基于识别分子的磁分离技术在食源性致病菌分离中应用

王钰童 李晖 杨国泰 孟祥玉 何丽华 许恒毅

引用本文: 王钰童, 李晖, 杨国泰, 孟祥玉, 何丽华, 许恒毅. 基于识别分子的磁分离技术在食源性致病菌分离中应用[J]. 化学通报, 2019, 82(1): 27-31. shu
Citation:  Wang Yutong, Li Hui, Yang Guotai, Meng Xiangyu, He Lihua, Xu Hengyi. Progress in Magnetic Separation Detection of Foodborne Pathogentic Based on Recognition Molecule[J]. Chemistry, 2019, 82(1): 27-31. shu

基于识别分子的磁分离技术在食源性致病菌分离中应用

    通讯作者: 许恒毅  男, 博士, 研究员, E-mail:kidyxu@163.com
  • 基金项目:

    食品科学与技术国家重点实验室自由探索课题(SKLF-ZZB-201720)和江西省教育厅基金项目(GJJ150014)资助

摘要: 食源性致病菌是一类对人类健康危害极大的致病菌,但由于其在食品基质中数量较少,通常需要在检测前对其进行富集。磁分离作为一种常用的前处理手段,在致病菌的富集、分离方面展示出极好的应用前景。常用于修饰在磁性材料上的识别分子有多种,本文主要综述了抗体、抗生素、核酸、凝集素等主要的几种识别分子在磁分离中的应用。

English

  • 食源性致病菌是可以借助食品传播的致病微生物,是人类感染食源性疾病的主要原因。一些常见致病菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌等由于其来源广泛、杀菌不彻底,极易污染食品,从而导致食品安全事故的发生,严重影响人类身体健康。传统的致病菌检测方法周期长步骤繁琐,而以免疫学或分子生物学为基础的快速检测技术又伴有结果不准确、技术难度大等缺点。磁分离技术作为一种高效方便的前处理手段,可代替预增菌过程同时又能消除复杂基质的干扰,在食源性致病菌检测的前处理中得到了广泛应用。

    磁分离技术的原理是识别分子修饰于磁性材料如纳米磁珠或磁簇表面,用于靶向目标菌,使目标菌带有磁性,再借助外加磁场的作用,实现目标菌的快速分离富集,磁分离技术结合后续检测手段能有效提高检测精确度。磁性材料对目标致病菌独特的专一性归因于其表面修饰的识别分子,目前常用的识别分子主要有抗体、抗生素、核酸、凝集素等。本文总结了识别分子的种类和修饰方式,综述了功能化磁性材料在致病菌检测中的研究进展,以期为功能化磁性材料在食源性致病菌富集分离中的运用提供参考。

    识别分子与磁性材料的连接方式可以分为直接修饰和间接修饰。其中,直接修饰是将识别分子通过共价结合或者物理吸附的方式,修饰在有特定功能基团如羧基(-COOH)、氨基(-NH2)等的磁性材料表面,这种连接方式无需其他分子的介导,因而又被称为“刚性”连接(图 1A),如抗体或万古霉素直接偶联在磁珠表面,用于靶向致病菌[1];而间接修饰则是指利用生物素-亲和素(BAS)系统、多聚物以及金属涂层等有机或无机物的介导,将识别分子间接修饰于磁性材料表面(图 1B),该方法的主要优点是将“刚性”连接转化为“柔性”连接,减少空间位阻,提高识别分子的负载量;如先用BSA修饰磁珠,然后再将万古霉素修饰于BSA化的磁珠表面[2],这种方式更利于识别分子与目标菌靶点的结合;又如将磁性材料表面修饰链霉亲和素,再加入生物素化的抗体[3]利用BAS系统间接的将识别分子修饰在磁性纳米粒子上。

    图 1

    图 1.  识别分子的修饰方式:直接修饰(A);间接修饰(B)
    Figure 1.  The modifications of recognitions agents: direct modification (A); indirect modification (B)

