English

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  过渡金属离子的检测跟踪在化学领域及生物科学领域占有举足轻重的地位,同时也是保护环境的一种有效手段^[1]. 铜离子作为人体中必要的微量元素在人体新陈代谢过程中扮演着重要角色^{[2, 3]},但当环境中铜离子浓度过高,铜可在生物体内富集^[4],通过食物链进入人体引起慢性中毒,造成肝脏和肾脏受损^[5],导致一系列严重疾病^[6～10]. 因此,发展高效的Cu²⁺检测方法非常有必要. 荧光分析法作为检测金属离子的一种方法不仅操作简单,而且具有高选择性、高灵敏度、响应时间短等优点^[11～16],从而引起了化学家和生物学家的高度重视. 近年来关于Cu²⁺荧光探针的报道有很多,但是大部分探针都有选择性不高^[17],可逆性不好^[18～20],易受其他金属离子干扰^[21],无法在生物体内应用^{[22, 23]}等缺点,因此设计与合成选择性好、灵敏度高、能够在活细胞中应用的铜离子探针仍然是一个比较活跃的领域.

  吡唑啉及其衍生物是具有许多生理活性的重要杂环化合物之一^[24～26],同时具有较高的荧光量子产 率^[27～29]; 化合物稳定性强^[30～32],常作为荧光探针在高科技领域中应用^[33～47]. 蒽是多环芳香族化合物中的典型代表,该化合物的特点是荧光强度较高^[48],因此作为最常见的芳环被广泛应用于荧光受体的设计中^{[49, 50]}. 基于上述思路,本文设计并合成了一个新型吡唑啉类荧光探针P1. 结果表明探针化合物P1稳定性强,能够快速、可逆地识别Cu²⁺,最低检测线可达2.11×10^-7 mol•L^-1,探针P1在PK-15细胞的荧光成像实验中也能观察到明显的猝灭现象,表明该探针可以用来检测活细胞中的Cu²⁺,具有潜在的生物应用前景. 探针化合物P1合成路线如Eq. 1所示.

  1    结果与讨论

  1.1    分子的设计与合成

  吡唑啉类化合物有许多合成方法,其中最常用的方法是通过肼和α,β-不饱和酮直接反应实现,反应过程需要在酸、碱催化下完成^[51]. 该方法具有操作简单、产率较高、反应条件温和等优点,因此受到广大研究学者的青睐. 本文采用类似合成方法,通过2-肼基苯并噻唑与化合物2与在冰乙酸溶剂中回流得到目标化合物P1.

  1.2    化合物P1的光谱性能研究

  1.3    荧光显微成像实验

  在细胞成像实验中,取20 μL探针化合物P1 (1.0×10^-3 mol/L)加入到2 mL培养好的PK-15活细胞培养基中,在37 ℃下培养30 min后成像,活细胞中发出了明亮的蓝色荧光(图 8a),此时培养液体系中探针的浓度为1.0×10^-5mol/L. 当向上述含探针的细胞培养液中分别加入20和40 μL Cu²⁺ (3.0×10^-3 mol/L),使得 Cu²⁺在培养液体系中的浓度分别为5.0×10^-5和1.0× 10^-4mol/L,并在37 ℃的条件下孵化30 min后再次成像,加入Cu²⁺ (20 μL)的活细胞荧光明显减弱(图 8d),加入Cu²⁺ (40 μL)的活细胞中荧光基本消失(图 8g),并与其相对应的明场图像(图 8b,8e,8h)具有良好的重合度(图 8c,8f,8i为重叠图),这表明探针P1具有良好的细胞渗透性,可以用来检测活细胞中的Cu²⁺.

  

  图8 不同Cu²⁺浓度下,探针P1在PK-15活细胞中的荧光成像

  Figure 8. Fluorescence images of P1 as a function of concentration of Cu²⁺ in PK-15 cells

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  1.4    细胞毒性

  以化合物P1为阳性药,用3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑蓝(MTT)法评价了化合物对PK-15癌细胞的细胞毒性.测试结果显示,化合物P1对癌细胞PK-15没有显示出明显的细胞毒性作用,其IC₅₀值为376.558 μmol/L.

