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• 生物粘附是一种常见的材料表面的生物污染现象，是一种界面行为，通常是指污染物(如蛋白、细菌、真菌等)在材料表面吸附/粘附的现象，广泛地存在于自然界和人们的生活中。蛋白质、细菌等生物分子在材料表面的附着和聚集，会对材料表面造成污染，影响材料与器件及设备的使用性能^{[1, 2]}。例如，蛋白质经常在植入式生物器件表面发生非特异性粘附，造成检测失准、性能降低。一些分离膜表面发生生物粘附，造成膜孔堵塞，导致分离膜的分离效率降低。微生物与贝类在船只表面发生粘附，造成航行速度降低，加快船只的腐蚀。因而，抗生物非特异性吸附表面在许多领域都有着诱人的应用前景，受到了广泛关注。

  要减少或者阻止生物粘附的发生，需要尽量减少蛋白质、细菌等物质与材料表面的相互作用。研究发现，亲水材料表面通过吸附水分子能够在材料表面形成一层水合层，使得粘附物质与材料表面之间的相互作用减弱，从而减少或者阻止生物分子在材料表面的吸附。例如，聚乙二醇是目前应用十分广泛的低污染材料，它可以通过氢键结合水分子，形成水化层，而且聚乙二醇链具有良好的活动性，会产生较大的空间排斥力，从而通过空间排斥力和水合层的作用，来抵抗生物物质在材料表面的粘附，达到降低污染的效果^{[3, 5]}。但是，聚乙二醇也有一些缺点，例如，由于聚乙二醇的大分子链含有醚键，在过渡金属和氧气存在的情况下容易被氧化；而且，聚乙二醇的热稳定性不佳^[6]。

  近年来，两性离子聚合物引起了越来越多的研究兴趣。两性离子聚合物是一类同时带有阴、阳离子基团的聚合物，具有强的亲水性、优良的热和化学稳定性等特性。两性离子聚合物分子中的正负电荷能够与水分子通过静电作用结合，形成水合层。这类水合层会更加牢固，抵抗生物物质粘附的效果更好，因而，两性离子聚合物被认为是当前最具有潜力的抗生物粘附的低污染材料之一^{[6, 9]}。

  在另一方面，受贻贝有强粘附力的启发，最近，多巴胺氧化自聚合反应受到了强烈关注^[10]。多巴胺通过氧化自聚合可以在几乎所有的固体材料表面形成聚多巴胺，且这种氧化自聚合的反应条件非常简单；另外，已报道聚多巴胺具有良好的生物相容性，因而，在生物医用材料领域备受欢迎，展现出诸多良好的应用前景^{[11, 20]}。然而，据之前的报道^[21]，聚多巴胺涂层的抗生物粘附性能较弱，这使得不得不在聚多巴胺表面修饰其他抗生物粘附分子来制备抗生物粘附表面，导致复杂的制备过程、成本昂贵等缺点^{[3, 21]}。

  本文通过振荡法制备了聚多巴胺涂层，研究发现，所制备的聚多巴胺涂层具有超亲水性，并表现出良好的抗蛋白吸附和抗细菌吸附性能。

  1.   实验部分

  1.1   实验器材与药品

  多巴胺、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、BCA试剂盒购自国药集团化学试剂有限公司。酵母粉、蛋白胨、琼脂购自北京欣经科生物技术有限公司。细胞培养液、SYTO9/PI购自西格玛试剂公司。

  恒温培养箱(LRH-70，上海一恒科学仪器有限公司)；灭菌锅(YX-280D，江阴滨江医疗器械设备有限公司)；超净工作台(SW-CJ-1FD Ⅰ类B型，苏静安泰洁净工作台)；离心机(Micro Centrifuge 220vAc)；摇床(HZ-9211K恒温振荡器，太仓市科教器材厂)；细菌计数器(Shineso江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)和酶标仪。

  1.2   蛋白粘附测试

  将1cm×2.5cm的空白基底浸入使用tris缓冲溶液(pH 8.5)新鲜配制的2mg/mL多巴胺溶液，分别进行静置过夜生长聚多巴胺薄膜和在摇床中以300r/min振荡过夜生长聚多巴胺薄膜。然后，将空白基底、静置生长的聚多巴胺薄膜和振荡生长的聚多巴胺薄膜分别与2mL 1.7g/L的牛血清蛋白(BSA)的磷酸缓冲溶液在37℃下共培养4h，取出并分别放入2mL的磷酸缓冲溶液中超声洗涤15s。使用酶标仪在562nm下测量样品的吸光度。根据标准曲线，算出每个孔中的吸光值，计算每种材料的单位面积上蛋白的吸附量。

  1.3   细菌粘附测试

  活化金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。然后，分别取出2mL，离心，弃其上清液，加入磷酸缓冲溶液至2mL，振荡均匀。用紫外分光光度计在600nm测试菌悬液吸光度。当吸光度值置于0.2~0.8之间时，为有效；否则，继续用磷酸缓冲溶液调整，使其吸光度值至0.2~0.8区间。用有效的菌悬液作为为初始菌悬液，用磷酸缓冲溶液进行梯度稀释，稀释8次，选最后3组菌浓度分别为10⁷、10⁶和10⁵CFU/mL的菌悬液进行抗粘附测试。以振荡生长的聚多巴胺为实验组，以静置生长的聚多巴胺薄膜涂层和空白基底作为对照组实验。在无菌条件下每种材料分别放入六孔板中，然后在每孔放入2mL不同浓度的菌悬液中，放在恒温培养箱温存24h。然后，分别将材料取出，用磷酸缓冲溶液轻轻冲洗。再用SYTO9/PI对材料表面进行避光染色15min。之后，用磷酸缓冲溶液轻轻冲洗材料，再在20倍共聚焦显微镜下观察细菌吸附在材料表面的情况。用Image-J软件处理图像，计算出单位面积材料上细菌吸附量。

