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• 1.   引言

  喷施化学农药是控制植物病虫害最有效的手段之一，广泛用于农作物病虫害的预防和防治中，但是容易残留危害。目前常用农药中至少30%是具有手性结构的药物，大部分是以外消旋体的形式使用^[1]。手性农药对映体之间化学性质极相似，但对人体毒性不同，在不同的有机或无机环境下会有不同的立体选择性。因此手性农药对映体的分离和残留分析越来越引起研究者的重视^[2]。

  氟环唑(Epoxiconazole，C₁₇H₁₃ClFN₃O，CAS No.106325-08-0)是一种广谱性三唑类杀菌剂，其分子结构中含两个手性中心，存在两对、4个立体手性异构体，目前商品化的氟环唑是由其中两个对映异构体(2R, 3S-和2S, 3R-构型)组成的顺式-氟环唑^[3]，作为C-14脱甲基化酶抑制剂抑制甾醇生物合成，用于防治水稻、蔬菜、葡萄、苹果和茶叶等作物病害。文献报道的对水果、茶叶中氟环唑残留分析研究主要集中在其外消旋体的分析，多采用液相色谱法^[4]、液相色谱-质谱法^[5]和气相色谱-质谱法^[6]等，而采用液相色谱-质谱联用法对其手性异构体的残留分析的研究不多^[7~9]。在本研究组前期工作中^[9]，采用手性色谱柱结合高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱，建立了茶叶中氟环唑手性对映体残留分析方法，但仍未见到采用合相色谱技术结合四极杆飞行时间质谱用于手性农药对映体残留分析的报道。

  合相色谱技术(Convergence chromatography)是基于超临界流体色谱的原理，以超临界CO₂为主要流动相，辅以一定比例的有机溶剂作为改性剂，在色谱柱中依靠流动相的溶剂化能力来进行分离、分析的色谱技术^[10]。合相色谱分析条件温和，不受样品挥发性的限制，其固定相可采用现有的正相、反相固定相材料，既可分析不适宜气相色谱分析的高沸点、低挥发性样品，又能对普通液相色谱难分离的结构类似物^[11~13]、手性化合物^[14]等进行分离分析。四极杆-飞行时间质谱(Q-TOF/MS)能提供高分辨率精确质荷比离子用于化合物定性定量分析；同时利用串联质谱功能进行二级质谱裂解，可获得大量高分辨质谱碎片离子信息，用于进一步的结构确证和定量分析^[15]。

  本研究采用乙腈提取，固相萃取柱净化苹果、葡萄和茶叶样品，利用超高效合相色谱(Ultra performance convergence chromatography, UPC²)结合手性色谱柱对顺式-氟环唑对映体进行拆分分析，四极杆-飞行时间质谱(Q-TOFMS)技术提取精确质荷比离子进行定量分析，二级质谱碎片辅助定性分析，建立了苹果、葡萄和红茶中顺式-氟环唑残留分析方法。本方法准确、可靠，能够满足农药残留分析的要求^[16]。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  超高效合相色谱-四极杆串联飞行时间质谱联用仪(UPC²-QTOF/MS)：配以实时质量校正的电喷雾离子源(ESI)、ACQUITY UPC_TM²二元溶剂管理器、ACQUITY UPC_TM²自动进样器、ACQUITY柱管理器、ACQUITY UPC_TM²融合管理器、Waters 515辅助泵、MassLynx 4.1质谱工作站(美国Waters公司)；高速离心机(德国Sigma公司)；电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；R-210旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；T-18高速均质匀浆器(德国IKA公司)；DFT-200手提式高速万能粉碎机(浙江温岭市林大机械有限公司)；Vortex Genie2型涡旋振荡器(美国Scientific-Industries公司)；固相萃取装置、50 mL离心管、0.22μm Filter Unit滤膜、Cleanert TPT固相萃取柱(2000 mg/12 mL)、Cleanert Pesti-Carb固相萃取柱(500 mg/6 mL, 天津博纳艾杰尔科技有限公司)。