  1.2.1    探针化合物P1的紫外吸收光谱

  探针P1与离子结合之前在252,368,388 nm处有吸收,其中在252 nm处有最大吸收峰. 当加入1 equiv.的Cu²⁺之后最大吸收峰红移至278 nm处,同时裸眼即可观察到溶液颜色由浅黄变为无色(图 1a内插图). 若分别加入1 equiv.的其他金属离子,如Na⁺,K⁺,Ag⁺,Hg²⁺,Ca²⁺,Co²⁺,Zn²⁺,Mg²⁺,Ba²⁺,Cd²⁺,Al³⁺,Fe³⁺,则吸收波长均无明显变化,如图 1b所示. 由Cu²⁺的紫外滴定图(图 2a)显示,随着Cu²⁺浓度的增大,278 nm处的吸光度依次增强,经过拟合得到线性回归方程y=0.0532x+0.213,R²=0.9837,如图 2b.

  

  图1 (a) P1 (1.0×10^-5mol/L)中加1 equiv. Cu²⁺紫外吸收的变化和(b) P1 (1.0×10^-5 mol/L)中分别加入1 equiv.不同的金属离子后紫外吸收的变化

  Figure 1. (a) UV-vis spectra of compound P1 with 1.0 equiv. Cu²⁺,and (b) UV-vis spectral changes of P1 upon additions of 1.0 equiv. various metal ions

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  图2 (a) P1 (1.0×10^-5mol/L)中逐渐加入Cu²⁺的紫外吸收变化曲线图和(b) Cu²⁺滴定化合物P1的线性拟合曲线

  Figure 2. (a) UV-Vis absorption spectrum about P1 upon addition of Cu²⁺ and (b) absorbance plot of P1 against the increasing Cu²⁺

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  1.2.5    探针P1的可逆性研究

  

  图7 EDTA对P1-Cu²⁺的反滴定

  Figure 7. Fluorescence spectra of P1-Cu²⁺ upon addition of EDTA

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  向探针P1+Cu²⁺ (1.0×10^-5mol/L)溶液中加入乙二胺四乙酸(EDTA)溶液,随着体系中EDTA的增加,P1的荧光强度逐渐恢复,上述现象表明探针P1是通过络合反应识别Cu²⁺的. 同等条件下加入EDTA,由于EDTA与Cu²⁺的络合常数K_a=3.16×10¹⁰ L•mol^{-1 [52]}远大于P1与Cu²⁺的络合常数K_a=7.34×10⁴ L•mol^-1,所以荧光恢复,如图 7所示.

  1.2.3    不同浓度的Cu²⁺对探针化合物P1荧光光谱的影响

  在浓度为1.0×10^-5mol/L的P1四氢呋喃溶液中,随着Cu²⁺ (0～10^-4mol/L)浓度的增加,体系荧光逐渐减弱,表明P1与Cu²⁺存在良好的络合作用; 当过量的Cu²⁺ (＞10^-4mol/L)存在时, 探针化合物P1的荧光发射强度仍在减弱,但从图 5可以看出其减弱趋势已明显降低. 经过拟合得到线性回归方程y=-39.234x+523.41,R²=0.9797,并通过计算得到络合常数K_a=7.34×10⁴ L•mol^-1,以化合物P1的6次荧光强度相对标准偏差计算得出,探针P1对Cu²⁺的最低检测线为2.21×10^-7mol/L. 以硫酸奎宁为标准参比溶液,我们测得探针P1本身的荧光量子产率为0.24,加入Cu²⁺后,荧光量子产率显著降低至0.065. 综上数据,可以看出P1对Cu²⁺响应灵敏并且有很好的络合作用.

