睾酮素是一种固类醇类激素，主要负责男性青春期的性发育。准确测定生物体内睾酮素的含量，对诊断人体生殖方面的疾病有重要意义[1]。目前，用于睾酮素检测的方法主要有基于仪器分析的HPLC[2]、GC-MS[3]、LC-MS/MS[4]法，以及基于免疫测试的放射免疫分析[5]和酶联免疫吸附法[6]等。这些方法大多耗时费力，并需要繁琐的前处理步骤和大量的有机溶剂，因此，发展针对睾酮素的快速、高灵敏度和高选择性的分析方法具有重要的实际应用价值。
表面等离子体共振(SPR)是一种物理光学现象，可以通过测定芯片金属膜表面的折射率变化监测芯片上分子间的相互作用[7, 8]。与传统检测手段相比，SPR技术具有操作简单、灵敏度高、无需标记、可实时监测等优点[9, 10]。分子印迹聚合物因具有稳定性高、可再生性强及选择性好的特点，常被用作SPR芯片表面的识别元素检测溶液中的分子[11, 12]。
在SPR芯片表面制备分子印迹聚合物薄膜(MIF)的方法主要有旋涂法、沉积法和电聚合的方法，这些方法虽然简单易行，但是很难控制印迹膜的厚度[13]或者存在选择性差的缺陷[14]。“接枝到表面”的方法也常被用于解决MIF与SPR芯片的界面问题，然而由于存在空间屏蔽作用，分子印迹聚合物链的键合密度会随着接枝的进行而降低，影响成膜的均匀性[15]。为了克服上述问题，本实验引入了紫外光引发转移终止剂的表面接枝体系，将引发剂固定在芯片表面作为引发点，接着从芯片表面引发聚合物链增长形成聚合物膜，实现了聚合物膜在芯片表面的均匀稳定增长，同时避免了聚合过程中溶液中单体均聚等副反应发生，使膜更均匀[16]。在光接枝反应中，聚合物的膜厚一般是通过光照反应时间来调节[17]，为了合成厚度可控的MIF，本实验利用SPR仪器对接枝过程进行现场监测，根据反射光强的变化决定停止光照反应的时间，从而提高了对聚合过程的可控性和制备印迹膜的重现性。合成的分子印迹薄膜应用于SPR传感器中，实现了对睾酮素简单、快速、高灵敏度的检测。
采用真空蒸镀法在镧玻璃表面蒸镀一层45 nm厚的金膜，将金膜芯片浸入3 mmol/L烯丙基硫醇的乙醇溶液中，浸泡24 h后，在金表面形成一层烯丙基硫醇自组装(SAM)膜。用乙醇反复冲洗芯片表面，氮气吹干备用。量取20μL二乙基二硫代氨基羧酸苄酯(BDC)完全溶解于5 mL乙腈中，通氮气10 min除去溶液中的氧气。将溶液注入反应池中，紫外灯(2 W/cm2，λ=365 nm)照射30 min，将引发转移终止剂固定在芯片表面。
分子印迹膜制备：首先将模板分子睾酮素(0.1 mmol)和功能单体甲基丙烯酸(MAA，0.4 mmol)完全溶于2 mL乙腈中，室温下预聚合3 h，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，0.3 mmol)，超声振荡使聚合液混合均匀，通入氮气10 min。将反应液注入到与已固定BDC的芯片表面接触的反应池中，紫外灯(2 W/cm2，λ=365 nm)照射进行现场表面接枝聚合反应，反应达到目标共振角后停止光照。制备的MIF用甲醇-乙酸(9:1, V/V)混合液洗脱除去模板分子，在印迹膜中形成识别位点。MIF的制备原理示意图见图 1。用同样的方法制备不含模板分子睾酮素的非分子印迹膜(NIF)。
合成睾酮素分子印迹膜后，利用偏振调制-红外反射吸收光谱仪(PM-IRRAS, Nicolet 8700, 美国赛默飞世尔公司)和原子力显微镜(AFM, Veeco Inova, 德国)对SPR传感芯片表面进行表征。
SPR检测装置如图 1所示，检测过程如下：吸附实验前先扫描固定点的SPR角度曲线，调节入射角使其固定在光强变化最灵敏处监测吸附动力学。用蠕动泵进样，流速保持为0.25 mL/min，将配制好的一系列睾酮素的乙腈溶液按浓度从小到大的顺序依次注入流通池中，每个浓度的样品溶液与洗脱后的MIF充分反应15 min后，通入乙腈5 min冲洗芯片表面，对芯片固定点再次进行角度扫描，记录SPR角度光谱图。选择性实验通过注入睾酮素类似物(雌二醇、雌三醇、黄体酮)的吸附液与睾酮素分子印迹膜作用进行。为了检测所合成的睾酮素分子印迹膜在实际样品中的吸附特性，将此传感器应用于检测人工尿液中的睾酮素。