    修饰有识别分子的磁性材料具有特异性捕获目标菌的能力,由于识别分子种类不同,识别分子与目标菌的作用机理也各不相同。表 1总结了近几年识别分子修饰的磁性材料在食源性致病菌富集分离中的应用。不同的识别分子用于致病菌磁分离的方法也可以有所区别,图 2总结了不同识别分子在磁分离过程中捕获目标菌的两种方式:一步法和二步法。

    表 1

    表 1  识别分子的种类以及在食源性致病菌富集分离中的应用
    Table 1.  The species of molecular recognitions and the application in the enrichment and separation of foodborne bacteria
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    识别分子 材料组成 修饰方式 识别方式 检测方法 食源性致病菌 检测限 参考文献
    抗体 Fe3O4 间接修饰 抗原-抗体反应 交叉微电极 大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌 103CFU/mL [4]
    抗体 Fe3O4 间接修饰 抗原-抗体反应 mPCR 单增李斯特菌、绵羊李斯特菌 1CFU/mL [5]
    抗体 Fe3O4 直接修饰 抗原-抗体反应 化学发光 变形链球菌 23CFU/mL [6]
    万古霉素 Fe3O4 直接修饰 抗生素识别 电化学发光 单增李斯特菌 10CFU/mL [7]
    万古霉素 Fe3O4 直接修饰 抗生素识别 ATP生物发光分析 革兰氏阳性细菌 33CFU/mL [1]
    万古霉素 Fe3O4@Ag 间接修饰 抗生素识别 表面增强拉曼散射 革兰氏阳性细菌 500cells/mL [8]
    万古霉素 Fe3O4 间接修饰 抗生素识别 流式细胞术 金黄色葡萄球菌 33 CFU/mL [2]
    适配体 Fe3O4 间接修饰 特异性识别 上转换发光 鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌 5CFU/mL, 8CFU/mL [9]
    适配体 Fe3O4 间接修饰 特异性识别 石英晶体微平衡传感器 沙门氏菌 100cells [10]
    刀豆蛋白 金电极 间接修饰 黏附素-受体反应 生物传感器 大肠杆菌O157:H7 75cells/mL [11]
    壳聚糖 Fe3O4 直接修饰 静电吸附 磁弹性传感器 大肠杆菌O157:H7 10cells/mL [12]
    甘露聚糖 α-Fe2O3 间接修饰 黏附素-受体反应 NR 大肠杆菌ORN178、ORN208 NR [13]
    噬菌体 Fe3O4 直接修饰 特异性识别 生物传感器 金黄色葡萄球菌 2.47×103CFU/mL [14]
    噬菌体 Fe3O4 直接修饰 特异性识别 光学检测 沙门氏菌 19CFU/mL [15]
    注:NR未报道

    图 2

    图 2.  食源性致病菌的磁分离方式:一步法(A);二步法(B)
    Figure 2.  The magnetic separation methods of foodborne pathogens (A); two-step process(B)

    抗原与抗体由于其化学结构和空间构型的互补性,具有极高的识别和结合能力(Kd=1μmol/L~1fmol/L)。免疫磁分离技术利用这一特性,将磁性材料作为载体,其上直接或者间接修饰抗体,利用抗体与抗原结合的特异性来捕获目标菌,再借助外部磁场,富集分离目标菌。Yang等[16]制备了直接修饰抗体的磁性纳米粒子,与同样修饰有抗体的荧光碳点硅纳米胶囊共同结合识别金黄色葡萄球菌,磁分离后释放胶囊内的荧光碳点,通过荧光信号输出的变化实现致病菌的检测,检测限达到1CFU/mL;Cho等[17]采用修饰单克隆抗体的磁珠与修饰有多克隆抗体以及拉曼信号分子的金纳米粒子共同识别食品中的大肠杆菌O157:H7,磁分离后通过银垫板过滤除去未反应的材料,放大拉曼信号实现牛肉中的大肠杆菌O157:H7的检测,其检测限低至10CFU/mL。除以上两种直接修饰抗体的方法外,抗体间接修饰在磁性材料表面用于识别目标菌的文献报道也有很多,Sung等[18]将羧基化的磁性纳米粒子与BSA共价偶联,并通过静电相互作用吸附修饰了抗体的金纳米粒子,得到的磁性纳米材料富集牛奶样本中的金黄色葡萄球菌,结合快速比色法检测,检测限达到1.5×105 CFU/mL;此外,Pal等[19]制备了一种表面掺杂Zn的磁性纳米簇,利用Zn-S键的作用将半抗体修饰在纳米簇表面,结合便携式ATP光度仪检测牛奶样本中的沙门氏菌,检测限低至10CFU/mL。