  乙腈、甲醇、异丙醇(色谱纯，美国霍尼韦尔公司)；甲酸、甲酸铵、乙酸铵(色谱纯，德国CNW科技有限公司)；无水Na₂SO₄、NaCl(分析纯，上海市四赫维化工有限公司)；实验用水为纯净水(杭州娃哈哈有限公司)。顺式-氟环唑标准品(98%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)。

  苹果、葡萄空白样品购于市场，经检测不含顺式-氟环唑残留。红茶空白样品：由茶叶研究所未施药茶园采集鲜叶，制成红茶获得。

  2.2.   实验方法

  2.2.1.   苹果与葡萄样品的预处理

  (1) 提取将新鲜的苹果、葡萄果肉和果皮分离后，分别用粉碎机粉碎。称取磨碎后的样品10.0 g于50 mL离心管中，加入5 mL纯净水，旋涡1 min使样品充分润湿，静置30 min，再加入20 mL乙腈，均质2 min后静置过夜，加入5 g NaCl振荡涡旋混匀后，超声波处理10 min，5000 r/min离心5 min，取乙腈层10 mL至圆底烧瓶，45℃真空旋转浓缩近干，加入5 mL乙腈超声溶解待净化。

  (2) 净化在Cleanert Pesti-Carb固相萃取柱(500 mg/6 mL)上加入约2 cm高无水Na₂SO₄，依次用5 mL乙腈-苯(3：1, V/V)和乙腈预淋洗，待液面降到Na₂SO₄顶部时，将样品提取液转移至柱上，弃去流出液，用5 mL乙腈洗涤圆底烧瓶并转移至净化柱上，弃去流出液，再加入乙腈-苯(3：1, V/V)洗脱，接收20 mL于鸡心瓶中，45℃水浴中旋转浓缩近干，N₂吹干后，加入1.0 mL乙腈溶解定容，过0.22μm滤膜至进样瓶，UPC²-QTOF/MS进样，基质外标法定量分析。

  2.2.2.   茶叶样品的预处理

  (1) 提取称取粉碎后的红茶样品5.0 g于50 mL离心管中，加入10 mL纯净水，振荡旋涡1 min使样品充分润湿，静置30 min，再加入20 mL乙腈，均质2 min后静置过夜，加入5 g NaCl振荡涡旋混匀后，超声10 min，5000 r/min离心5 min，取乙腈层10 mL至圆底烧瓶，45℃真空旋转浓缩近干，加入5 mL乙腈超声溶解，待净化。(2) 净化在Cleanert TPT固相萃取柱(2000 mg/12 mL)上加入约2 cm高无水Na₂SO₄，依次用5 mL乙腈-苯(3：1, V/V)和乙腈预淋洗，待液面降到Na₂SO₄顶部时，将样品提取液转移至柱上，弃去流出液，再用5 mL乙腈洗涤圆底烧瓶并转移至净化柱上，弃去流出液，再加入乙腈-苯(3：1, V/V)洗脱，接收20 mL于鸡心瓶中，45℃水浴中旋转浓缩近干，N₂吹干后，加入1.0 mL乙腈溶解定容，过0.22μm滤膜至进样瓶，UPC²-QTOF/MS进样，基质外标法定量分析。

  2.3.   色谱-质谱条件

  色谱条件：Chromega Chrial CCA柱(150 mm×4.6 mm，5μm, 美国ES industries公司)；柱温30℃：进样量5μL；样品盘温度10℃；流动相为CO₂/异丙醇(95：5, V/V)，等度洗脱30 min；背压13.79 MPa；流速2.0 mL/min。

  质谱条件：ESI⁺-QTOF/MS全扫描模式，质量扫描范围m/z 150~600，采集速率2 spectra/s，提取顺式-氟环唑准分子离子峰[M+H]⁺ m/z 330.0804±15进行定量，MS/MS模式提取子离子m/z 121.0445和141.0094辅助定性分析；实施校准参比离子m/z 556.2771；毛细管喷雾电压3 kV；锥孔电压40 V；源补偿电压80 V；源温度120℃；脱溶剂化温度350℃；锥孔气N₂，流速50 L/h；雾化气N₂，流速600 L/h；离子化辅助溶剂：2 mmol/L甲酸铵的甲醇-水(1：1, V/V)溶液，流量0.20 mL/min。