在金膜表面接枝MIF过程中，印迹膜的膜厚越大，金表面的物质质量及折射率随之变大，耦合共振角也会越大，所测得的共振角与MIF的膜厚存在正向对应关系。接枝印迹膜之前用Wispall软件(德国马普高分子研究所根据SPR原理开发的专门拟合SPR曲线的软件)对SPR芯片金膜表面的角度扫描曲线进行了拟合，并根据拟合参数绘制出了金膜表面接枝不同厚度(0~100 nm)印迹膜的角度扫描曲线，如图 2所示。将入射角固定在71°处，监测成膜过程，光强随着膜厚增长而逐渐降低，当膜厚增至80 nm时，光强降到最低，此后继续光照反应，反射光强开始上升，若在拐点处停止光照，则此时所成膜的共振角即为71°，厚度为80 nm(图 2)。综上分析，在目标共振角处监测光强动力学可以有效控制所成印迹膜的共振角。
SPR现场监测MIF成膜过程的动力学曲线及成膜前后芯片的角度-光强变化如图 3所示。接枝之前，将表面修饰有BDC引发转移终止剂的SPR芯片在乙腈中扫描角度曲线，得到共振角度为59.46°(图 3A)，选取角度为71°，共振光强为60.3%的位置现场监测MIF接枝过程(图 3B)。如图 3B所示，先通入乙腈，当芯片表面稳定后，通入反应液开始紫外光照聚合。光照刚开始时，光强变化平缓，这段时间为预引发阶段，约15 min。之后反射光强下降迅速，说明分子印迹聚合物开始被接枝到芯片表面。反射光强达到最低值，立即停止光照聚合，整个接枝过程耗时约46 min；通入乙腈冲洗芯片表面未反应物质，进行SPR角度扫描。接枝上睾酮素分子印迹膜的SPR芯片共振角为70.65°，与所设的目标共振角71°相差0.35°(图 3A)，偏差是由两方面的原因造成的：一是人为停止光照反应时间的误判；二是反应溶液和乙腈的折射系数不同，即聚合动力学在反应溶液中记录，角度扫描是在乙腈中进行。尽管有小的偏差，利用在目标共振角处监测接枝膜生长仍然可以有效控制所成膜的共振角，进而达到控制膜厚的目的。
模板分子睾酮素与功能单体MAA通过氢键作用形成主客体配合物，再与EGDMA共聚合得到睾酮素分子印迹膜(图 1)。甲醇-乙酸(9:1, V/V)洗脱液与MIF接触时，会破坏睾酮素与MAA之间的氢键，除去模板分子。对洗脱前后的分子印迹膜进行角度扫描，发现共振角从70.65°下降到69.27°，减少1.38°，说明模板分子成功从印迹膜洗脱，在聚合物中留下可以特异识别模板分子的孔穴，导致分子印迹膜的折射率降低。
由于分子印迹膜是利用表面接枝的方法长在玻璃基底上，且膜较薄，为纳米级别，因此，利用PM-IRRAS对其结构进行表征，光谱图如图 4所示。指纹区中1389 cm-1及1454 cm-1附近的峰对应甲基及亚甲基的弯曲振动；1735 cm-1为酯键(CO)的伸缩振动峰；1261和1169 cm-1附近的峰分别对应COC的反对称和对称振动。由图 1的分子印迹膜的制备原理图可知，聚合物中的功能单体MAA和交联剂EGDMA占主体，而PM-IRRAS模式检测的分子量很少信号很弱，因此尽管在图谱中只能观察到MAA及EGDMA结构为主的峰位，也很好地证明了聚合物的基本结构，说明睾酮素MIF被成功接枝到SPR芯片表面。
利用AFM对SAM和MIF修饰的SPR芯片表面进行了表征，如图 5所示，自组装膜表面较平整，厚度约5 nm(图 5A和图 5B)。分子印迹膜的表面散布着不同大小尺寸的孔穴，孔径的直径在100~700 nm之间，分子印迹膜的厚度为50~200 nm(图 5C和图 5D)。印迹膜上散布的孔穴是睾酮素模板分子被洗脱掉所致。这些纳米尺寸的孔径为目标分子进入印迹聚合物膜内部与作用位点结合提供了重要通道。
为了评价表面接枝印迹膜中的识别位点对睾酮素分子的亲和能力，将不同浓度(2.5×10-16, 2.5×10-14, 2.5×10-12, 2.5×10-10, 2.5×10-8和2.5×10-6 mol/L)的睾酮素溶液连续地依次注入流通池中与印迹膜发生反应。当睾酮素分子被印迹孔穴捕捉到后，SPR共振角右移至较大角度(图 6A)。随着吸附液中睾酮素浓度的增加，共振角逐渐变大。例如，吸附2.5×10-14 mol/L睾酮后，共振角变为69.7°，相较于洗脱后的MIF共振角69.27°增加了0.43°。吸附一系列浓度之后(2.5×10-16~2.5×10-6 mol/L)，共振角共增加1.26°，显示MIF中的孔穴大部分已被睾酮素模板分子占据。