    抗生素是一类由微生物或动植物产生的次级代谢物,被证明可以干扰致病菌生长繁殖,不同抗生素由于抑菌机制不同可作用于不同种类的细菌。根据文献报道,万古霉素是一种对革兰氏阳性菌有极强抑菌活力的糖肽类抗生素,能够与革兰氏阳性细菌细胞壁上的D-丙氨酰-D-丙氨酸(D-Ala-D-Ala)结合形成五点氢键,从而抑制细胞壁合成使细菌细胞溶解死亡,(Kd=1~4μmol/L)。Yang等[20]将万古霉素直接修饰在磁性材料上,结合碱性磷酸酶标记的兔抗体(ALP-IgG)共同识别金黄色葡萄球菌,将磁分离技术与化学发光结合检测致病菌,其检测限低至3.3CFU/mL;Meng等[21]采用聚乙二醇(PEG)间接介导的方式,将万古霉素修饰在磁性纳米粒子上,富集生菜中的单增李斯特菌,结合PCR技术,其检测限达到30CFU/mL;Yang等[22]制备了以聚赖氨酸为分子骨架、聚乙二醇为支链的刷状纳米磁珠,能负载大量的万古霉素,实现了对单增李斯特菌的快速识别。

    此外,庆大霉素和达托霉素作为识别分子在食源性致病菌检测中的应用也有报道,庆大霉素是一种氨基糖苷类广谱抗生素,对多种致病菌都具备抑菌作用,其抑菌的机制是与细菌细胞的核糖体结合,阻断蛋白质的合成导致细胞裂解死亡。庆大霉素可以修饰在磁性材料上用于食源性致病菌的分离检测。Chen等[23]制备了一种修饰庆大霉素的核-壳型荧光磁性纳米粒子,可在20min内捕获大肠杆菌,检测浓度可低至1×103CFU/mL。达托霉素是一类脂肽类抗生素,其抑菌原理是在钙离子存在的情况下,达托霉素与革兰氏阳性细菌的细胞膜结合,引起细菌的去极化导致细菌死亡。近几年来,也有文献报道利用达托霉素修饰的磁性材料捕获食源性致病菌的例子,Wang等[24]利用达托霉素直接修饰的磁珠捕获致病菌结合ATP荧光检测,检测限低至33CFU/mL。

    适配体是一类人工合成的新型配体,相比于生物抗体具有性质稳定、筛选时间短、易于保存等优点,适配体可分为核酸适配体和肽适配体,其中核酸适配体可形成与蛋白质等靶分子亲和性极高的二级结构或三级结构,解离常数(Kd)可达纳摩尔或皮摩尔水平。适配体修饰的功能化磁性材料综合了适配体的高特异性与磁性材料特殊的理化性质,可用于致病菌的识别和分离。

    Zhang[25]制备了适配体修饰的磁性纳米簇,富集分离单增李斯特菌后将纳米簇-致病菌复合物固定于修饰有万古霉素-牛血清蛋白(Van-BSA)的酶标版上,利用磁性纳米粒子与天然酶相似的催化性质,催化TMB显色,裸眼检测单增李斯特菌,检测限低至5.4×103CFU/mL。Ozalp等[26]制备了一种表面包覆聚羟丙甲丙烯酸甲酯与双甲基丙烯酸乙二醇酯(poly(HPMA/EGDMA))的纳米磁珠,修饰聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(P(GMA))分支,将对目标菌具有特异性的适配体固定于聚合刷的分支末端,用于富集分离牛奶样品中的大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌,结合实时定量聚合酶链式反应(real-time qPCR)的检测方法,其检测限分别为126CFU/mL和78CFU/mL。

