低浓度甲醛对多肽和蛋白化学修饰的质谱研究

引用本文: 王子健, 杨静波, 李光谱, 孙宁宁, 孙万春, 彭其胜, 刘宁. 低浓度甲醛对多肽和蛋白化学修饰的质谱研究[J]. 分析化学, 2016, 44(8): 1193-1199. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.160139 shu

Citation: WANG Zi-Jian, YANG Jing-Bo, Li Guang-Pu, SUN Ning-Ning, SUN Wan-Chun, PENG Qi-Sheng, LIU Ning. Chemical Modifications of Peptides and Proteins with Low Concentration Formaldehyde Studied by Mass Spectrometry[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2016, 44(8): 1193-1199. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.160139 shu

低浓度甲醛对多肽和蛋白化学修饰的质谱研究

王子健 ^1, ,
杨静波 ^1, ,
李光谱 ^2, ,
孙宁宁 ^1, ,
孙万春 ^3, ,
彭其胜 ^3, ,
刘宁 ^1,

1.
吉林大学第二医院, 长春 130041;
2.
吉林亚泰生物药业股份有限公司, 长春 130033;
3.
吉林大学人兽共患病研究所, 人兽共患病研究教育部重点实验室, 长春 130062
基金项目:
本文系国家自然科学基金（Nos.81472030，31372409，21175055）、吉林省科技厅项目（Nos.20110739，20150204001YY）、吉林大学白求恩计划B（2012210）资助

摘要: 采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和纳升电喷雾四极杆飞行时间串联质谱（Nano-ESI-QTOF MS）技术，以标准肽段和流感病毒基质蛋白酶切肽段为模型，研究了甲醛对蛋白质和多肽主链的修饰作用。采用与实际病毒灭活过程一致的实验条件（4℃，0.025%（V/V）福尔马林（37%（w/w）甲醛溶液）处理72 h），进行甲醛与多肽的化学反应。结果表明，在实验条件下，甲醛能与标准肽段N端的氨基反应生成羟甲基加合物，再发生缩合反应生成亚胺，形成+12 Da的产物。此外，甲醛还能与标准肽段中的精氨酸、赖氨酸的侧链发生反应，生成+12 Da的反应产物。对流感病毒基质蛋白的酶切肽段与甲醛的反应的质谱分析结果显示，多数的肽段都生成了+24 Da的产物，质量的增加来源于肽段N端氨基（+12 Da）和C端精氨酸或赖氨酸的侧链（+12 Da）的贡献。此外，还观察到有一个漏切位点的肽段生成了+36 Da的产物。本研究结果表明，在实验条件下，低浓度甲醛主要与肽段和蛋白的N端氨基，以及精氨酸和赖氨酸侧链发生反应。本研究为分析低浓度甲醛与蛋白质的反应产物提供了有效的质谱分析方法和解谱依据。

关键词:

甲醛
/ 多肽
/ 基质蛋白
/ 化学修饰
/ 质谱

English

Chemical Modifications of Peptides and Proteins with Low Concentration Formaldehyde Studied by Mass Spectrometry

1.
Central Laboratory, The Second Hospital of Jilin University, Changchun 130041, China;
2.
Jilin Yatai Biological Pharmaceutical Inc, Changchun 130033, China;
3.
Key Laboratory of Zoonosis, Ministry of Education, Jilin University, Changchun 130062, China
Received Date: 29 February 2016
Revised Date: 17 June 2016
Fund Project:
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81472030, 31372409, 21175055)

Abstract: Formaldehyde has been widely employed to immobilize clinical tissue specimens, inactivate toxins and viruses in biomedical fields. Formaldehyde can react with active groups in bio-molecules such as proteins, resulting in protein cross-linking, inactivation, and immobilization. By using several standard peptides and tryptic peptides from matrix protein of influenza virus as experimental models, we studied the chemical modifications of peptides and proteins with formaldehyde by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and nano-electrospray quadruple time-of-flight tandem mass spectrometry. The reaction between formaldehyde and peptides was performed under the same conditions as those during inactivation of virus (4℃, 0.025% Formalin (V/V), 37% formaldehyde solution (w/w), and 72 h). The results indicated that under above conditions, formaldehyde could react with amino group of N-terminus of standard peptide to generate a methylol adduct, which was further condensed into an imine to generate +12 Da product. Besides, formaldehyde could react with side chain of two amino acids such as arginine and lysine, yielding +12 Da product respectively. The analysis of the reaction between formaldehyde and tryptic peptides from matrix protein of influenza virus showed that +24 Da products could be detected in most peptides due to combinational contribution from N-terminus of peptide (+12 Da) and side chain of C-terminal arginine or lysine (+12 Da). Moreover, a +36 Da product was detected for a peptide with miss-cut site. The results indicated that low-concentration formaldehyde primarily reacted with amino group on N-termini of peptides and proteins, as well as the side chains of arginine and lysine residues. The present study suggested an effective mass spectrometry-based method for analyzing the reaction between low-concentration formaldehyde and peptides and proteins, thus provided strategies for interpretation for the mass spectra of reaction products.