  标准曲线的绘制:称取0.010 g顺式-氟环唑标准品，用乙腈溶解并定容至50 mL，得200 mg/L储备液(对应其对映单体的浓度为100 mg/L)，-20℃存放。用乙腈稀释，配制成对映单体浓度为1.0, 0.5, 0.25, 0.1, 0.05, 0.025和0.01 mg/L的系列溶液，用经过提取的空白基质溶液配制相应浓度梯度的5种基质标准溶液，采用UPC²-QTOF/MS进样，进样量5μL，每个样品进样3次，以顺式-氟环唑对映体浓度为横坐标(x)，3次进样提取离子峰面积平均值为纵坐标(y)进行拟合，获得顺式-氟环唑对映体的溶剂和基质标准曲线方程。

  2.4.   实际样品加标回收实验

  在不含顺式-氟环唑的空白苹果肉、苹果皮、葡萄肉、葡萄皮和红茶样品中，分别添加0.25、0.05和0.005 mg/kg(红茶为0.50, 0.10和0.01 mg/kg)3个水平的标准溶液，涡旋混匀，静置2 h。加标样品按照2.2节方法处理，每个水平重复测定6次。同时配制相应浓度的基质标准溶液，采用基质外标法定量分析。

  3.   结果与讨论

  3.1.   色谱条件优化

  采用Chromega Chrial CCA柱，对色谱条件进行了优化。

  3.2.   提取和净化方法的优化

  氟环唑用于防治病害时，一般兑水茎叶喷雾施药，通过茎叶残留可传输到植物可食用部分。本研究选择的苹果、葡萄为削皮或剥皮食用果实，茶叶为食用加工后的叶片，苹果、葡萄含水量大、糖分高，茶叶含水量少、但含大量咖啡碱、茶氨酸和色素等，分别代表不同的基质类型。食用苹果和葡萄时，一般进行去皮处理，且由于农药施用、果实采摘、运输等过程会导致农药在果皮和果肉中的残留水平不同，因此本研究对苹果和葡萄进行皮、肉分离分别分析，研究不同基质中的农药残留分析方法。红茶基质比苹果、葡萄更为复杂，因此本研究以红茶为基质代表，对比了国家标准方法^[21]和QuEChERS方法^[22]，结果表明，QuEChERS方法的回收率稍高于国标方法，但是实验中发现QuEChERS方法的浓缩倍数低，对于低浓度样品无法检测出。因此选择在国标方法的基础上，对前处理方法进行改进，以保证获得更好的回收率。

  3.3.   标准曲线、相关系数与基质效应

  将对映单体系列标准溶液和5种基质标准溶液，在UPC²-QTOF/MS上进样，重复测定3次，以顺式-氟环唑对映体浓度为横坐标(x)，3次进样提取离子峰平均面积为纵坐标(y)，进行曲线拟合，获得顺式-氟环唑对映体的标准溶液、基质标准曲线方程和相关系数见表 2。结果表明，在0.01~1.0 mg/L浓度范围内，对映体的检测均满足线性关系，相关系数大于0.99，检出限为0.001 mg/L(S/N=3)。

  表 2

  

  表 2  顺式-氟环唑对映体在不同基质中的标准线性范围、线性方程、相关系数和基质效应

  Table 2.  Linear ranges, regression equations, correlation coefficients(r), and matrix effects for cis-epoxiconazole enantiomers in different matrices

