English

• 1.   引言

  心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)是公认的心肌损伤的生物标志物之一, 在急性心肌梗死早期诊断中起着重要的作用^{[1, 2]}.正常人体内血清cTnI浓度微量, 心肌损伤时, 肌钙蛋白复合物从组织中释放入血, 血清cTnI可升高至几十纳克每毫升^[3].临床上测定血清cTnI的方法有酶联免疫分析(ELISA), 电化学发光免疫分析等^[4].不同检测系统检测结果差异较大, 导致不同实验室之间cTnI测量结果缺乏可比性^{[5, 6]}.建立血清cTnI参考方法、研制血清标准物质能使不同检测系统检测结果具有跨时空可比性^{[4, 5, 7]}.

  液相色谱串联质谱法(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)特异性高、准确度好, 在小分子物质研究中应用广泛^{[8, 9]}.近年来, LC-MS/MS逐渐应用于血清蛋白定量. Agger等^[10]通过LC-MS/MS法直接定量血清载脂蛋白A-I和载脂蛋白B. Kuhn等^[11]从类风湿关节炎患者血清中提取C-反应蛋白, 并用LC-MS/MS法对其进行定量分析. Keshishian等^[12]和Kuhn等^[13]建立了LC-MS/MS法定量血清cTnI.两者选用不同的富集方案, 前者使用免疫亲和柱去除血清中12种高丰度蛋白以富集cTnI, 然后进行蛋白酶解、上机检测; 后者于样本酶解后使用磁珠包被特异性肽抗体富集目标肽段, 随后上机检测、分析.前者的检测限稍逊于后者, 可能与以下两方面因素有关:一、cTnI与高丰度蛋白相互作用, 吸附在耗竭装置上, 导致绝对回收率降低; 二、两者使用不同品牌的仪器设备, 采用的离子源设计技术不同, 导致cTnI在不同仪器上响应并不完全相同^[14].

  本实验室自建液相色谱串联质谱法检测血清肌钙蛋白Ⅰ, 仪器为AB Sciex 5500三重四级杆质谱仪, 样本直接经免疫磁珠富集纯化, 随后酶解、检测.本法具有选择性强、重复性和准确度好等优点, 为进一步研制血清cTnI标准物质提供参考.

  2.   结果与讨论

  2.1   肽段设计及离子对的选择

  根据人源cTnI蛋白质氨基酸序列, 用PeptideMass和ProtParam软件预测、筛选的cTnI肽段有NITEIADLTQK、NIDALSGMEGR、TLLLQIAK. NITEIADLTQK分子量为1245.7 Da, 在仪器检测范围内质谱全扫描中丰度高, 经Protein Blast检索该肽段为特异性肽段, 提示它可以用来特异性地定量血清cTnI.特异性肽中的亮氨基酸(L)位点, 标记便宜、方便.因此, 我们最终合成的特异性肽和同位素内标肽分别为NITEIADLTQK (1245.4 Da)、NITEIAD[(¹³C₆, ¹⁵N)L]TQK (1252.6 Da).合成的同位素内标肽的理化性质与目标特异性肽基本一致, 出峰位置一致, 能校正基质效应的影响.

  使用美国AB Sciex 5500三重四级杆质谱仪分析目标肽段, ESI+模式下对特异性肽溶液进行一级扫描, 可见[M+H]⁺和[M+2H]²⁺离子峰, [M+2H]²⁺丰度高, 选做母离子, 其质荷比为623.6±0.2;调节去簇电压(DP)和碰撞能量(CE), MS/MS扫描碎片离子(子离子), 选取信号最强的三个子离子, 优化各项参数.同位素内标肽设置与特异性肽一致.质谱扫描特异性肽段离子对为623.6/1018.6(y⁹)、623.6/675.5(y⁶)、623.6/788.5(y⁷)(见图 1);同位素标记肽段离子对为627.1/1025.5、627.1/682.4、627.1/795.5(见图 2).