Key words:

1. 引言

在生物医学领域，甲醛被广泛用于临床组织样本的固定，以及毒素和病毒的灭活等。甲醛能与生物大分子尤其是蛋白质的活性基团发生反应，从而将蛋白质交联、失活，甚至固定。在致病微生物尤其是高致病性微生物(如禽流感病毒)的研究中，经常使用一定浓度的甲醛溶液处理样本，使微生物中的遗传物质RNA、DNA发生化学修饰、交联反应，使微生物失去遗传信息复制及繁殖的能力。

近年来，由于变异而产生的各种新型流感病毒不断引起大规模地区性、乃至全球性的流感爆发^{[1, 2]}，因此，对流感病毒特别是禽流感和新型甲型流感病毒重要编码蛋白的结构和功能以及与感染细胞相互作用机制的研究，已经成为目前的研究热点之一^[3-6]。对流感病毒主要蛋白一级结构的研究，通常采用分子生物学方法对病毒基因序列进行测序，进而间接推导出蛋白质的氨基酸序列。而现代软电离质谱技术可以直接对蛋白进行分析、测序，不但能直接得到蛋白质一级结构的序列信息^{[7, 8]}，还能对蛋白的翻译后修饰等方面的信息进行直接表征^[9-11]，可以得到比传统的基因测序技术更直接和丰富的结构信息。然而，由于新型甲型流感病毒的高致病性，病毒样品必须经过严格的灭活，使病毒核酸或蛋白分子发生化学修饰，使病毒失去繁殖力，才能在开放实验室进一步分析研究。

已有的研究^{[12, 13]}表明，甲醛最容易与氨基酸上的氨基发生反应生成羟甲基加合物，再发生缩合反应生成亚胺，并脱去一个水分子(如下式)。甲醛对蛋白质的修饰作用受反应时间、温度、甲醛浓度等多种因素影响^[14]，而大多数研究使用较高浓度的甲醛与多肽进行反应^[15]。高浓度的甲醛对蛋白质、核酸等生物大分子的修饰作用较强，广泛应用于制革工业、医疗领域的器械消毒等方面。然而，在疫苗制备、抗原性分析、病原微生物的质谱分析等研究中，高浓度的甲醛处理往往会由于对蛋白质等生物大分子的过度修饰、交联，导致疫苗的抗原性降低、产率下降等不利影响。因此，在保证使病毒失去繁殖力的情况下，常使用尽量低浓度的甲醛溶液处理病毒样本，以减少人为的化学修饰对病毒抗原效价和质谱测序分析的影响。例如，在流感病毒疫苗制备的病毒灭活过程，通常使用0.025%(V/V)福尔马林在4℃处理72 h^[16]。因此为了使研究更具有针对性，本研究采用与实际病毒灭活过程一致的实验条件，使用甲醛对合成多肽进行化学修饰(甲醛终浓度约为3.33 mmol/L)。利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱和纳升电喷雾四极杆飞行时间串联质谱技术，研究了甲醛对一系列标准肽段和流感病毒基质蛋白酶切肽段的修饰作用。

2. 实验部分

2.1. 仪器与试剂

QSTAR纳升电喷雾四极杆飞行时间串联质谱仪(Nano-ESI-MS/MS, 美国Applied Biosystems公司)；Voyager DE STR基质辅助激光解析飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS, 美国Applied Biosystems公司)；Optima L-100K超速离心机(美国Beckman Coulter公司)；ZipTip C₁₈ Pipette Tips微量层析柱(美国Millipore公司)；纳升电喷雾离子源(丹麦Protana公司)。

