English

• 1.   引 言

  线粒体不仅是细胞的能量工厂^[1]，而且还是细胞内多种信号转导的调控中枢^[2]，如自噬、细胞凋亡、固有免疫等。许多人类疾病均与线粒体功能异常密切相关，包括神经退行性疾病、心肌病、癌症等^[3]。因此，线粒体的结构与功能研究对于疾病诊治以及基础科学研究具有重要意义^[4]，而荧光标记为线粒体的结构与功能研究提供了高灵敏、高特异性的实验方法^{[5, 6]}。目前，线粒体的荧光标记方法主要有特异性染料标记和蛋白标记。染料标记操作简单，而蛋白标记则需要借助转染技术。转染是指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程，包括瞬时转染和稳定转染，两者的区别在于外源DNA是否整合到宿主细胞的染色体中。瞬时转染操作相对简单, 实验周期短，但是蛋白表达不稳定，需要现转现用；稳定转染蛋白表达稳定，实验重现性好，但是外源基因整合几率小，筛选所需时间长。在线粒体的结构与功能研究中，线粒体荧光标记的荧光亮度、标记效率和标记稳定性等是评价标记方法的重要指标。

  根据细胞的功能和能量状态的不同，一个细胞内含有的线粒体的数目从几十个到数千个不等，能量需求越高的细胞含有的线粒体数目越多^[7]，且同一细胞中的线粒体在形态和功能上存在高度的异质性^{[8, 9]}。在细胞水平对线粒体的荧光标记进行分析仅能获得细胞内所有线粒体平均的信息，却无法表征单个线粒体的荧光亮度、标记效率和标记稳定性等，因此，亟需高通量的单线粒体检测技术以揭示个体差异。但是线粒体形体微小、折射率低，传统的流式细胞仪难以对单个线粒体进行高灵敏的多参数检测^[10]。在本课题组的前期工作中，将瑞利散射和鞘流单分子荧光检测技术结合，发展了超高灵敏流式检测技术(High sensitivity flow cytometry, HSFCM)^[11~13]。采用雪崩光电二极管(APD)检测器，散射光通道可实现粒径为24 nm的二氧化硅纳米颗粒和粒径为7 nm的纳米金颗粒的单颗粒检测，荧光通道的检测灵敏度为3个Alexa Fluor 532分子^[14]。以光电倍增管(PMT)作为检测器，实现了单个线粒体的散射和双色荧光信号的同时检测^{[10, 15, 16]}。

  尽管线粒体的荧光标记已经被广泛应用于基础科学研究，目前尚没有一种合适的分析技术能够在单线粒体水平客观、准确地对线粒体荧光标记方法进行评估。基于HSFCM在单线粒体检测方面的高灵敏、高通量、多参数的优势，本研究应用实验室自行研制的超高灵敏流式检测装置，分别对质粒瞬时转染和稳定转染荧光蛋白标记、MitoTracker Green标记、以及SYTO 62线粒体DNA染色等线粒体标记方法进行评估。通过高通量的单线粒体分析，考察了不同线粒体标记方法的荧光亮度、标记效率和标记稳定性的差异，为线粒体标记方法的选择提供一种先进的分析手段。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  FACSAriaⅡ流式细胞仪(美国BD公司)；Nu-425-600E二级生物安全柜(NuAire公司)；3110系列水套CO₂培养箱(Thermo Fisher Scientific公司)；IX73型倒置荧光显微镜(Olympus公司)；杜恩斯组织匀浆器(Wheaton公司)；DMEM高糖培养基、双抗、Opti-MEM I Reduced Serum Medium(Opti-MEM)、G418(Gibco公司)；胎牛血清(PAN-Biotech公司)；pAcGFP1-Mito质粒(Clontech公司)；TransLipid HL Transfection Reagent(TransLipid HL，北京全式金公司)；Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells(Thermo Fisher Scientific公司)；SYTO 62、MitoTracker(Molecular Probes公司)；其它试剂购自上海国药集团或上海生工公司；实验用水为Millipore系统纯化的超纯水(18.2 MΩcm)。线粒体呼吸缓冲液(Mitochondrial Buffer, MTB)：250 mmol/L蔗糖，10 mmol/L HEPES，4.2 mmol/L琥珀酸钠，1 mmol/L KH₂PO₄，1 mmol/L EGTA，pH 7.0；过0.22μm滤膜，4℃保存。