  图 1

  

  图 1.  内源性肽段的ESI-MS质谱图

  Figure 1.  ESI-MS spectrum of the endogenous peptide

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  图 2

  

  图 2.  标记肽段的ESI-MS质谱图

  Figure 2.  ESI-MS spectrum of the isotope labelled peptide

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  2.2   色谱条件确定及优化

  血清中成分比较复杂, 单一的流动相不能使各成分很好地分离, 我们采用梯度洗脱并调控洗脱程序使目标物分离出来.为了获得更好的分离效果, 先后研究不同流动相组成、不同比例以及不同流速的分离效果.单独使用水和乙腈作为流动相, 色谱峰峰形差, 严重拖尾.为了改善峰形, 分别向流动相A、流动相B中加入0.1%甲酸(V/V), 色谱峰尖锐、光滑、对称且分离度好.调整流动相的比例和流速, 样本可在15 min内完成检测, 目标肽段的出峰时间约在4.95 min.

  2.3   样本前处理条件优化

  2.3.1   血清cTnI的免疫富集

  血清中蛋白种类和数量多、丰度差异大、范围宽^{[15, 16]}.高丰度蛋白(白蛋白, 免疫球蛋白等)浓度达g/L, 常干扰低丰度蛋白(包括cTnI)的检测, 需要将其去除. Kuhn等^[13]样品酶解后使用磁珠包被特异性肽抗体富集目的肽段, 效果良好.本研究用Sigma公司ProteoPrep®去除高丰度蛋白试剂盒对血清样本进行纯化, 初次纯化后样本中依然存在较多干扰峰(如图 3所示, 目标肽段在4.94 min出峰, 其他为干扰峰).经研究, 采用免疫磁珠法对血清cTnI进行富集.我们选用Abcam公司cTnI抗体(ab38210), 可特异性结合血清中游离的cTnI和cTnI复合物.从图 3b中可以看出, 目标肽段为单一峰, 表明免疫磁珠法能特异地富集cTnI, 减少其他蛋白质的干扰.此外, 我们使用电化学发光法测定磁珠富集前后血清cTnI的变化, 计算免疫富集效率.我们分别测定添加纯蛋白cTnI的血清、添加SRM2921的血清以及病人血清, 其对应的血清富集效率均值分别为47.46%, 46.14%, 49.05%.

  图 3

  

  图 3.  血清样本处理. (a)免疫磁珠富集血清, 目标峰单一; (b)血清高丰度蛋白去除, 干扰较多

  Figure 3.  Two approaches for sample treatment. (a) Enrichment of serum with immunomagnetic beads. (b) High abundant protein depletion of serum with ProteExtract Abundant Protein Extraction Kit

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  2.3.2   变性条件优化

  尿素是蛋白质质谱分析法中最常使用的变性剂之一.不同蛋白质理化性质不同, 可能需要不同浓度尿素进行变性. Williams等^[17]建立液相色谱串联质谱法检测血清C反应蛋白, 使用6 mol/L尿素变性. Ji等^[18]应用液相色谱串联质谱法检测血清胱抑素C, 认为热变性联合8 mol/L尿素变性效果好.我们研究了6 mol/L、8 mol/L尿素以及联合热变性效果, 发现8 mol/L尿素直接变性蛋白, 目标肽与内标峰面积比最大, 变性效果最佳, 结果见图 4.

  图 4

  

  图 4.  变性条件的优化

  Figure 4.  Optimization of denature condition

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  2.3.3   酶解条件优化

  胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶, 是蛋白质组学分析中最常用的工具酶.它可特异性地识别并切割赖氨酸(K)和精氨酸(R), 产生含有一个K或者R结尾的短肽, 可用于质谱分析^[19].动物胰脏来源的普通胰蛋白酶通常掺杂胰糜蛋白酶, 能同时酶切酪氨酸、苯基丙氨酸和色氨酸等位点, 产生的肽段太短, 质谱分析信号杂乱.此外, 普通胰蛋白酶未经修饰, 存在自消化现象, 产生酶解片段干扰目标肽段的分析^[20].本研究使用Promega公司生产的测序级胰酶, 该酶进行甲基化修饰, 能防止自身水解, 抑制掺杂的糜蛋白酶活性^{[21, 22]}.

  为了使cTnI能充分酶解成肽段, 优化酶与蛋白质比例以及酶解时间.我们研究了不同酶与蛋白质量比(1:100、1:50、1:20、1:10、1:5, μg/μg)以及不同酶解时间(0.5 h、2 h、4 h、6 h、16 h)的酶解情况, 选取酶解曲线的最高点或者平台期作为最佳酶解条件.如图 5、图 6所示.酶与蛋白质量比≤1:20, 蛋白质酶解不完全; 酶与蛋白质量比到1:10, 蛋白质酶解完全, 内源性与标记肽段峰面积比达到稳定; 酶解时间在4 h时, 酶解效率最高, 达到稳定状态.同时, 通过计算酶解肽段含量与理论的酶解肽段含量.结果表明酶解时间超过4 h后, 蛋白质酶解效率可达90%以上.