    细菌细胞膜表面的糖类物质具有非常重要的生物功能,如细菌之间相互识别、信息传递、粘附宿主细胞等,而凝集素作为一种具有生物活性的糖蛋白或糖肽,可以可逆地与细菌表面特殊的糖类物质结合。因此,基于凝集素-糖蛋白之间特殊的相互作用,凝集素作为识别分子可为致病菌富集分离提供新的研究方向。

    在诸多凝集素中,刀豆蛋白是在致病菌富集分离中应用最为广泛的一种。刀豆蛋白是从植物刀豆中提取出的凝集素,可以与D-甘露糖或D-葡聚糖特异性结合,据文献报道[27],刀豆蛋白与大肠杆菌的电离平衡常数Ka为1.81×108L·mol-1。Zhuang等[28]将Fe3O4纳米磁珠表面包被油酸并在碱性环境下与多巴胺结合,最后与刀豆蛋白偶联,制备成刀豆蛋白修饰的磁性纳米粒子(Fe3O4@OA@DP-ConA),用于捕获固定重组大肠杆菌;He等[29]采用于“二步法”捕获大肠杆菌,先将刀豆凝集素与目的菌结合,然后再加入修饰了甘露聚糖的磁性纳米粒子进行偶联,磁分离后加入抗体修饰的荧光染料以及核酸染料对目标菌染色,采用双色荧光标记流式细胞术进行检测,检测限低达6cells/mL。

    除了刀豆蛋白以外,麦胚凝集素等其他凝集素作为识别分子的应用也有文献报道。Mikaelyan等[30]制备了一种修饰有麦胚凝聚素和小扁豆凝集素的各向异性银纳米粒子,可用于检测尿液样本中的各类细菌。高浓度的细菌可作用纳米粒子使其在加入氯化钠后保持稳定,但随着细菌浓度降低,过量的纳米粒子会在氯化钠的作用下发生聚集,引起光学信号的变化,这种信号变化与细菌浓度有一定关系。此外也有文献报道用麦胚凝集素修饰的磁性材料富集分离弓形虫囊泡,可检测水样中的弓形虫[31]。但目前麦胚凝集素修饰的磁性材料用于食源性致病菌的分离检测还未见文献报道。

    识别分子的种类多种多样,除最常应用的以上4种识别分子外,其他物质诸如卵清蛋白、多肽、TiO2、糖类、噬菌体等也可作为识别分子修饰或包被在磁性材料表面。Chen等[32]利用大肠杆菌的P菌毛具有与卵清蛋白粘附的原理,将卵清蛋白修饰在氧化铝包被的Fe3O4纳米磁珠上,可捕获尿液样本中的大肠杆菌;Kuo等[33]将一段可以特异性识别目的致病菌的肽链修饰在氧化铝包覆的纳米磁珠上,富集果汁及鸡蛋样品中的金黄色葡萄球菌。此外,Chen等[34]在磁珠表面包覆能与细菌细胞壁上的脂多糖发生螯合反应的TiO2,特异性捕获致病菌。该研究建立的磁分离方法能够有效富集分离致病菌,结合低能量紫外线照射,实现了在杀伤致病菌有效抑制致病菌的生长目的的同时,减少紫外线对非目标菌的伤害。El-Boubbou等[35]制备了不同化学键修饰的磁珠连接甘露糖,该材料磁分离后可移除88%的大肠杆菌。除此之外,噬菌体也可以作为识别分子结合磁性材料富集分离目的菌,例如,Liebana等[36]将P22噬菌体与磁性粒子共价耦连后用于富集分离沙门氏菌,再采用两种标记引物进行PCR扩增,最后采用电化学生物传感器检测其基因,实验能在4h内完成,检测限低达3CFU/mL。