  2.   结果与讨论

  2.1   聚多巴胺涂层

  将不同基底材料(玻璃、不锈钢和塑料片)放入新鲜配置的多巴胺溶液，然后，分别进行静置和振荡处理24h。然后，取出，观察发现在静置处理的样品组中，所有的样品表面均形成了一层均匀的淡黄色薄膜；在振荡处理的样品组中，所有的样品表面均形成了一层不均匀的黑色薄膜，如图 1所示。这些结果表明，聚多巴胺涂层可以在多种基底材料表面生成，而且，振荡方法生成的聚多巴胺涂层表现出与黑色素类似的本体颜色，说明振荡方法生成的聚多巴胺涂层较厚。这应该与振荡过程加快了多巴胺的自聚合反应速度相关^[22]。

  图 1

  

  图 1.  三组不同基底材料(玻璃(左)、不锈钢(中)和塑料(右))表面的静置溶液生长的聚多巴胺(左栏)和振荡方法生长的聚多巴胺(右栏)涂层

  Figure 1.  The polydopamine coatings grown on glass (left), stainless steel (middle), and plastic plates (right) prepared in static (left column) and shaking solution (right column) of dopamine

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  有趣的是，据报道静置溶液方法生成的聚多巴胺涂层通常具有约60°的静止接触角^[23]。我们在静置生成的聚多巴胺涂层表明也测量到55°的静止接触角，如图 2(中)所示。然而，振荡生成的聚多巴胺涂层的接触角低于15°，表明该振荡生成的聚多巴胺涂层具有超亲水性。这有望赋予该聚多巴胺涂层良好的抗生物吸附性能。

  图 2

  

  图 2.  玻璃基底表面(左)及其修饰有静置溶液生长的聚多巴胺(中)和振荡方法生长的聚多巴胺涂层(右)的接触角

  Figure 2.  Typical static contact angles of bare (left), sPDA-coated (middle), and rPDA-coated (right) glass substrates

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  2.2   蛋白粘附测试结果

  材料表面是否能够抵抗蛋白质吸附是材料表面是否抗生物污染的关键因素之一。由于BSA在通常的培养基中的含量比较高，所以本实验使用BSA来研究蛋白吸附，并使用BCA试剂盒来研究BSA在空白基底、静置生长的聚多巴胺薄膜和振荡生长的聚多巴胺薄膜上的吸附情况。如图 3所示，可以看出，振荡生长的聚多巴胺薄膜上蛋白吸附量明显低于空白基底和静置生长的聚多巴胺薄膜上蛋白吸附量，说明振荡生长的聚多巴胺薄膜能够有效地降低蛋白吸附。

  图 3

  

  图 3.  聚多巴胺薄膜上蛋白的吸附情况

  Figure 3.  BSA adsorption on the blank, sPDA and rPDA cotings

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  2.3   细菌测试结果

  图 4为不同时间段金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在材料表面的粘附情况。从图中可以看出，在每个时间段空白样品上都粘附着大量的细菌，静置生长的聚多巴胺薄膜上细菌的粘附量则更进一步增加，而振荡生长的聚多巴胺薄膜上细菌的粘附量要明显低于其他两种材料。并且，即便在24h之后，无论是大肠杆菌还是金黄色葡萄球菌在材料表面的粘附量也非常少。结合之前静态水接触角的实验结果分析，这可能是由于振荡生成的聚多巴胺涂层表面具有超亲水性，形成的水化层，从而有效地抵抗了细菌吸附。

  图 4

  

  图 4.  不同时间金黄色葡萄球菌在不同材料上的吸附情况(上)；不同时间大肠杆菌在不同材料上的吸附情况(下)

  Figure 4.  Time-dependent adsorption of Staphylococcus aureus (upper) and Escherichia coli (bottom) on the blank, sPDA and rPDA-coated glass surfaces, respectively

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  3.   结论

  研究表明，振荡生长的聚多巴胺薄膜颜色更深、成膜较厚，并表现出超亲水性，从而对BSA和革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性的大肠杆菌均表现出良好的抗吸附性能。这种振荡方法制备的超亲水性的聚多巴胺薄膜可以作为一种绿色的、生物兼容的抗污染涂层材料，在生物医学领域有较好的应用前景。

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  图 1  三组不同基底材料(玻璃(左)、不锈钢(中)和塑料(右))表面的静置溶液生长的聚多巴胺(左栏)和振荡方法生长的聚多巴胺(右栏)涂层

  Figure 1  The polydopamine coatings grown on glass (left), stainless steel (middle), and plastic plates (right) prepared in static (left column) and shaking solution (right column) of dopamine

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  图 2  玻璃基底表面(左)及其修饰有静置溶液生长的聚多巴胺(中)和振荡方法生长的聚多巴胺涂层(右)的接触角

  Figure 2  Typical static contact angles of bare (left), sPDA-coated (middle), and rPDA-coated (right) glass substrates

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  图 3  聚多巴胺薄膜上蛋白的吸附情况

  Figure 3  BSA adsorption on the blank, sPDA and rPDA cotings

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  图 4  不同时间金黄色葡萄球菌在不同材料上的吸附情况(上)；不同时间大肠杆菌在不同材料上的吸附情况(下)

  Figure 4  Time-dependent adsorption of Staphylococcus aureus (upper) and Escherichia coli (bottom) on the blank, sPDA and rPDA-coated glass surfaces, respectively

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