  图 5

  

  图 5.  酶与蛋白比例优化

  Figure 5.  Optimization of mass ratio of trypsin to protein

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  图 6

  

  图 6.  酶解时间优化

  Figure 6.  Optimization of digestion time

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  2.3.4   固相萃取条件优化

  常用固相萃取柱对目标物进行富集净化处理.本研究考察了Oasis MAX萃取柱和Sep-Pak C18萃取柱的吸附效率及净化效果. Oasis MAX和Sep-pak C18回收率接近, 分别为68.59%和70.35%;溶液流经Oasis MAX柱时, 流速快于Sep-pak C18, 萃取时间短.该肽段呈酸性, 使用混合型阴离子交换反相吸附剂的Oasis MAX柱对其具有更高的选择性, 净化效果更好.进一步研究Oasis MAX柱的洗脱条件, 2%甲酸甲醇溶液(V/V)洗脱目标肽段时回收率为66.09%;甲酸浓度为4%时, 目标肽段的回收率为73.71%.

  2.4   方法学评价

  2.4.1   线性范围和检测限

  本研究采用基质匹配标准校正法和同位素内标法对基质效应进行补偿.选用健康体检者的血清作为空白血清基质(常规方法测定, 浓度＜0.012 ng/mL), 将cTnI蛋白溶液(621 ng/mL)稀释成不同浓度10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、600 ng/mL.所有标准品经过样品前处理, 按照浓度由低到高依次进样.用软件Analyst1.2.1分析特异性肽/同位素内标肽三对离子对峰面积并制作标准曲线, 峰面积比为Y轴, 蛋白液浓度为X轴.三对离子对拟合的标准曲线(见图 7)分别为y⁶: y＝0.00638x+0.0465 (r＝0.9981), y⁷: y＝0.00906x－0.1735 (r＝0.9953), y⁹: y＝0.00656x－0.0701 (r＝0.9973).空白血清基质中加入标准溶液进行处理、检测, 以离子信噪比S/N＝3对应的浓度为样品的检出限(LOD), S/N＝10为最低定量限(LLOQ).本法LOD为2.5 ng/mL, LOQ为8.32 ng/mL. Keshishian^[12]和Kuhn^[13]建立液相色谱串联质谱法检测血清肌钙蛋白Ⅰ LOD分别为3.38 ng/mL、1.5 ng/mL, LOQ分别为10.13 ng/mL、2.8 ng/mL.我们的结果与Keshishian相接近, 稍逊于Kuhn法, 可能因为使用的仪器不同, 目标肽段产生了不同的响应, 导致检测限稍有不同.

  图 7

  

  图 7.  三对离子对的标准曲线. a, b, c三图分别对应y⁶, y⁷, y⁹三条曲线. d图为每条曲线对的斜率、截距和Pearson相关系数

  Figure 7.  Calibration curves of three transitions by plotting the peak area ratio against the concentration of cTnI. The figure a, b, c correspond to curves of y⁶, y⁷, y⁹. Figure d listed the slope, intercept and Pearson correlation coefficient of three curves

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  2.4.2   正确度和精密度

  cTnI标准物质SRM2921 (31.2 mg/L±1.4 mg/L)进行正确度验证.将标物用空白血清稀释为20.8 ng/mL、62.4 ng/mL和124.8 ng/mL, 分别于1天内连续测定3次, 连续测定4天, 单因素方差法计算批内、批间和总不精密度.结果见表 1.低、中、高三个浓度的相对偏倚分别为－7.94%、－6.69%和－6.49%; cTnI低、中、高样品总不精密度分别为6.43%、3.18%和2.75%.

  表 1

  

  表 1  血清cTnI正确度及不精密度评价

  Table 1.  The evaluation of accuracy and imprecision of serum cTnI

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  理论值/ (ng•mL－1)	检测均值/ (ng•mL－1)	相对偏倚/%	批内CV/%	批间CV/%	总CV/%
  20.8	19.15	－7.94	2.09	6.09	6.43
  62.4	58.23	－6.69	1.71	2.68	3.18
  124.8	116.70	－6.49	0.80	2.63	2.75

  2.4.3   携带污染率

  配制1.0 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL的肽段标准溶液, 内标肽段浓度为1 ng/mL.按照1.0、50、1.0 ng/mL和1.0、20、1.0 ng/mL的顺序进样来研究携带污染率.两个浓度(20、50 ng/mL)的携带污染率分别为－0.47%和0.04%.本检测方法携带污染较小.