  2.2.   细胞培养

  人宫颈癌细胞株HeLa细胞(美国ATCC)的培养使用含1%双抗和10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，细胞转染后使用含10%胎牛血清且无双抗的DMEM高糖培养基。将细胞置于含5% CO₂的37℃恒温培养箱进行培养，细胞达到汇合状态时，用0.25%胰酶消化传代。

  2.3.   瞬时转染和稳定转染

  HeLa细胞传代24 h后，将培养基更换为Opti-MEM。用Opti-MEM分别稀释pAcGFP1-Mito和TransLipid HL，轻柔混合后加入细胞中，转染4～6 h后更换培养基，培养24 h。瞬时转染细胞传代24 h后，加入500μg/mL G418筛选10天，更换为250μg/mL G418，使稳定转染细胞增殖至肉眼可见的细胞团簇。用0.25%胰酶消化后，吸取细胞团簇至新的培养板培养，用流式细胞仪检测其纯度。

  2.4.   流式细胞仪检测和荧光显微镜成像

  待测细胞用PBS稀释至10⁵~10⁶个/mL，采用FACSAria II流式细胞仪进行检测。激发波长488 nm，收集波长520~545 nm。

  将含500 nmol/L MitoTracker Red的Opti-MEM加入待成像的细胞中，于培养箱中染色45 min。用荧光显微镜进行细胞成像。

  2.5.   线粒体提取和染料标记

  收集2×10⁷个细胞，结合Dounce匀浆和差速离心(4℃)的方法^[17]，用Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells提取线粒体，将线粒体重悬于MTB中用于后续实验，全程置于冰上。

  MitoTracker Green染色：从HeLa细胞中提取的线粒体用含500 nmol/L MitoTracker Green的MTB重悬，37℃水浴30 min，离心后用MTB重悬沉淀进行洗涤。

  SYTO 62染色：从HeLa细胞中提取的线粒体用含500 nmol/L SYTO 62的MTB重悬，离心后用MTB重悬沉淀进行洗涤。

  2.6.   超高灵敏流式检测装置分析单线粒体

  待检测线粒体用MTB稀释至10⁹个/mL上机检测。激发波长488 nm，收集波长：GFP、MitoTracker Green为520 nm, 带宽35 nm，SYTO 62为700 nm, 带宽40 nm。

  HSFCM的光路图如图 1所示，激光器发出的488 nm激光经反射镜反射后，被消色差胶合透镜聚焦为直径约10μm的激光光斑，激光光斑与被鞘液流聚焦后的样品流正交于石英流动室的中心处，光电倍增管PMT-1检测样品的侧向散射光信号(Side scatter，SS)，PMT-2和PMT-3分别检测样品的绿色和红色荧光信号。

  图 1

  

  图 1  三通道超高灵敏流式检测装置光路图

  Figure 1.  Schematic diagram of the optical path for the three-channel high sensitivity flow cytometer (HSFCM)

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  3.   结果与讨论

  3.1.   单细胞水平对比瞬时转染与稳定转染的细胞转染效率

  TransLipid HL是一种阳离子脂质体转染试剂，可通过静电作用包裹DNA分子，通过融合或内吞作用将DNA转运进细胞。质粒pAcGFP1-Mito融合表达AcGFP^[18]和线粒体靶向序列(来源于人类细胞色素C氧化酶Ⅷ亚基的前体^[19])，并携带新霉素抗性基因。细胞转染pAcGFP1-Mito后，表达的GFP被转运至线粒体基质中^[20]，广泛应用于细胞水平线粒体的荧光显微镜成像和流式细胞仪检测^{[21, 22]}。在最佳转染条件下，传统流式细胞仪测定的细胞瞬时转染效率为70%~80%。为了提高转染效率，采用G418(Geneticin，稳定转染最常用的抗性筛选试剂^{[23, 24]})从瞬时转染细胞中筛选出稳定转染细胞，再分别采用荧光显微镜和流式细胞仪在细胞水平对比两者的转染效果，其结果如图 2所示。

