₃); IR (KBr) ν: 3476, 3102, 2958, 1781, 1712, 1603, 1514, 1420, 1383, 1289, 1175, 1063, 1033, 701, 638 cm^-1. Anal. calcd for C₁₄H₁₁N₂O₇-FeCl₄: C 32.53, H 2.14, N 5.42; found C 33.81, H 2.56, N 5.54.

  2-甲基-3-羧基-5-对溴苯基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑四氯化铁酸盐 (4g):浅黄色固体, 产率67%. m.p. 222~223 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.5 (s, 1H, CO₂H), 7.70~7.24 (m, 4H, ArH), 4.71 (d, J_{6a, 3a}＝7.6 Hz, 1H, 6a-H), 3.96 (d, J_{3a, 6a}＝7.2 Hz, 1H, 3a-H), 3.23 (s, 3H, NCH₃); IR (KBr) ν: 3339, 3096, 2923, 2852, 1782, 1712, 1536, 1491, 1387, 1303, 1276, 1184, 1070, 1012, 719, 646 cm^-1. Anal. calcd for C₁₃H₁₀N₂O₅BrFeCl₄: C 28.30, H 1.83, N 5.08; found C 28.74, H1.95, N 5.31.

  辅助材料 (Supporting Information)目标化合物2a~2g和4a~4g的¹H NMR和IR原始图谱.这些材料可以免费从本刊网站 (http://sioc-journal.cn/) 上下载.

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  图式1  目标化合物的合成

  Scheme 1  Synthetic route of the target compounds

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  表 1  化合物2和4对Cdc25B磷酸酯酶和SHP-1抑制率^a

  Table 1.  Inhibition rate of target compounds 2 and 4 against Cdc25B phosphatase and SHP-1

  Compound	Inhibition rate/%
  	Cdc25B	SHP-1
  2a	99.857	55.88
  2b	99.942	75.72
  2c	99.918	90.36
  2d	99.832	71.66
  2e	97.316	52.18
  2f	99.935	88.91
  2g	98.591	97.15
  4a	99.436	47.11
  4b	97.451	15.21
  4c	99.924	29.52
  4d	99.194	99.45
  4e	99.844	98.97
  4f	99.917	99.21
  4g	99.872	83.66
  a阳性对照物为正矾酸钠 (Na3VO4), 其IC50分别为 (1.86±0.16) 和 (14.16±1.32) μmol/mL.化合物2a~2g和4a~4g抑制Cdc25B磷酸酯酶和SHP-1的浓度均为20 μg/mL.

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