    功能化的磁性材料在食源性致病菌检测中的应用潜力巨大,识别分子与磁性材料组合,能够为致病菌的富集分离提供便捷有效的途径,减少非目标菌以及食品基质对检测的干扰。随着对识别分子的种类及其连接方式的不断探索,越来越多的食源致病菌磁分离方法得以建立,有些方法效果显著,对食源致病菌的检测具有重大意义。文中列举的几种识别分子在食源性致病菌分离检测的应用过程中其本身也存在一些无法避免的缺点:如抗体特异性较好但其成本较高,难以制备、稳定性差;抗生素以及凝集素等识别分子成本低廉易于获得但缺乏专一性,只能广谱性识别食源性致病菌,其应用具有局限性;适配体虽然具有极高的特异性及稳定性,但筛选优化过程繁琐,还未实现在磁分离中的广泛运用。因此,磁分离技术依然存在诸多问题需要深入研究解决:(1)现有材料仍较难实现在细菌浓度过低或多种待检物情况下进行捕获,仍需开发探索更优良的识别分子;(b)磁性材料本身分散性和稳定性较差,以至在识别分子修饰的过程中,磁性材料易出现聚沉贴壁等不稳定的现象,导致识别分子负载量较低。但近年出现的功能化磁性材料如免疫磁性纳米微球[37],能有效避免该情况的发生,提高目标物的捕获量。因此研发更多性质良好的磁性材料十分迫切。(c)部分识别分子与磁性材料的连接方式以及反应条件过于复杂苛刻,材料合成不够经济环保,需探索更高效稳定的合成方法。

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  • 图 1  识别分子的修饰方式:直接修饰(A);间接修饰(B)

    Figure 1  The modifications of recognitions agents: direct modification (A); indirect modification (B)

    图 2  食源性致病菌的磁分离方式:一步法(A);二步法(B)

    Figure 2  The magnetic separation methods of foodborne pathogens (A); two-step process(B)

    表 1  识别分子的种类以及在食源性致病菌富集分离中的应用

    Table 1.  The species of molecular recognitions and the application in the enrichment and separation of foodborne bacteria

    识别分子 材料组成 修饰方式 识别方式 检测方法 食源性致病菌 检测限 参考文献
    抗体 Fe3O4 间接修饰 抗原-抗体反应 交叉微电极 大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌 103CFU/mL [4]
    抗体 Fe3O4 间接修饰 抗原-抗体反应 mPCR 单增李斯特菌、绵羊李斯特菌 1CFU/mL [5]
    抗体 Fe3O4 直接修饰 抗原-抗体反应 化学发光 变形链球菌 23CFU/mL [6]
    万古霉素 Fe3O4 直接修饰 抗生素识别 电化学发光 单增李斯特菌 10CFU/mL [7]
    万古霉素 Fe3O4 直接修饰 抗生素识别 ATP生物发光分析 革兰氏阳性细菌 33CFU/mL [1]
    万古霉素 Fe3O4@Ag 间接修饰 抗生素识别 表面增强拉曼散射 革兰氏阳性细菌 500cells/mL [8]
    万古霉素 Fe3O4 间接修饰 抗生素识别 流式细胞术 金黄色葡萄球菌 33 CFU/mL [2]
    适配体 Fe3O4 间接修饰 特异性识别 上转换发光 鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌 5CFU/mL, 8CFU/mL [9]
    适配体 Fe3O4 间接修饰 特异性识别 石英晶体微平衡传感器 沙门氏菌 100cells [10]
    刀豆蛋白 金电极 间接修饰 黏附素-受体反应 生物传感器 大肠杆菌O157:H7 75cells/mL [11]
    壳聚糖 Fe3O4 直接修饰 静电吸附 磁弹性传感器 大肠杆菌O157:H7 10cells/mL [12]
    甘露聚糖 α-Fe2O3 间接修饰 黏附素-受体反应 NR 大肠杆菌ORN178、ORN208 NR [13]
    噬菌体 Fe3O4 直接修饰 特异性识别 生物传感器 金黄色葡萄球菌 2.47×103CFU/mL [14]
    噬菌体 Fe3O4 直接修饰 特异性识别 光学检测 沙门氏菌 19CFU/mL [15]
    注:NR未报道
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  • 发布日期:  2019-01-18
  • 收稿日期:  2018-06-12
  • 接受日期:  2018-09-16
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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