吸附动力学中光强的变化也可以进一步证明分子印迹膜对睾酮素具有很好的亲和性(图 6B)。吸附前通入未加模板的乙腈溶液15 min，发现光强并未发生变化，表明MIF在乙腈中能稳定存在。通入睾酮素溶液后，反射光强随着模板分子在MIF上的吸附逐渐上升，例如，吸附2.5×10-14 mol/L的睾酮后，光强反射率上升2.8%；吸附1.0×10-6 mol/L睾酮素后，光强反射率共上升8.7%。MIF对睾酮素的吸附量随着初始浓度的增大而增加，最后吸附达到饱和。吸附过程中光强反射率的增加值与睾酮素的浓度是非线性的(图 6C)，表明MIF对目标物的结合位点不是单一的，在低浓度和高浓度范围内分别存在明显的线性关系，表明MIF对目标分子有两类不同的结合位点，这是由于功能单体与目标物之间存在多种作用方式[18, 19]。对低浓度(2.5×10-16, 2.5×10-14和2.5×10-12 mol/L)和高浓度(2.5×10-10, 2.5×10-8和2.5×10-6 mol/L)的睾酮素吸附分段进行线性拟合，得到拟合线性方程分别为y=19.69+1.21x(R2=0.9913)和y=11.5+0.45x(R2=0.9895)。根据直线斜率和截距可以得出在低浓度和高浓度两种结合位点的解离平衡常数分别为0.83和2.22 mol/L，表观最大吸附产生的光强反射率变化分别为16.3%和32.2%。实验测得传感器对乙腈中睾酮素的检出限为2.5×10-16 mol/L(信噪比S/N=3)。对比其它基于分子印迹聚合物检测溶液中睾酮素的方法：如电阻抗滴定法，固相萃取高效液相色谱法和竞争免疫法，其检出限分别为3.8×10-8 mol/L[20]，1.7×10-8mol/L[21]，4.3×10-9 mol/L[22]，实验中的SPR传感器检测睾酮的灵敏度提高了7个数量级。作为对比实验，用NIF进行吸附测试(图 6B)，吸附1.0×10-6 mol/L睾酮素溶液后，光强反射率上升0.6%，此响应信号是由分子和聚合物矩阵之间的非特异性吸附引起的，其数值远低于MIF吸附等浓度睾酮素引起的光强变化值4.1%(图 7)，说明NIF不存在特异吸附睾酮素的识别位点。
为了表征睾酮素分子印迹膜的选择性，对睾酮素类似似物如雌二醇、雌三醇和黄体酮(2.5×10-6 mol/L)的溶液进行了吸附实验，结果如图 7所示，尽管3种类似物的分子结构与睾酮素只有微小差异(图 8)，但是MIF对它们的选择性吸附差异却很明显。吸附同一浓度的雌二醇、雌三醇和黄体酮后，光强反射率分别增加1.3%, 0.8%和0.5%，与专一性结合睾酮素引起的光强反射率变化4.1%相比，分别低了3倍、5倍和8倍。睾酮素分子印迹膜具有较好的选择性，印迹聚合物内部的识别位点在结构、形状、大小及功能上都与模板分子相匹配，因此对模板分子有很强的专一识别性。
为了检测此SPR传感器的重复利用性，用乙腈-乙酸(9:1, V/V)再生液和2.5×10-12 mol/L睾酮素样品溶液对MIF进行了多次洗脱-重吸附实验，结果如图 9所示，经过5次洗脱吸附实验后，洗脱和吸附的共振角的变化值降低均较小，相对标准偏差分别为16.8%和11.2%，说明本实验合成的睾酮素分子印迹膜可以多次循环使用。
将睾酮素溶于人工尿液中，配制成浓度为2.5×10-6 mol/L的标准溶液，再用乙腈逐级稀释至2.5×10-8 , 2.5×10-10和2.5×10-12 mol/L，进行吸附测试，结果如表 1所示，所测样品的回收率为85.2%~92.8%，表明此传感器能够应用于实际样品中睾酮素的检测。
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| 加标浓度 Added (mol/L) | 检测浓度 Found (mol/L) | 回收率 Recovery (%) | 相对标准偏差 RSD (%，n=5) |
| 2.50×10-8 | 2.13×10-8 | 85.2 | 9.5 |
| 2.50×10-10 | 2.27×10-10 | 90.8 | 7.8 |
| 2.50×10-12 | 2.32×10-12 | 92.8 | 8.4 |
基于引发转移终止剂的表面接枝方法在SPR芯片表面合成了睾酮素分子印迹膜，利用在目标共振角处现场监测MIF的制备过程，提高了对印迹膜厚度的可控性。通过对MIF的表面形态和化学组分的研究，表明该方法可以成功用于分子印迹SPR传感器的制备。通过吸附实验结果证明，该膜对睾酮素分子具有超高的检测灵敏度，检出限低至2.5×10-16 mol/L。2.5×10-6 mol/L的雌二醇、雌三醇和黄体酮溶液在睾酮素MIF上吸附很小，说明此传感器芯片具有良好的选择性。在5次洗脱-吸附循环实验中，SPR共振角减少量较小，证明此印迹膜的稳定性较好，可重复利用多次。本方法操作简单，且能实现快速、灵敏和无标记地检测目标分子，有望在分子印迹SPR传感器领域发挥重要作用。