  图 2

  

  图 2  单细胞水平对比瞬时转染与稳定转染的细胞转染效率。(A-1, A-2)分别为瞬时转染细胞的MitoTracker Red和GFP荧光成像，(A-3，A-4)分别为稳定转染细胞的MitoTracker Red和GFP荧光成像。标尺为25μm。(B-1，B-2)分别为阴性对照与瞬时转染细胞的GFP绿色荧光信号-散射信号峰面积的二维散点图叠加和GFP荧光分布直方图叠加，(B-3，B-4)分别为阴性对照与稳定转染细胞的GFP绿色荧光信号-散射信号峰面积的二维散点图叠加和GFP荧光分布直方图叠加。黑色为阴性样本(未转染质粒的正常细胞)，绿色为转染了质粒的细胞。

  Figure 2.  Comparison of transient transfection and stable transfection at the single-cell level. (A-1, A-2): Fluorescence images of MitoTracker Red and green fluoroscent protein (GFP) for cells with transient transfection, respectively. (A-3, A-4): Fluorescence images of MitoTracker Red and GFP for cells with stable transfection, respectively. Scale bar, 25μm. (B-1, B-2): Overlapped bivariate dot-plots of GFP burst area versus side scatter burst area and the overlapped fluorescence distribution histograms for negative control and cells with transient transfection, respectively. (B-3, B-4): Overlapped bivariate dot-plots of GFP burst area versus side scatter burst area and the overlapped fluorescence distribution histograms for negative control and cells with stable transfection, respectively. Black for negative control sample (cells with no transfection) and green for cells transfected with plasmid.

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  MitoTracker Red是一种广泛使用的线粒体染料，能穿过细胞膜并聚集在活性线粒体中，MitoTrackerRed染色的转染细胞作为阳性对照(A-1和A-3)。从荧光显微镜的实验结果可以看出，瞬时转染细胞的GFP亮度不均一(A-2)，而稳定转染细胞的GFP亮度相对均一(A-4)。在采用流式细胞仪进行定量检测中，使用未转染质粒的正常HeLa细胞作为阴性对照(B-1、B-3中黑色的峰面积二维散点图以及B-2、B-4中黑色的荧光直方图)。图 2B表明，瞬时转染细胞的转染效率为79.4%，GFP的荧光强度分布在10¹～10⁴之间，谱峰较宽，中位值为465(B-2)；稳定转染细胞的转染效率为96.5%，GFP的荧光强度分布在10³～10⁴之间，谱峰较窄，中位值为2668(B-4)。因此，细胞水平的对比实验结果表明，瞬时转染细胞的GFP表达差异大，而稳定转染细胞差异小，且单细胞的GFP荧光亮度约为瞬时转染的5.7倍。这主要是因为瞬时转染过程中不同细胞摄入的质粒个数存在差异，导致细胞的蛋白表达量各不相同，GFP亮度差异较大；而稳定转染细胞是从同一个细胞团簇(由最初的单个细胞增殖而成)扩增而来，质粒DNA整合到宿主细胞的染色体中，所有稳定转染细胞的后代都带有GFP基因，因此不同细胞的蛋白表达量差异较小，细胞的GFP亮度相对均一。