多肽标准品：Bradykinin(1-7，RPPGFSP)，Angiotensin II(DRVYIHPF)，Angiotensin I(DRVYIHPFHL)，Substance P(RPKPQQFFGLM-NH₂)为Sigma公司产品；测序级胰蛋白酶(美国Promega公司)；α氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、福尔马林(37%(w/w)甲醛溶液)、碘乙酰胺、二硫苏糖醇(美国Sigma公司)；甲醇、乙腈(美国Fisher公司)。实验用水为Milli-Q纯水仪(美国Millipore公司)制备的超纯水。实验所用病毒株为人A型H1N1流感病毒，由吉林亚泰生物药业股份有限公司提供。

2.2. 甲醛对多肽标准品修饰作用的质谱分析

分别将多肽样品溶解于50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，使其终浓度为66μmol/L。将福尔马林用水稀释200倍，取2.5μL加入50μL多肽样品溶液中，迅速振荡混合均匀，在4℃放置一定时间后，用C₁₈ Zip Tip吸头脱盐，点靶，与基质溶液混合并在室温干燥后，进行MALDI-TOF质谱分析。另取脱盐的样品适量，进行ESI质谱分析。

2.3. 病毒基质蛋白的分离纯化

将A型流感病毒H1N1接种于9~10日龄SPF级(Specific pathogen free，SPF)的鸡胚中，35℃孵育72 h后，收集尿囊液；5000 r/min离心15 min，去除沉淀物。上清液在4℃，40000 r/min离心1 h，弃去上清液，加入适量100 mmol/L PBS(pH 7.4)缓冲液，得到病毒悬液。反复利用20%~60%(w/w)蔗糖梯度超速离心(4℃，40000 r/min，1 h)纯化病毒颗粒。小心收集含有病毒的液体带，用酸性氯仿-甲醇混合物将病毒的基质蛋白抽提出来^[17]。用100 mmol/L PBS缓冲液(pH 7.4)对样品进行充分透析过夜。测定蛋白质浓度后，将样品冷冻干燥，-80℃保存。

2.4. 基质蛋白的胰蛋白酶水解

按照蛋白-酶20:1(w/w)的比例，向基质蛋白样品中加入新配制的15μg/mL胰蛋白酶溶液(25 mmol/L NH₄HCO₃, pH 8.5)。35℃温育16 h后，冷冻干燥，-80℃保存。

2.5. 基质蛋白的胰酶水解多肽混合物与甲醛的反应

将基质蛋白的胰酶水解多肽混合物溶解于含有0.025%福尔马林的100 mmol/L PBS(pH 7.4)缓冲液中，调节浓度相当于水解前的基质蛋白的终浓度为0.1 mg/mL。4℃反应72 h，分装后于-80℃保存。

2.6. MALDI-TOF-MS条件

将多肽样品直接溶解于基质溶液(50％乙腈, 0.1% TFA, 10 mg/mL CHCA)中，取1μL点样于96孔样品靶板上，室温自然干燥。质谱条件：加速电压20 kV, 阳离子反射模式, 延迟时间100 ns, 激光频率20 Hz, 谱图累积100次。

2.7. Nano-ESI-MS/MS条件

将脱盐后的多肽样品加入喷雾针(PicoTip，New Objective，USA)，通过纳喷雾离子源直接引入四极杆飞行时间串联质谱仪进行检测。质谱条件：喷雾电压850 V，第一去簇电压(DP1)50 V，第二去簇电压(DP2)10 V，聚焦电压(FP)100 V，扫描区间350~1500 Da，气幕30。质核比检测范围分别为350~1500 Da(一级质谱)和50~2000 Da(二级质谱)。二级串联质谱除了扫描区间为50~1000 Da外，其它参数相同，碰撞能量(CE)根据具体情况在25~40之间调节。