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Figure 1 Scheme of experimental setup for surface plasmon resonance (SPR) sensor, and the preparation principle of testosterone moleculary imprinted film (MIF)
Figure 2 SPR angular reflectivity spectra for gold-coated sensor chips in acetonitrile grafted with estradiol-imprinted films of increasing thickness: (a) 0 nm, (b) 20 nm, (c) 40 nm, (d) 60 nm, (e) 80 nm, (f) 100 nm. Inset was the fitted measured real-time kinetics when the monitoring angle was fitted at 71°
Figure 3 (A) SPR angular reflectivity spectra for SPR sensor chip before and after grafting testosterone-imprinted film; (B) Real-time polymerization kinetics at the target resonant angle of 71°
Figure 4 Polarization modulation infrared reflection absorption spectroscopy (PM-IRRAS) for testosterone-imprinted film
Figure 5 Atomic force microscopy (AFM) of (A) self-assembled monolayer (SAM)-modified SPR chip; (B) the height and width of the underlined part in (A); (C) MIF-modified SPR chip; and (D) the height and width of the underlined part in (C)
Figure 6 (A) SPR angular reflectivity spectra after rebinding of testosterone at a series of increasing concentrations. Inset is the magnification of couple angles region; (B) Time-dependent SPR reflectivity changes of MIF and non-imprinted film (NIF) due to rebinding of testosterone; (C) Linearity between reflectivity changes and testosterone concentrations.
Figure 7 Time-dependent SPR reflectivity changes of MIF due to rebinding of 2.5×10-6 mol/L target molecules
Table 1. Recovery of testosterone in artificial urine samples
| 加标浓度 Added (mol/L) | 检测浓度 Found (mol/L) | 回收率 Recovery (%) | 相对标准偏差 RSD (%，n=5) |
| 2.50×10-8 | 2.13×10-8 | 85.2 | 9.5 |
| 2.50×10-10 | 2.27×10-10 | 90.8 | 7.8 |
| 2.50×10-12 | 2.32×10-12 | 92.8 | 8.4 |
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