  3.2.   单线粒体水平对比瞬时转染与稳定转染的线粒体标记效率和荧光亮度

  本研究采用实验室自行研制的HSFCM，在单线粒体水平对两种转染方法的线粒体标记效率和荧光亮度进行了比较，以揭示线粒体的异质性。SYTO 62是一种跨膜核酸染料，能对线粒体基质的DNA进行标记。由于线粒体提纯过程中的细胞匀浆会不可避免地破坏部分线粒体^[20]，通过SYTO 62的染色情况可以测定完整线粒体的比例^[10]。SYTO 62与GFP可以同时被488 nm激光激发，且在双染检测时不会互相影响。采用三通道HSFCM分别对转染细胞提纯的单个线粒体的散射和绿色、红色荧光信号进行检测，1 min内可以对几千个线粒体进行逐一测定(如图 3所示)。A-1至A-3分别是瞬时转染细胞中提纯线粒体的散射、SYTO 62和GFP的代表性脉冲信号图，从SYTO 62信号与散射信号个数的比值可知, 完整线粒体的比例为63%;从GFP信号与SYTO 62信号个数的比值可知, 瞬时转染细胞线粒体的GFP标记效率为54%。同理, 由B-1至B-3可知, 从稳定转染的细胞中提纯线粒体，完整线粒体的比例为60%，线粒体的GFP标记效率为63%。A-4为瞬时转染细胞中提纯线粒体的散射信号与GFP信号峰面积的二维散点图，A-5为GFP信号的峰面积统计分布直方图，细胞表达差异与线粒体异质性的叠加结果使得线粒体的GFP荧光出现两个明显的峰形；由B-5可见，稳定转染细胞中提纯线粒体的GFP荧光使得检测器几乎饱和，荧光信号衰减10倍后的中位值为12549，则衰减前的荧光强度约为瞬时转染的17.7倍。因此，细胞稳定转染pAcGFP1-Mito后，表达GFP的线粒体比例和荧光亮度均高于瞬时转染，说明稳定转染更适用于线粒体的蛋白标记。虽然单线粒体的GFP标记效率与细胞水平转染效率密切相关，但是当细胞水平的转染效率高达96.5%时，线粒体却无法达到相似的标记效率。这可能是因为单个细胞内线粒体数目可能高达上千个，异质性大，且GFP蛋白在细胞内存在一个合成与降解的平衡过程，可能导致并非所有的线粒体均含有GFP荧光蛋白。

  图 3

  

  图 3  线粒体水平对比瞬时转染和稳定转染的线粒体标记效率与荧光亮度。(A-1, A-2, A-3)分别为瞬时转染提纯线粒体的散射、SYTO 62信号和GFP信号的代表性脉冲信号图。(A-4, A-5)分别为瞬时转染提纯线粒体的散射信号与GFP信号峰面积的二维散点图和GFP信号峰面积统计分布直方图。(B-1, B-2, B-3)分别为稳定转染提纯线粒体的散射、SYTO 62信号和GFP信号的代表性脉冲信号图。(B-4, B-5)分别为稳定转染提纯线粒体的散射信号与GFP信号峰面积的二维散点图和GFP信号峰面积统计分布直方图。

  Figure 3.  Analysis of the labeling efficiency and fluorescence intensity at the single-mitochondrion level upon transient transfection and stable transfection. (A-1, A-2, A-3): Representative burst traces for the side scatter, red fluorescence, and green fluorescence of mitochondria isolated from cells with transient transfection, respectively. (A-4, A-5): Bivariate dot-plots of side scatter burst area versus GFP burst area and the burst area distribution histograms of GFP for mitochondria isolated from cells with transient transfection, respectively. (B-1, B-2, B-3): Representative burst traces for the side scatter, red fluorescence, and green fluorescence of mitochondria isolated from cells with stable transfection, respectively. (B-4, B-5): Bivariate dot-plots of side scatter burst area versus GFP burst area and the burst area distribution histograms of GFP for mitochondria isolated from cells with stable transfection, respectively.