3. 结果与讨论

3.1. 低浓度甲醛对标准多肽的修饰作用：

为了考察低浓度甲醛与多肽和蛋白质的化学反应，首先考察了低浓度甲醛与4个标准肽段Bradykinin(RPPGFSP)，AngiotensinⅡ(DRVYIHPF)，AngiotensinⅠ(DRVYIHPFHL)和Substance P(RPKPQQFFGLM-NH₂)之间的反应。按照2.2节实验方法进行甲醛和多肽的反应，并利用基质辅助激光解析飞行时间质谱进行检测。以S1肽段为例，其反应产物的一级质谱图如图 1所示，在反应3 h的反应溶液中，观察到3个分子离子峰，即m/z 1046.56、1058.59和1070.61。其中，m/z 1046.56的分子离子峰对应于未反应的S1肽段([S1+H]⁺)，m/z 1058.59和1070.61的分子离子峰则分别对应于两个反应产物：S1肽段加12 Da([S1+12+H]⁺)和S1肽段加24 Da([S1+24+H]⁺)的分子离子峰。两个产物的分子量分别比原肽段S1的分子量多12和24 Da。根据文献[16]，推测S1肽段(DRVYIHPF)分子中至少有4个可以被甲醛修饰的位点，包括精氨酸(R，Arg)、酪氨酸(Y，Tyr)、组氨酸(H，His)的侧链基团以及天门冬氨酸(D，Asp)的游离N末端。由图 1可知，甲醛与氨基酸上的氨基发生反应生成羟甲基加合物，再发生缩合反应生成亚胺，得到分子量增加12 Da的产物。因此，可以推测m/z 1058.59分子离子峰为S1肽段与一分子甲醛反应的产物(+12 Da)，而m/z 1070.61的分子离子峰为S1肽段与两分子甲醛反应的产物(+24 Da)。

图 1

图 1 肽段S1与甲醛反应的基质辅助激光解析飞行时间质谱分析

Figure 1. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) analysis of reaction between peptide S1 and formaldehyde

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采用电喷雾串联质谱技术对S1肽段与甲醛反应进行研究，以确定产物肽段的化学反应位点。首先，在电喷雾质谱的一级谱图中可以很容易检测到S1肽段和两个产物肽段的分子离子峰，分别为带2个正电荷的m/z 523.76，529.76和535.76。然后，分别选择这3个分子离子峰作为母离子，进行串联质谱分析，得到了它们的二级碎片质谱图(图 2)。图 2A为S1原肽段母离子m/z 523.76的二级串联质谱图，可以观察到连续的b系列离子(b2，b3-NH₃，b4，b5，b6)，以及少量的a和y系列离子。而在产物母离子m/z 535.76的二级串联质谱图(图 2B)中，观察到的b系列离子质量数均比原肽段S1相应的b离子增加12 Da。而在另一个产物母离子m/z 535.76的二级串联质谱图(图 2C)中，观察到的b系列离子质量数均比原肽段S1相应的b离子增加24 Da。这些数据表明甲醛和肽段S1的反应发生在肽段N端开始的两个氨基酸上，一个为N端第一位的天门冬氨酸(D，Asp)，另一个为第二位的精氨酸(R，Arg)。虽然酪氨酸(Y，Tyr)和组氨酸(H，His)的侧链基团也有可能会与甲醛发生反应，但在本实验条件下，未检测到与3个以上甲醛分子反应的产物(一级质谱)。因此，在肽段S1与甲醛的反应中，没有检测到酪氨酸和组氨酸残基与甲醛的反应产物。

图 2

图 2 肽段S1(A，m/z 523.76)与甲醛反应的两个产物(B，m/z 529.76；C，m/z 535.76)的纳升电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱分析

Figure 2. Nano-electrospray quadruple time-of-flight tandem mass spectrometry (NESQ-TOF-MS/MS) analysis of peptide S1 with m/z 523.76 (A) and two products with either m/z 529.76 (B) or m/z 535.76 (C) formed during incubation of S1 with formaldehyde

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对其它几个标准肽段(S2-S4)与甲醛反应的质谱分析的结果与肽段S1类似，大多数的修饰都发生在肽段的N末端、精氨酸以及赖氨酸残基(见表 1)，如肽段S2(RPPGFSP)的第一位精氨酸、肽段S3(DRVYIHPFHL)的第一位天门冬氨酸和第二位精氨酸、以及肽段S4(RPKPQQFFGLM-NH2)的第一位精氨酸和第三位赖氨酸。Pappas等^[16]的研究表明，蛋白质中还有其它几种可与甲醛反应的氨基酸残基，如酪氨酸、组氨酸等。然而，本实验并没有检测到其它几种氨基酸残基与甲醛的反应产物。这可能是由于本实验所使用的甲醛浓度较低，并且反应温度低，因而反应活性高的N末端游离氨基、精氨酸及赖氨酸侧链氨基优先与甲醛反应。此外，对于S4肽段(RPKPQQFFGLM-NH₂)，可以看到序列中有3个易与甲醛反应的位点，分别是精氨酸的N端氨基和侧链氨基，以及赖氨酸的侧链氨基，但本研究中并没有发现3个位点同时被修饰的情况(+36 Da)。Metz等^[15]的研究表明，多肽与甲醛的反应与多肽的氨基酸序列有关，并不是所有的含有赖氨酸及其它活性氨基酸的多肽都可以与甲醛反应。此外，还可能由于在本实验条件下，反应进行的并不彻底，导致+36 Da产物的量较少，质谱无法检测到。