  2.5   临床标本检测

  2018年10月收治的5例急性心肌梗塞的患者血清(发作72 h), 见表 2.本法准确测定患者血清cTnI, 浓度在(16.38~557.53) ng/mL之间, 结果与强生Vitros 5600化学发光法相近, 提示本方法可用于cTnI血清标准物质的研制.

  表 2

  

  表 2  心肌梗塞患者血清cTnI水平

  Table 2.  Serum cTnI levels in AMI patients using two assays

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  血清样本	LC-MS/MS/(ng•mL－1)	化学发光免疫法/(ng•mL－1)
  1	52.31	55.4
  2	23.06	18.4
  3	169.36	174.0
  4	557.53	532.0
  5	16.38	14.8

  3.   结论

  建立了ID-LC-MS/MS法检测血清肌钙蛋白Ⅰ, 免疫磁珠富集可成功将待测的目标cTnI从血清中纯化, 采用同位素标记肽段作为内标, 可减少基质效应的影响, 从而准确定量.本方法线性关系好, 正确度、精密度以及携带污染率符合生物分析方法导则标准.本研究可以为cTnI血清参考方法的建立提供依据.

  4.   实验部分

  4.1   样品前处理

  4.1.1   免疫磁珠制备及血清cTnI富集

  参照PuriMag G-Ts磁珠使用说明书制备免疫磁珠并对血清cTnI进行富集.主要步骤如下:将抗体与磁珠(抗体:磁珠＝20 μg:1 mg)置于37 ℃环境中进行耦联; 用含0.5% BSA的PBS缓冲液封闭未结合位点; 0.1% BSA的PBS缓冲液清洗三次, 得到免疫磁珠.准确称取1 mL的血清, 加入50 μL(约含抗体10 μg)的免疫磁珠, 室温条件在混匀结合2 h, 置于磁性分离器上静置10 min, 弃上清; 用0.1% BSA的PBS缓冲液清洗三次, PBS缓冲液清洗两次, 以减少非特异性干扰.

  4.1.2   变性、还原、乙酰化、酶解

  于收集管加入250 μL 25 mmol/L碳酸氢铵充分混匀, 用8 mol/L尿素使蛋白质充分变性; 接着与10 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)溶液在60 ℃水浴箱中反应30 min, 断开蛋白质结构中的二硫键; 反应结束后立即和50 mmol/L碘乙酰胺(IAM)溶液在室温下避光反应30 min, 避免打开的巯基被氧化.为了减弱尿素对胰酶活性的影响, 加入适量的碳酸氢铵稀释样本, 使尿素浓度小于1 mol/L.于收集管中添加适量同位素内标肽, 同时加入胰酶, 胰酶与血清中cTnI(常规方法测量)质量比为1:10, 37 ℃水浴4 h, 加入适量三氟乙酸使反应体系浓度为0.1%, 终止酶解.

  4.1.3   肽段纯化、浓缩

  用Oasis MAX固相萃取柱(60 mg/3mL, 60 μm)纯化样品, 先加3.0 mL甲醇活化萃取柱, 待甲醇流尽后加3.0 mL超纯水平衡柱子, 加入酶解产物, 先后用3.0 mL 5%氨水、3.0 mL甲醇洗涤, 最后用2.0 mL 4%甲酸甲醇洗脱.在氮吹仪上浓缩洗脱液, 气体流量5 mL/min, 温度35 ℃, 待有机溶剂挥发后, 用50 μL 0.1% FA溶解, 上机, 进样量5 μL.

  4.2   特异性肽段选择

  使用数据库搜索人源Troponin I氨基酸序列(Accession:NP_000354.4), 然后用Peptide Mass和ProtParam软件在线预测胰酶水解后产生的肽段并分析肽段的分子量、等电点、稳定性等性质(网址: https:// www.expasy.org/proteomics), 结合本实验室质谱仪性能参数选取肽段, 将肽段在Pubmed蛋白质数据库进行Blast同源检索, 确定目的肽段, 另合成同位素内标肽.