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  3.3.   单线粒体水平对比稳定转染蛋白标记与染料标记的稳定性和荧光亮度

  为了研究线粒体稳定转染蛋白标记与染料标记的稳定性和荧光亮度的差异，选取了广泛应用于线粒体标记的染料MitoTracker Green和SYTO 62对提纯线粒体进行标记，用MTB对稳定转染细胞提纯的线粒体和染料标记的线粒体进行洗涤，用HSFCM对比不同标记方法的线粒体随着洗涤次数增加时荧光强度的变化情况。转染pAcGFP1-Mito后，细胞中表达的GFP转位至线粒体基质中，在膜结构完整时不会游离出来；MitoTracker Green与线粒体蛋白共价结合^[24]，能稳定保存在线粒体中，标记效率为75%；而SYTO 62能与DNA维持一定的结合与解离速率。如图 4所示，随着线粒体洗涤次数的增加，GFP和MitoTracker Green的荧光强度几乎不变(A-3和B-3)，而SYTO 62的荧光强度迅速下降(C-3)。衰减10倍后GFP的荧光中位值为12549，而MitoTracker Green的中位值仅为950，因此在单线粒体水平上，稳定转染细胞中提纯线粒体的GFP荧光亮度约比MitoTracker Green染色的线粒体高两个数量级。此外，由图 2中A-4与B-4可知，稳定转染的GFP在细胞水平上的荧光亮度相对均一；而图 4中A-1可见，提纯线粒体的GFP荧光强度分布依然很宽，说明线粒体存在高度的异质性。因此，通过对单线粒体的高通量检测，HSFCM不仅能很好地揭示线粒体的异质性，而且证明稳定转染细胞中提纯线粒体的GFP荧光亮度高且标记稳定性好；MitoTracker Green虽然标记稳定性良好，但荧光亮度弱于稳转细胞中提纯线粒体的GFP信号；而SYTO 62的标记稳定性较差，这是因为染料与DNA的结合在每次洗涤过程中迅速达到新的平衡，从而导致染料解离^[26]。

  图 4

  

  图 4  线粒体水平对比稳定转染蛋白标记与染料标记的标记稳定性和荧光亮度。(A-1, B-1, C-1)分别为洗涤前的GFP(10倍衰减)、MitoTracker Green和SYTO 62荧光信号与散射信号峰面积的二维散点图，(A-2, B-2, C-2)分别为洗涤3次后的GFP(10倍衰减)、MitoTracker Green和SYTO 62荧光信号与散射信号峰面积的二维散点图，(A-3, B-3, C-3)分别为GFP(10倍衰减)、MitoTracker Green和SYTO 62荧光信号峰面积中位值的柱状图。

  Figure 4.  Comparison of labeling stability and fluorescence intensity among stable transfection, MitoTracker Green labeling, and SYTO 62 labeling at the single-mitochondrion level. (A-1, B-1, C-1) Bivariate dot-plots of fluorescence burst area versus side scatter burst area of mitochondria prior to washing for GFP (10-fold attenuated), MitoTracker Green, and SYTO 62, respectively. (A-2, B-2, C-2) Bivariate dot-plots of fluorescence burst area versus side scatter burst area upon three washes for GFP (10-fold attenuated), MitoTracker Green, and SYTO 62, respectively. (A-3, B-2, C-3) Washing effect on the stability of GFP, MitoTracker Green, and SYTO 62 labeling, respectively.

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  4.   结 论

  利用超高灵敏流式检测技术对单线粒体进行高灵敏、高通量和多参数同时检测的独特优势，本研究考察了瞬时转染和稳定转染线粒体荧光蛋白标记、MitoTracker Green标记、SYTO 62线粒体DNA标记等线粒体标记方法的荧光亮度、标记效率和标记稳定性。单线粒体水平的荧光定量分析表明，稳定转染靶向线粒体荧光蛋白的细胞中线粒体表达GFP的比例和荧光亮度均高于瞬时转染，荧光亮度约为瞬时转染的17.7倍，这是首次在单线粒体水平对线粒体的蛋白标记效率进行定量表征。此外，稳定转染细胞中线粒体表达GFP的荧光亮度约比MitoTracker Green染色的线粒体高两个数量级，这两种染色方法都具有良好的标记稳定性，而SYTO 62的标记稳定性较差。本研究结果表明，相比瞬时转染和染料标记，稳定转染具有荧光亮度高且标记稳定性好的独特优势，能更好地应用于需要线粒体稳定标记的相关研究中；同时也证明了超高灵敏流式检测技术可为线粒体标记方法的选择提供一种先进的分析手段，有利于促进线粒体结构与功能的相关研究。