表 1

表 1 标准肽段与甲醛反应的质谱分析

Table 1. Analysis of reactions between standard peptides and formaldehyde by mass spectrometry

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肽段序号 Peptide No.	肽段序列 Peptide sequence	原始肽段质核比^# m/z value of intact peptides^#	甲醛修饰肽段质核比^# m/z value of formaldehyde- modified peptides^#	质量变化 Mass shift (Da)
S1	D^R^VYIHPF	1046.56	1058.59, 1070.61	12, 24
S2	R^*PPGFSP	757.39	769.40, 781.41	12, 24
S3	D^R^VYIHPFHL	1296.69	1308.71, 1320.72	12, 24
S4	R^PK^PQQFFGLM-NH2	1347.75	1359.77, 1371.77	12, 24
注：为甲醛修饰位点，#为单同位素峰质荷比 Note：: Formaldehyde-modified amino acid residues，#: Monoisotopic values.

3.2. 低浓度甲醛对流感病毒基质蛋白的修饰作用的质谱分析

在上述条件下，复杂样品即流感病毒基质蛋白的酶切混合物与甲醛反应。首先，利用蔗糖梯度超速离心，将鸡胚尿囊液中的A型流感病毒颗粒纯化，进一步将病毒的基质蛋白分离纯化出来，利用胰酶水解得到病毒基质蛋白的酶切多肽混合物。将此多肽混合物与甲醛反应后，利用质谱进行分析。另将未与甲醛反应的酶切多肽混合物作为对照，在相同条件下进行质谱分析。

如图 3所示，与对照样品质谱图(图 3A)相比，在与甲醛反应的样品质谱图中，除了一些未与甲醛反应的原肽段，几乎所有肽段都比原肽段有+24 Da的质量变化，P2肽段还发现有+36 Da的质量变化(图 3B)。这表明在此实验条件下，几乎所有肽段的N端氨基均与甲醛发生反应生成羟甲基加合物，再缩合生成亚胺(+12 Da)。此外，在每个胰酶水解多肽C端的精氨酸或赖氨酸也容易与甲醛发生反应(+12 Da)。为了证实上述推测，利用电喷雾质谱技术对样品中的多肽信号进行串联质谱分析，对7个来源于流感病毒基质蛋白的酶切片段(P1~P7)进行了验证，并得到了这7个多肽片段的氨基酸序列(见表 2)。P2肽段序列中第二位的精氨酸，应该属于胰酶的一个漏切位点。因此，在P2肽段上除了N端氨基和C端赖氨酸外，还有精氨酸侧链能与甲醛反应，使得在质谱中能检测到+36 Da的谱峰。

图 3

图 3 流感病毒基质蛋白的酶切多肽混合物(A)与甲醛反应后产物(B)的基质辅助激光解析飞行时间质谱分析

Figure 3. (A) MALDI-TOF-MS analysis of tryptic peptides from matrx protein of influenza virus. (B) MALDI-TOF-MS analysis of tryptic peptides from matrx protein of influenza virus, which were incubated with low concentration of formaldehyde

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表 2

表 2 电喷雾质谱分析得到的基质蛋白酶切片段的氨基酸序列

Table 2. Amino acid sequence of tryptic peptides from matrix protein identified by nano-electrospray mass spectrometry