  

  图5 (a) P1 (10 μmol/L)中逐渐加入Cu²⁺的荧光强度变化曲线图和(b) P1的荧光发射光谱与Cu²⁺浓度关系图及线性拟合曲线图(λ_ex=350 nm)

  Figure 5. (a) Fluorescence emission spectrum of P1 (10 μmol/L) in the presence of Cu²⁺ with concentration increased,and (b) emission spectra of compound P1 as a function of Cu²⁺ concentration (λ_ex=350 nm)

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  1.2.4    探针P1与Cu²⁺的络合研究

  

  图6 P1-Cu²⁺的Job曲线图

  Figure 6. Job’s plot of probe P1-Cu²⁺

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  为了确定探针化合物P1与金属离子之间的络合比,我们绘制了探针P1和Cu²⁺的络合曲线,将P1和Cu²⁺的总浓度保持为1.0×10^-5 mol/L. 浓度比分别为1:9,2:8,3:7,4:6,5:5,6:4,7:3,8:2和9:1的比例, 配制一系列P1与铜离子的混合溶液,测定其吸光度. 从曲线可以清楚地看出,改变Cu²⁺的摩尔分数,探针P1在278 nm处的紫外吸收强度随之变化(图 6). 当Cu²⁺的摩尔分数为0.5时,探针P1和Cu²⁺络合物在278 nm处吸光度达到最大值,表明探针化合物P1与Cu²⁺为1:1络合.

  1.2.2    探针P1对金属离子的选择性识别与干扰性实验

  

  图4 络合物P1-Cu²⁺的抗干扰性研究

  Figure 4. Competitive experiments in the P1-Cu²⁺ system with interfering metal ions

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  为了确定化合物P1对金属离子的识别性能,选择Na⁺,K⁺,Mg²⁺,Ca²⁺,Ag⁺,Hg²⁺,Ca²⁺,Co²⁺,Zn²⁺,Mg²⁺,Ba²⁺,Cd²⁺,Fe³⁺,Al³⁺为识别对象(图 3). 在未加Cu²⁺之前,化合物P1本身荧光强度很强,而加入Cu²⁺之后荧光强度明显减弱. 如图 3内插图所示,在紫外灯下,溶液颜色由亮蓝色基本变为无色. 同样条件下金属离子 Na⁺,K⁺,Mg²⁺,Ca²⁺,Hg²⁺,Ca²⁺,Co²⁺,Zn²⁺,Mg²⁺,Ba²⁺,Cd²⁺,Fe³⁺,Al³⁺却不能引起荧光强度的变化. 为了考察其他金属离子和Cu²⁺共存时对Cu²⁺测定的干扰,在浓度为1.0×10^-5mol/L的P1中加入5 equiv.的Cu²⁺,荧光强度明显减弱; 之后再分别加入其他等量金属离子,荧光强度则无明显变化,如图 4所示. 从图 4可以看出,在其他干扰离子存在时,探针对铜离子的荧光强度基本保持不变. 实验结果证明探针P1对Cu²⁺的抗干扰能力较强,是一个有着高选择性的荧光猝灭型探针.

  

  图3 化合物P1对金属离子的选择性

  Figure 3. Fluorescence response of probe P1 to different metal ions

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  2    结论

  设计合成了探针化合物P1,研究了其紫外吸收光谱和荧光光谱,并探讨了该探针金属离子的选择性识别作用. 结果表明,P1荧光探针能快速、高效、可逆地识别Cu²⁺且具有较低的检测线2.21×10^-7 mol/L; 同时化合物P1自身稳定性强、合成方法简单、产率较高,是一种可行性高的探针化合物. 该探针更适合于生物样品中做实时分析,在PK-15活细胞的显微成像实验中可见该探针可应用于活体细胞中Cu²⁺的检测,细胞毒性实验证明该探针化合物对正常细胞没有明显细胞毒性作用.