• 1. [1]

     Wagner B K,Kitami T,Gilbert T J,Peck D,Ramanathan A,Schreiber S L,Golub T R,Mootha V K.Nat.Biotechnol.,2008,26(3):343-351

  2. [2]

     Tait S W G,Green D R.J.Cell.Sci.,2012,125(4):807-815

  3. [3]

     Nunnari J,Suomalainen A.Cell,2012,148(6):1145-1159

  4. [4]

     XU Jing-Yi,CHEN Chao-Xiang,HANG Jin-Yan,HANG Wei,YAN Xiao-Mei.Chinese J.Anal.Chem.,2015,43(9):1257-1264 许静怡,陈超翔,韩锦艳,杭纬,颜晓梅.分析化学,2015,43(9):1257-1264

  5. [5]

     Csiszar A,Labinskyy N,Pinto J T,Ballabh P,Zhang H,Losonczy G,Pearson K,de Cabo R,Pacher P,Zhang C,Ungvari Z.Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.,2009,297(1):H13-H20

  6. [6]

     Abramov A Y,Smulders-Srinivasan T K,Kirby D M,Acin-Perez R,Enriquez J A,Lightowlers R N,Duchen M R,Turnbull D M.Brain,2010,133(3):797-807

  7. [7]

     Henze K,Martin W.Nature,2003,426:127-128

  8. [8]

     Kuznetsov AV,Margreiter R.Int.J.Mol.Sci.,2009,10(4):1911-1929

  9. [9]

     Reiner J E,Kishore R B,Levin B C,Albanetti T,Boire N,Knipe A,Helmerson K,Deckman K H.Plos One,2010,5(12):1-9

  10. [10]

      Zhang S Y,Zhu S B,Yang L L,Zheng Y,Gao M,Wang S,Zeng JZ,Yan X M.Anal.Chem.,2012,84(15):6421-6428

  11. [11]

      YANG Ling-Ling,ZHU Shao-Bin,HANG Wei,YAN Xiao-Mei.Chem.J.Chinese Universities,2008,29(8):1549-1551 杨玲玲,朱少彬,杭纬,颜晓梅.高等学校化学学报,2008,29(8):1549-1551

  12. [12]

      Yang L L,Zhu S B,Hang W,Wu L N,Yan X M.Anal.Chem.,2009,81(7):2555-2563

  13. [13]

      Zhu S B,Yang L L,Long Y,Gao M,Huang T X,Hang W,Yan X M.J.Am.Chem.Soc,2010,132:12176-12178

  14. [14]

      Zhu S B,Ma L,Wang S,Chen C X,Zhang W Q,Yang L L,Hang W,Nolan J P,Wu L N,Yan X M.ACS Nano,2014,8(10):10998-11006

  15. [15]

      Zhang X,Zhang S Y,Zhu S B,Chen S,Han J Y,Gao K M,Zeng J Z,Yan X M.Anal.Chem.,2014,86(11):5232-5237

  16. [16]

      Chen C X,Zhang X,Zhang S Y,Zhu S B,Xu J Y,Zheng Y,Han J Y,Zeng J Z,Yan X M.Biosens.Bioelectron.,2015,74:476-482

  17. [17]

      Foster L J,Hoog C L d,Zhang Y L,Zhang Y,Xie X H,Mootha V K,Mann M.Cell,2006,125(1):187-199

  18. [18]