  4.3   色谱条件

  色谱柱为Water公司SymmetryShield C18 (150 mm×2.1, 3.5 μm); 流动相A为0.1%甲酸水溶液, 流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液.梯度洗脱: 0~2 min, 5% B; 2~8 min, 5%~50% B; 8~9 min, 50%~90% B; 9~14 min, 90%~5% B; 14~15 min, 5% B.流速0.2 mL/min; 柱温35 ℃; 上样量5 μL.

  4.4   质谱条件

  电喷雾离子源, 正离子方式检测, 扫描方式为多反应监测(MRM), 离子喷射电压5500 V, 温度550 ℃, 气帘气体(CUR)为25 psi, 碰撞气体(CAD)8 psi.多反应监测离子对、锥孔电压、碰撞能等质谱参数见表 3.

  表 3

  

  表 3  肌钙蛋白Ⅰ特征肽段多反应监测模式(MRM)质谱条件

  Table 3.  Specific peptide of troponin Ⅰ and their parameters in multi-reactions monitoring (MRM) analysis

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  Peptide sequence	Parent ion (m/z)	Daughter Ion (m/z)	DP/V	CE/V	EP/V	CXP/V
  NITEIADLTQK	623.6	1018.6	100	27	10	19
  		788.5	110	30	10	17
  		675.5	110	32	10	15
  NITEIAD[(13C6, 15N) L]TQK	627.1	1025.5	100	27	10	19
  		795.5	110	30	10	17
  		682.24	110	32	10	15

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• 

  图 1  内源性肽段的ESI-MS质谱图

  Figure 1  ESI-MS spectrum of the endogenous peptide

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  图 2  标记肽段的ESI-MS质谱图

  Figure 2  ESI-MS spectrum of the isotope labelled peptide

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  图 3  血清样本处理. (a)免疫磁珠富集血清, 目标峰单一; (b)血清高丰度蛋白去除, 干扰较多

  Figure 3  Two approaches for sample treatment. (a) Enrichment of serum with immunomagnetic beads. (b) High abundant protein depletion of serum with ProteExtract Abundant Protein Extraction Kit

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  图 4  变性条件的优化

  Figure 4  Optimization of denature condition

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  图 5  酶与蛋白比例优化

  Figure 5  Optimization of mass ratio of trypsin to protein

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  图 6  酶解时间优化

  Figure 6  Optimization of digestion time

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  图 7  三对离子对的标准曲线. a, b, c三图分别对应y⁶, y⁷, y⁹三条曲线. d图为每条曲线对的斜率、截距和Pearson相关系数

  Figure 7  Calibration curves of three transitions by plotting the peak area ratio against the concentration of cTnI. The figure a, b, c correspond to curves of y⁶, y⁷, y⁹. Figure d listed the slope, intercept and Pearson correlation coefficient of three curves

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  表 1  血清cTnI正确度及不精密度评价

  Table 1.  The evaluation of accuracy and imprecision of serum cTnI

  理论值/ (ng•mL－1)	检测均值/ (ng•mL－1)	相对偏倚/%	批内CV/%	批间CV/%	总CV/%
  20.8	19.15	－7.94	2.09	6.09	6.43
  62.4	58.23	－6.69	1.71	2.68	3.18
  124.8	116.70	－6.49	0.80	2.63	2.75

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  表 2  心肌梗塞患者血清cTnI水平

  Table 2.  Serum cTnI levels in AMI patients using two assays

  血清样本	LC-MS/MS/(ng•mL－1)	化学发光免疫法/(ng•mL－1)
  1	52.31	55.4
  2	23.06	18.4
  3	169.36	174.0
  4	557.53	532.0
  5	16.38	14.8

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  表 3  肌钙蛋白Ⅰ特征肽段多反应监测模式(MRM)质谱条件

  Table 3.  Specific peptide of troponin Ⅰ and their parameters in multi-reactions monitoring (MRM) analysis

  Peptide sequence	Parent ion (m/z)	Daughter Ion (m/z)	DP/V	CE/V	EP/V	CXP/V
  NITEIADLTQK	623.6	1018.6	100	27	10	19
  		788.5	110	30	10	17
  		675.5	110	32	10	15
  NITEIAD[(13C6, 15N) L]TQK	627.1	1025.5	100	27	10	19
  		795.5	110	30	10	17
  		682.24	110	32	10	15

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