  3    实验部分

  3.1    仪器与试剂

  XRC-1型显微熔点仪(四川大学科学仪器厂); Bruker Avance 400型核磁共振仪(TMS为内标,DMSO作溶剂); Esquire 6000型液相色谱/质谱联用仪(Bruker公司); Leica TCS SP8 MP多光子显微镜(德国Leica Microsystems光学制造公司); FE06CN-IF171(ZB)LD/LM荧光分光光度计(VARIAN公司); Cary 50紫外-可见分光光度计(美国Varian公司); RPMI1640培养基(上海士锋生物科技有限公司); PK-15细胞(由中国农业科学院兰州兽医研究所提供). 其它所用试剂均为市售分析纯或化学纯.

  所有试剂均为国产市售分析纯,四氢呋喃溶液经干燥处理,纯净水(去离子处理). 所有金属离子储备液用相应的氯盐或者硝酸盐溶于蒸馏水制得.

  3.2    合成方法

  3.3    光谱测定方法

  测试条件: 室温,样品池为1 cm×1 cm×4 cm石英比色皿,激发狭缝宽度5.0 nm,发射狭缝宽度5.0 nm,激发波长λ_ex为350 nm,灵敏度为1,响应时间0.5 s,于350～550 nm范围内检测荧光. 同样室温条件下,用1 cm×1 cm×4 cm的紫外分光光度计石英比色皿,于200～600 nm范围内检测紫外吸收.

  将化合物P1用四氢呋喃配成1.0×10^-3mol/L溶液,金属盐用蒸馏水配成5.0×10^-3mol/L溶液,移取探针P1溶液30 μL置于含有3 mL四氢呋喃溶液的比色皿中,然后分别加入当量的不同离子溶液,用以测定其紫外吸收光谱及荧光发射光谱(选择性、竞争性、浓度梯度、Job曲线).

  3.4    荧光量子产率的计算方法

  在紫外-可见和荧光分光光度仪上测定探针P1的吸收光谱和荧光发射光谱,记录最大吸收波长、发射波长以及最大吸收波长处的吸光度. 然后将溶液稀释至吸光度在0.06～0.08 之间,测定其发射光谱,并采用下式计算探针在该溶剂中的荧光量子产率: Φ_x=Φ_s×A_s× F_u/A_u×F_s^[55]. 式中: Φ为荧光量子产率,F为发射光谱曲线的积分值,A为在激发波长处的吸光度,下标s和u分别代表相应的标准参比化合物(硫酸奎宁)和探针化合物P1.

  3.5    细胞毒性测试

  辅助材料(Supporting Information) 1-(2-羟基苯基)-4-(9-蒽基)-3-苯并噻唑基吡唑啉(P1)的¹H NMR与¹³C NMR谱图. 这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载

  将PK-15细胞置于含5%小牛血清的RPMI1640培养液中,在37 ℃、含5% CO₂的培养箱中复苏,培养2代,将第3代细胞接种于96孔板,每孔100 μL,培养24 h (37 ℃,5% CO₂); 分别加入等体积不同浓度的样品溶液(DMSO作溶剂),使终浓度分别为10、50、100、200、300、400 μmol•L^-1,每个浓度3孔,DMSO作阴性对照,再培养48 h,每孔加入20 μL MTS溶液,再置培养箱中培养4 h; 在酶标仪570 nm波长处测定吸光度,计算样品对PK-15细胞生长的抑制率(%). 抑制率(%)= (OD_空白-OD_样品)/OD_空白×100%^[56]. 半数抑制浓度(IC₅₀)值用SPSS统计软件计算得到.