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  化合物Compound	基质Matrix	线性范围Linear range(mg/L)	回归方程Regression equation	相关系数Correlation coefficient(r)	基质效应Matrix effect
  顺式-氟环唑1cis-epoxiconazole 1	乙腈Acetonitrile	0.01~1.00	y＝141031x-8075.4	0.9963
  	苹果肉Apple pulp	0.01~1.00	y＝129156x-3216.6	0.9980	0.9
  	苹果皮Apple skin	0.01~1.00	y＝168128x-5985.6	0.9947	1.2
  	葡萄肉Grape pulp	0.01~1.00	y＝216511x-6508.9	0.9989	1.5
  	葡萄皮Grape skin	0.01~1.00	y＝91699x-1122.9	0.9967	0.7
  	红茶Black tea	0.01~1.00	y＝66344x-874.52	0.9984	0.5
  顺式-氟环唑2cis-epoxiconazole 2	乙腈Acetonitrile	0.01~1.00	y＝136905x-7870.6	0.9954
  	苹果肉Apple pulp	0.01~1.00	y＝114611x-2715.3	0.9977	0.8
  	苹果皮Apple skin	0.01~1.00	y＝153172x-5373.9	0.9945	1.1
  	葡萄肉Grape pulp	0.01~1.00	y＝223130x-7642.3	0.9981	1.6
  	葡萄皮Grape skin	0.01~1.00	y＝89380x-1137.2	0.9947	0.7
  	红茶Black tea	0.01~1.00	y＝69522x-814.25	0.9993	0.5

  以顺式-氟环唑对映体在基质中的线性方程斜率与其在乙腈中的线性方程斜率的比值来考察基质效应，结果表明：苹果皮、葡萄肉中表现出较强的基质增强效应，而在苹果肉、葡萄皮中略显基质减弱效应，红茶中的基质减弱效应明显。

  3.4.   加标回收率、相对标准偏差与定量限

  在称取的不含顺式-氟环唑的空白苹果肉、苹果皮、葡萄肉、葡萄皮和红茶样品中，分别加入0.25, 0.05和0.005 mg/kg(红茶中是0.50 mg/kg, 0.10 mg/kg和0.01 mg/kg)的标准品，静置2 h。加标样品按照2.2节方法处理，每个水平重复测定6次。同时配制相应浓度的基质标准溶液，基质外标法定量分析，实验结果见表 3。苹果和葡萄中顺式-氟环唑手性对映体平均回收率(n＝6)为67.9%~92.8%，相对标准偏差(RSD)小于10%，方法定量限为0.005 mg/kg(S/N=10)；茶叶中顺式-氟环唑手性对映体平均回收率(n＝6)为74.1%~84.0%，RSD小于8%，方法定量限为0.01 mg/kg(S/N=10)。能够满足残留分析的需要^[16]。葡萄皮空白样品、基质标准样品和添加浓度样品的典型提取离子色谱图见图 5。

  表 3

  

  表 3  不同基质中顺式-氟环唑对映体的加标回收率、相对标准偏差与定量限

  Table 3.  Average recoveries, relative standard deviation(RSD) and limits of quantitation(LOQ) for cis-epoxiconazole enantiomers at different matrices in different spiked levels

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  化合物Compound	基质Matrix	添加水平Spiked levels (mg/kg)	回收率Recoveries (%, n=6)	相对标准偏差RSD (%, n=6)	定量限LOQ (mg/kg)
  		0.005	78.2±6.0	7.6
  	苹果肉Apple pulp	0.025	76.4±3.0	3.9	0.005
  		0.25	90.6±3.0	3.3
  		0.005	77.4±4.4	5.7
  	苹果皮Apple skin	0.025	74.4±2.7	3.6	0.005
  		0.25	91.2±4.7	5.1
  		0.005	75.9±1.6	2.1
  顺式-氟环唑1 cis-Epoxico-nazole 1	葡萄肉Grape pulp	0.025	75.8±3.2	4.2	0.005
  		0.25	84.2±4.1	4.9
  		0.005	67.9±6.2	9.1
  	葡萄皮Grape skin	0.025	92.3±7.9	8.6	0.005
  		0.25	85.2±6.3	7.4
  		0.01	76.3±2.6	3.4
  	红茶Black tea	0.05	81.0±5.0	6.1	0.01
  		0.5	82.8±4.4	5.3
  		0.005	79.4±5.6	7.1
  	苹果肉pple pulp	0.025	87.3±4.6	5.3	0.005
  		0.25	92.3±4.4	4.8
  		0.005	74.8±4.6	6.1
  	苹果皮Apple skin	0.025	72.3±7.1	9.8	0.005
  		0.25	91.2±4.2	4.7
  		0.005	75.9±2.4	3.2
  顺式-氟环唑2 cis-Epoxico nazole 2	葡萄肉Grape pulp	0.025	81.3±3.1	3.8	0.005
  		0.25	86.0±4.9	5.7
  		0.005	76.6±3.4	4.4
  	葡萄皮Grape skin	0.025	92.8±5.1	5.5	0.005
  		0.25	84.3±8.3	9.8
  		0.01	74.1±3.6	4.8
  	红茶Black tea	0.05	83.4±6.6	7.9	0.01
  		0.5	84.0±3.8	4.5