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肽段峰序号 Peak ID of peptide	肽段序列 Peptide sequence	理论质荷比^# (单电荷，单同位素) Calculated m/z^# (single-charged, monoisotopic)	质量变化 Mass shift (Da)
P1	M^VLASTTAK^	921.51	24
P2	T^R^PILSPLTK^*	1125.70	24, 36
P3	Q^MVTTTNPLIR^	1273.70	24
P4	D^NLLENLQAYQK^	1448.74	24
P5	G^ILGFVFTLTVPSER^	1635.91	24
P6	F^VQNALN(de)GN(de)GDPNNM(ox)DK^	1865.80	24
P7	A^M(ox)EQM(ox)AGSSEQAAEAM(ox)EVASQAR^	2431.02	24
为甲醛修饰位点；#为单同位素峰质荷比；M(ox)为单氧化的甲硫氨酸；N(de)为脱氨基的天门冬氨酸。 Formaldehyde-modified amino acid residues；#: Monoisotopic values；M(ox): Mono-oxidized methionine；N(de): Deamidated asparagine.

4. 结论

本研究采用了与实际病毒灭活过程一致的实验条件(4℃经0.025%(V/V)福尔马林处理72 h)进行甲醛与多肽的化学反应质谱分析研究。结果表明，在低浓度甲醛的条件下，甲醛可以与标准肽段N端的氨基、精氨酸和赖氨酸的侧链反应生成羟甲基加合物，再发生缩合反应生成亚胺，分别形成+12 Da的产物。对流感病毒基质蛋白的酶切肽段与甲醛的反应的质谱分析显示，多数的肽段都生成了+24 Da的产物，增加的质量来源于肽段N端氨基(+12 Da)和C端精氨酸或赖氨酸的侧链(+12 Da)的贡献。此外，在该条件下没有检测到酪氨酸(Y，Tyr)和组氨酸(H，His)的侧链基团反应产物。本研究为分析低浓度甲醛与蛋白质的反应产物提供了有效的质谱分析方法和解谱依据。

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Figure 1 Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) analysis of reaction between peptide S1 and formaldehyde

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Figure 2 Nano-electrospray quadruple time-of-flight tandem mass spectrometry (NESQ-TOF-MS/MS) analysis of peptide S1 with m/z 523.76 (A) and two products with either m/z 529.76 (B) or m/z 535.76 (C) formed during incubation of S1 with formaldehyde

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Figure 3 (A) MALDI-TOF-MS analysis of tryptic peptides from matrx protein of influenza virus. (B) MALDI-TOF-MS analysis of tryptic peptides from matrx protein of influenza virus, which were incubated with low concentration of formaldehyde

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Table 1. Analysis of reactions between standard peptides and formaldehyde by mass spectrometry

肽段序号 Peptide No.	肽段序列 Peptide sequence	原始肽段质核比^# m/z value of intact peptides^#	甲醛修饰肽段质核比^# m/z value of formaldehyde- modified peptides^#	质量变化 Mass shift (Da)
S1	D^R^VYIHPF	1046.56	1058.59, 1070.61	12, 24
S2	R^*PPGFSP	757.39	769.40, 781.41	12, 24
S3	D^R^VYIHPFHL	1296.69	1308.71, 1320.72	12, 24
S4	R^PK^PQQFFGLM-NH2	1347.75	1359.77, 1371.77	12, 24
注：为甲醛修饰位点，#为单同位素峰质荷比 Note：: Formaldehyde-modified amino acid residues，#: Monoisotopic values.

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Table 2. Amino acid sequence of tryptic peptides from matrix protein identified by nano-electrospray mass spectrometry

肽段峰序号 Peak ID of peptide	肽段序列 Peptide sequence	理论质荷比^# (单电荷，单同位素) Calculated m/z^# (single-charged, monoisotopic)	质量变化 Mass shift (Da)
P1	M^VLASTTAK^	921.51	24
P2	T^R^PILSPLTK^*	1125.70	24, 36
P3	Q^MVTTTNPLIR^	1273.70	24
P4	D^NLLENLQAYQK^	1448.74	24
P5	G^ILGFVFTLTVPSER^	1635.91	24
P6	F^VQNALN(de)GN(de)GDPNNM(ox)DK^	1865.80	24
P7	A^M(ox)EQM(ox)AGSSEQAAEAM(ox)EVASQAR^	2431.02	24
为甲醛修饰位点；#为单同位素峰质荷比；M(ox)为单氧化的甲硫氨酸；N(de)为脱氨基的天门冬氨酸。 Formaldehyde-modified amino acid residues；#: Monoisotopic values；M(ox): Mono-oxidized methionine；N(de): Deamidated asparagine.

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

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沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142