  3.2.1    探针1-(2-羟基苯基)-4-(9-蒽基)-3-苯并噻唑基吡唑啉(P1)的合成

  化合物1的合成方法参考文献^[53],化合物2的合成方法参照文献^[54]. 将0.17 g (1mmol)化合物1和0.33 g (1 mmol)化合物2溶解在15 mL醋酸中,搅拌下加热回流6 h,薄层色谱(TLC)监测反应进程. 反应完成后,混合物冷却至室温,倾入冰水,乙酸乙酯萃取,有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸镁干燥,浓缩后柱层析纯化得到0.29 g探针化合物P1,橙黄色固体,产率62%. m.p. 187 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆,400 MHz) δ: 2.82 (dd,J=16.0,4.0 Hz,1H),3.90 (dd,J=16.0,12.0 Hz,1H),7.11 (d,J=8.0 Hz,1H),7.16～7.24 (m,3H),7.54 (dd,J=8.0,4.0 Hz,5H),7.61 (d,J=4.0 Hz,1H),7.62 (s,1H),7.95 (dd,J=8.0,8.0 Hz,1H),8.15 (dd,J=4.0,4.0 Hz,2H),8.67～8.71 (m,4H); ¹³C NMR (DMSO-d₆,100 MHz) δ: 161.8,136.6,131.6,129.7,129.6,129.3,129.2,127.1,126.8,125.6,122.0,121.6,118.7,76.2,42.9; ESI-MS m/z: 471.3. Anal. calcd for C₃₀H₂₁N₃OS: C 76.47,H 4.51,N 8.90; found C 76.41,H 4.49,N 8.91.

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  图 1  (a) P1 (1.0×10^-5mol/L)中加1 equiv. Cu²⁺紫外吸收的变化和(b) P1 (1.0×10^-5 mol/L)中分别加入1 equiv.不同的金属离子后紫外吸收的变化

  Figure 1  (a) UV-vis spectra of compound P1 with 1.0 equiv. Cu²⁺,and (b) UV-vis spectral changes of P1 upon additions of 1.0 equiv. various metal ions

  Inset: the color change picture of compound P1 with 1.0 equiv. Cu²⁺

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  图 2  (a) P1 (1.0×10^-5mol/L)中逐渐加入Cu²⁺的紫外吸收变化曲线图和(b) Cu²⁺滴定化合物P1的线性拟合曲线

  Figure 2  (a) UV-Vis absorption spectrum about P1 upon addition of Cu²⁺ and (b) absorbance plot of P1 against the increasing Cu²⁺

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  图 3  化合物P1对金属离子的选择性

  Figure 3  Fluorescence response of probe P1 to different metal ions

  Inset: the color change picture of probe P1 with 1.0 equiv. Cu²⁺ in UV analyzer

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  图 4  络合物P1-Cu²⁺的抗干扰性研究

  Figure 4  Competitive experiments in the P1-Cu²⁺ system with interfering metal ions

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  图 5  (a) P1 (10 μmol/L)中逐渐加入Cu²⁺的荧光强度变化曲线图和(b) P1的荧光发射光谱与Cu²⁺浓度关系图及线性拟合曲线图(λ_ex=350 nm)

  Figure 5  (a) Fluorescence emission spectrum of P1 (10 μmol/L) in the presence of Cu²⁺ with concentration increased,and (b) emission spectra of compound P1 as a function of Cu²⁺ concentration (λ_ex=350 nm)

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  图 6  P1-Cu²⁺的Job曲线图

  Figure 6  Job’s plot of probe P1-Cu²⁺

  Total concentration is 1.0×10^-5mol/L

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  图 7  EDTA对P1-Cu²⁺的反滴定

  Figure 7  Fluorescence spectra of P1-Cu²⁺ upon addition of EDTA

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  图 8  不同Cu²⁺浓度下,探针P1在PK-15活细胞中的荧光成像

  Figure 8  Fluorescence images of P1 as a function of concentration of Cu²⁺ in PK-15 cells

  (a) Fluorescence images of PK-15 cells treated with P1; (b) bright-field image of cells shown in panel; (c) overlay image of a and b; (d) fluorescence images after presence of Cu²⁺ (20 μL); (e) bright-field image of cells shown in panel; (f) overlay image of d and e; (g) fluorescence images after presence of Cu²⁺ (40 μL); (h) bright-field image of cells shown in panel; (i) overlay image of g and h

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