  图 5

  

  图 5  葡萄皮空白样品(A)、基质标准样品(B)和对应添加浓度样品(C)提取离子色谱图

  Figure 5.  Chromatograms of the blank sample(A), matrix standard sample(B), and spiked level sample(C) of cis-epoxiconazole enantiomers in grape skin

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  3.5.   方法的应用

  采用本方法检测市售苹果、葡萄及红茶样品各20份，均未检出顺式-氟环唑对映体残留。

  3.1.3.   动态背压的优化

  在4%异丙醇、柱温25℃、流速2 mL/min的条件下，考察了不同动态背压(10.34~31.03 MPa)对顺式-氟环唑对映体分离的影响。结果如图 3A所示，随着动态背压升高，系统柱压升高，对映体保留时间缩短，容量因子降低，分离因子α总体稍呈降低趋势，对映体分离度R由6.67降到5.15。综合考虑，最终确定动态背压为13.79 MPa。

  图 3

  

  图 3  不同动态背压(A)和柱温(B)对顺式-氟环唑对映体的分离因子和分离度的影响

  Figure 3.  Influence of separation factor (α) and resolution (R) on cis-epoxiconazole enantiomers under different automated backpressure regulator (ABPR) (A) and column temperature (B)

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  3.1.5.   辅助溶剂的选择

  在合相色谱中，流动相主要是惰性CO₂，引入质谱离子源时，质谱离子化效率低响应差。因此需要在柱后进行分流，加入离子化辅助溶剂促进化合物的离子化程度，提高质谱响应。在4%异丙醇、柱温30℃、背压13.79 MPa、流速2 mL/min的条件下，对比研究了0.20 mL/min不同辅助溶剂下，1 mg/L顺式-氟环唑对映体溶剂标准的质谱响应。结果表明，顺式-氟环唑在质谱中几乎没有[M+Na]⁺离子出现，这与我们前期研究结果^[9]一致，主要产生[M+H]⁺离子，不同辅助溶剂下的离子响应信号结果见图 4，含2 mmol/L甲酸铵的甲醇-水(1：1, V/V)作为辅助溶剂时，[M+H]⁺离子的响应高于其它辅助溶剂，这可能是在甲醇、水都存在的条件下，容易发生电解(CH₃OH+H₂O→CO₂+6H⁺)^[17]，产生更多的H^{+[18, 19]}，从而提高了顺式-氟环唑的离子化效率，并通过竞争效应抑制了[M+Na]⁺的产生^[20]。最终选择含2 mmol/L甲酸铵的甲醇-水(1：1, V/V)作为辅助溶剂。

  图 4

  

  图 4  不同辅助溶剂下顺式-氟环唑对映体的质谱离子[M+H]⁺响应

  Figure 4.  Responses of ion [M+H]⁺ for cis-epoxiconazole enantiomers using different assisted solvent

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  综合上述结果，选择最优色谱条件为：使用CCA柱，流动相为CO₂-异丙醇(95：5, V/V)，流速2.0 mL/min，动态背压13.79 MPa，柱温30℃，辅助溶剂为含2 mmol/L甲酸铵的甲醇-水(1：1, V/V)，在此条件下，顺式-氟环唑对映体的保留时间分别为18.5和22.5 min，分离度为7.1，可以满足分析要求。