      Gurskaya N G,Fradkov A F,Pounkova N I,Staroverov D B,Bulina M E,Yanushevich Y G,Labas Y A,Lukyanov S,Lukyanov K A.Biochem.J.,2003,373(2):403-408

  19. [19]

      Rizzuto R,Nakase H,Darras B,Francke U,Fabrizi G M,Mengel T,Walsh F,Kadenbach B,DiMauro S,Schon E A.J.Biol.Chem.,1989,264(18):10595-10600

  20. [20]

      Taylor T H,Frost N W,Bowser M T,Arriaga E A.Anal.Bioanal.Chem.,2014,406(6):1683-1691

  21. [21]

      Ouyang Y B,Xu L J,Emery J F,Lee A S,Giffard R G.Mitochondrion,2011,11(2):279-286

  22. [22]

      Pal A D,Basak N P,Banerjee A S,Banerjee S.Carcinogenesis,2014,35(7):1592-1601

  23. [23]

      Ueyama T,Kasahara H,Ishiwata T,Nie Q,Izumo S.Mol.Cell.Biol.,2003,23:9222-9232

  24. [24]

      Navratil M,Terman A,Arriaga E A.Exp.Cell.Res.,2008,314(1):164-172

  25. [25]

      Presley A D,Fuller K M,Arriaga E A.J.Chromatogr.B,2003,793(1):141-150

  26. [26]

      Yan X M,Habbersett R C,Yoshida T M,Nolan J P,Jett J H,Marrone B L.Anal.Chem.,2005,77(11):3554-3562

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  Figure 1  Schematic diagram of the optical path for the three-channel high sensitivity flow cytometer (HSFCM)

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  Figure 2  Comparison of transient transfection and stable transfection at the single-cell level. (A-1, A-2): Fluorescence images of MitoTracker Red and green fluoroscent protein (GFP) for cells with transient transfection, respectively. (A-3, A-4): Fluorescence images of MitoTracker Red and GFP for cells with stable transfection, respectively. Scale bar, 25μm. (B-1, B-2): Overlapped bivariate dot-plots of GFP burst area versus side scatter burst area and the overlapped fluorescence distribution histograms for negative control and cells with transient transfection, respectively. (B-3, B-4): Overlapped bivariate dot-plots of GFP burst area versus side scatter burst area and the overlapped fluorescence distribution histograms for negative control and cells with stable transfection, respectively. Black for negative control sample (cells with no transfection) and green for cells transfected with plasmid.

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  Figure 3  Analysis of the labeling efficiency and fluorescence intensity at the single-mitochondrion level upon transient transfection and stable transfection. (A-1, A-2, A-3): Representative burst traces for the side scatter, red fluorescence, and green fluorescence of mitochondria isolated from cells with transient transfection, respectively. (A-4, A-5): Bivariate dot-plots of side scatter burst area versus GFP burst area and the burst area distribution histograms of GFP for mitochondria isolated from cells with transient transfection, respectively. (B-1, B-2, B-3): Representative burst traces for the side scatter, red fluorescence, and green fluorescence of mitochondria isolated from cells with stable transfection, respectively. (B-4, B-5): Bivariate dot-plots of side scatter burst area versus GFP burst area and the burst area distribution histograms of GFP for mitochondria isolated from cells with stable transfection, respectively.

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  Figure 4  Comparison of labeling stability and fluorescence intensity among stable transfection, MitoTracker Green labeling, and SYTO 62 labeling at the single-mitochondrion level. (A-1, B-1, C-1) Bivariate dot-plots of fluorescence burst area versus side scatter burst area of mitochondria prior to washing for GFP (10-fold attenuated), MitoTracker Green, and SYTO 62, respectively. (A-2, B-2, C-2) Bivariate dot-plots of fluorescence burst area versus side scatter burst area upon three washes for GFP (10-fold attenuated), MitoTracker Green, and SYTO 62, respectively. (A-3, B-2, C-3) Washing effect on the stability of GFP, MitoTracker Green, and SYTO 62 labeling, respectively.

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