  3.1.1.   流动相改性剂的选择

  采用UPC²分析时，以超临界CO₂流体为流动相，加入改性剂可以改变其对手性化合物的不同对映体之间的洗脱能力，改善拆分效果。本实验分别以乙腈、甲醇和异丙醇作为改性剂，在流量2.0 mL/min，背压17.24 MPa和柱温25℃条件下，比较不同比例(20%，15%，10%，5%，3%，0%)改性剂对顺式-氟环唑手性对映体的分离效果的影响。结果表明，以乙腈为改性剂，均无法拆分顺式-氟环唑对映体；以不同比例甲醇为改性剂，拆分效果见图 1A，其中甲醇为10%时，顺式-氟环唑两个对映体保留时间为3.95 min和4.63 min，峰形良好，分离度为1.98，达到基线分离；以不同比例异丙醇为改性剂，拆分效果见图 1B，其中异丙醇为5%时，保留时间分别为16.98 min和27.14 min，分离度为7.20，达到完全分离。考虑实际样品分析，为减少基质干扰，最终选择异丙醇作为改性剂。

  图 1

  

  图 1  不同比例流动相改性剂甲醇(A)和异丙醇(B)条件下顺式-氟环唑对映体在Chrial CCA柱上的色谱分离图

  Figure 1.  Chromatograms of cis-epoxiconazole enantiomers on Chrial CCA column with different compositions of methanol (A) and isopropanol (B) as mobile phase modifier

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  3.1.2.   流速对分离的影响

  在4%异丙醇、柱温25℃、背压17.24 MPa的条件下，比较了不同流速(1.6~3.2 mL/min)对分离的影响及出峰时间。结果(表 1和图 2)表明，流速越低，保留时间延长，峰型会展宽，分离度增大、柱压降低。为了使对映体得到很好的分离，同时保证合适的色谱柱压力，最终选择流速2 mL/min。

  表 1

  

  表 1  UPC²不同流速下顺式-氟环唑对映体的保留时间t、容量因子k、分离因子α和分离度R

  Table 1.  Retention time (t), capacity factor (k), separation factor (α) and resolution (R) of cis-epoxiconazole enantiomers at different flow rates in ultra performance convergence chromatography (UPC²)

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  流速Flow rate(mL/min)	保留时间1Retention time 1(t1)(min)	保留时间2Retention time 2(t2)(min)	容量因子1Capacity factor 1(k1)	容量因子2Capacity factor 2(k2)	分离因子Separation factor (α)	分离度Resolution(R)
  3.2	13.33	19.40	12.74	19.00	1.49	5.22
  2.8	15.68	22.78	15.16	22.48	1.48	5.33
  2.4	18.64	27.09	18.22	26.93	1.48	5.67
  2.0	22.87	33.68	22.58	33.72	1.49	5.78
  1.6	29.31	42.86	29.22	43.19	1.48	6.06

  图 2

  

  图 2  流动相流速对顺式-氟环唑对映体的分离因子和分离度的影响

  Figure 2.  Influence of different flow rates of the mobile phase on separation factor (α) and resolution (R) for cis-epoxiconazole enantiomer

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  3.1.4.   色谱柱温的选择

  根据热动力学原理，色谱柱温度对化合物保留时间和分离影响很大。在4%异丙醇、背压13.79 MPa、流速2 mL/min的条件下，考察了不同柱温(15~50℃)对拆分效果的影响。结果(图 3)表明，随着柱温升高，对映体保留时间延长，容量因子增加，分离因子α和分离度R在25℃、30℃达到最佳(α=1.68，R=8.32)。这是因为合相色谱以超临界CO₂为主要流动相，柱温越高，超临界流体CO₂密度减小，其溶剂化能力降低，从而使化合物保留时间增长。故本实验选择30℃为最佳分离柱温。

  3.2.1.   提取方法优化

  根据文献报道^[23]，茶叶中所含的农药进行提取时，加水润湿茶叶与不加水对茶叶中农药提取效果有差别，对于弱极性农药影响小，而对强极性农药影响显著^{[24, 25]}。

  本研究分别对乙腈、乙腈-水(1：1, V/V)提取浓缩后的样品，采用5 mL不同溶液(水、乙腈-水(1：1, V/V)、乙腈、乙腈-苯(3：1, V/V))超声溶解残余物上样结果表明，乙腈中加水提取能泡开茶叶样品，有利于实际样品中农药提取，而上样时乙腈中加水又会增加提取后的水溶性杂质被溶解下来并上样至净化柱中的比例，增加后续净化难度，导致回收率降低。综合考虑，最后选择采用乙腈-水提取茶叶，浓缩后用乙腈溶解上样。

  3.2.2.   净化方法优化

  在TPT柱上，上样标准溶液，分别采用20 mL乙腈、乙腈-苯(3：1, V/V)进行洗脱，每2 mL分段接收，测定每段回收率。结果表明：采用乙腈洗脱时，仅有6.5%顺式-氟环唑被洗脱；而采用乙腈-苯(3：1, V/V)，顺式-氟环唑在前6 mL的回收率仅有1.2%，其后每段的回收率依次为11.6%, 35.7%, 37.6%, 17.3%, 8.9%和3.6%，主要集中在6~18 mL被洗脱下来。因此选择乙腈为上样和淋洗液，先洗脱下来一部分杂质，随后采用乙腈-苯(3：1, V/V)洗脱接收20 mL，以确保回收率。葡萄和苹果基质较茶叶简单，采用Pesti-Carb固相萃取柱(500 g/6 mL)即可满足净化要求。

  4.   结论

  通过乙腈-水混合溶液提取，利用Chromega Chrial CCA色谱柱，采用超高效合相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPC²-QTOF/MS)对顺式-氟环唑对映体定性与定量拆分分析，实现了红茶、苹果、葡萄中顺式-氟环唑对映体的合相色谱质谱残留分析。本方法结果稳定可靠，能够满足残留分析的需要，可用于实际样品的检测。

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  Figure 1  Chromatograms of cis-epoxiconazole enantiomers on Chrial CCA column with different compositions of methanol (A) and isopropanol (B) as mobile phase modifier

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  Figure 2  Influence of different flow rates of the mobile phase on separation factor (α) and resolution (R) for cis-epoxiconazole enantiomer

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  Figure 3  Influence of separation factor (α) and resolution (R) on cis-epoxiconazole enantiomers under different automated backpressure regulator (ABPR) (A) and column temperature (B)

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  Figure 4  Responses of ion [M+H]⁺ for cis-epoxiconazole enantiomers using different assisted solvent

  A-1 to A-4: acetonitrile containing 1%, 0.5%, 0.2% and 0.1% formic acid, respectively; B-1 to A-6: methanol containning 0%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% and 0.1% formic acid, respectively; C-1 to C-3: methanol containing 10 mmol/L, 5 mmol/L and 2 mmol/L ammonium acetate, respectively; D-1 to D-4: methanol containing 10 mmol/L, 5 mmol/L and 2 mmol/L ammonium formate, respectively; E-1 to E-3: methanol/water (1∶1, V/V) containing 10 mmol/L, 5 mmol/L and 2 mmol/L ammonium acetate, respectively; F-1 to F-3: methanol/water (1∶1, V/V) containing 10 mmol/L, 5 mmol/L and 2 mmol/L ammonium formate, respectively.

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  Figure 5  Chromatograms of the blank sample(A), matrix standard sample(B), and spiked level sample(C) of cis-epoxiconazole enantiomers in grape skin

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  Table 1.  Retention time (t), capacity factor (k), separation factor (α) and resolution (R) of cis-epoxiconazole enantiomers at different flow rates in ultra performance convergence chromatography (UPC²)

  流速Flow rate(mL/min)	保留时间1Retention time 1(t1)(min)	保留时间2Retention time 2(t2)(min)	容量因子1Capacity factor 1(k1)	容量因子2Capacity factor 2(k2)	分离因子Separation factor (α)	分离度Resolution(R)
  3.2	13.33	19.40	12.74	19.00	1.49	5.22
  2.8	15.68	22.78	15.16	22.48	1.48	5.33
  2.4	18.64	27.09	18.22	26.93	1.48	5.67
  2.0	22.87	33.68	22.58	33.72	1.49	5.78
  1.6	29.31	42.86	29.22	43.19	1.48	6.06

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  Table 2.  Linear ranges, regression equations, correlation coefficients(r), and matrix effects for cis-epoxiconazole enantiomers in different matrices

  化合物Compound	基质Matrix	线性范围Linear range(mg/L)	回归方程Regression equation	相关系数Correlation coefficient(r)	基质效应Matrix effect
  顺式-氟环唑1cis-epoxiconazole 1	乙腈Acetonitrile	0.01~1.00	y＝141031x-8075.4	0.9963
  	苹果肉Apple pulp	0.01~1.00	y＝129156x-3216.6	0.9980	0.9
  	苹果皮Apple skin	0.01~1.00	y＝168128x-5985.6	0.9947	1.2
  	葡萄肉Grape pulp	0.01~1.00	y＝216511x-6508.9	0.9989	1.5
  	葡萄皮Grape skin	0.01~1.00	y＝91699x-1122.9	0.9967	0.7
  	红茶Black tea	0.01~1.00	y＝66344x-874.52	0.9984	0.5
  顺式-氟环唑2cis-epoxiconazole 2	乙腈Acetonitrile	0.01~1.00	y＝136905x-7870.6	0.9954
  	苹果肉Apple pulp	0.01~1.00	y＝114611x-2715.3	0.9977	0.8
  	苹果皮Apple skin	0.01~1.00	y＝153172x-5373.9	0.9945	1.1
  	葡萄肉Grape pulp	0.01~1.00	y＝223130x-7642.3	0.9981	1.6
  	葡萄皮Grape skin	0.01~1.00	y＝89380x-1137.2	0.9947	0.7
  	红茶Black tea	0.01~1.00	y＝69522x-814.25	0.9993	0.5

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  Table 3.  Average recoveries, relative standard deviation(RSD) and limits of quantitation(LOQ) for cis-epoxiconazole enantiomers at different matrices in different spiked levels

  化合物Compound	基质Matrix	添加水平Spiked levels (mg/kg)	回收率Recoveries (%, n=6)	相对标准偏差RSD (%, n=6)	定量限LOQ (mg/kg)
  		0.005	78.2±6.0	7.6
  	苹果肉Apple pulp	0.025	76.4±3.0	3.9	0.005
  		0.25	90.6±3.0	3.3
  		0.005	77.4±4.4	5.7
  	苹果皮Apple skin	0.025	74.4±2.7	3.6	0.005
  		0.25	91.2±4.7	5.1
  		0.005	75.9±1.6	2.1
  顺式-氟环唑1 cis-Epoxico-nazole 1	葡萄肉Grape pulp	0.025	75.8±3.2	4.2	0.005
  		0.25	84.2±4.1	4.9
  		0.005	67.9±6.2	9.1
  	葡萄皮Grape skin	0.025	92.3±7.9	8.6	0.005
  		0.25	85.2±6.3	7.4
  		0.01	76.3±2.6	3.4
  	红茶Black tea	0.05	81.0±5.0	6.1	0.01
  		0.5	82.8±4.4	5.3
  		0.005	79.4±5.6	7.1
  	苹果肉pple pulp	0.025	87.3±4.6	5.3	0.005
  		0.25	92.3±4.4	4.8
  		0.005	74.8±4.6	6.1
  	苹果皮Apple skin	0.025	72.3±7.1	9.8	0.005
  		0.25	91.2±4.2	4.7
  		0.005	75.9±2.4	3.2
  顺式-氟环唑2 cis-Epoxico nazole 2	葡萄肉Grape pulp	0.025	81.3±3.1	3.8	0.005
  		0.25	86.0±4.9	5.7
  		0.005	76.6±3.4	4.4
  	葡萄皮Grape skin	0.025	92.8±5.1	5.5	0.005
  		0.25	84.3±8.3	9.8
  		0.01	74.1±3.6	4.8
  	红茶Black tea	0.05	83.4±6.6	7.9	0.01
  		0.5	84.0±3.8	4.5

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