English

• 细胞外信号相关激酶(extracellular signal-related kinases, ERK)属于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)家族, 是真核生物中广泛存在的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶. ERK是RAS(鸟苷酸结合调节蛋白)-RAF(丝氨酸/苏氨酸激酶)-MEK(丝裂原活化的细胞外信号调节激酶)-ERK信号传导途径的关键信号分子, 通过级联反应, 将细胞外生长因子、丝裂原和环境刺激等信号传导至细胞核, 参与调控细胞增殖、分化、迁移及粘附等一系列细胞生理学过程^[1].近年来的研究发现, 由于RAS和BRAF的突变, RAS-RAF-MEK- ERK信号通路在黑色素瘤、肺癌、胰腺癌和结直肠癌等多种肿瘤中过度激活, 是促进肿瘤发生发展的主要原因之一.因此, 针对RAS-RAF-MEK-ERK信号通路研究开发的小分子抑制剂, 可能成为新型靶向抗肿瘤药物^{[2, 3]}.虽然, 针对BRAF、MEK开发了多种小分子抑制剂, 但固有耐药和突变耐药的产生, 导致下游ERK继续激活, 限制了BRAF、MEK抑制剂的临床效果.由于ERK是该通路的下游信号分子, 针对ERK研究开发的小分子抑制剂, 作为单独或联合用药, 被认为可以解决耐药性问题, 已经受到各大制药公司的关注^[4-8].已经有多种结构类型的ERK抑制剂被报道(图 1), 如默克公司开发的SCH772984 (1)^[4]、基因泰克公司开发的Ravoxertinib (GDC-0994, 2)^[5]和礼来公司开发的LY3214996 (3)^[6]等已经进入临床研究阶段.此外, 针对化合物1分子量较大, 不符合成药性“5规则”的缺点, 默克公司的Lim等^[7]对其结构进行了简化, 开发了一类具有脲结构的ERK抑制剂4, 其在体内外表现出较好的抗肿瘤活性.化合物5是Heightman等^[8]采用基于片段的药物设计开发的一类新型ERK抑制剂, 其特点是能同时抑制ERK的激酶活力、磷酸化水平和核转位, 被认为可以更有效地抑制ERK的功能, 发挥抗肿瘤作用.虽然部分ERK抑制剂进入临床试验, 但目前尚没有ERK抑制剂被批准上市.因此, 针对ERK研究开发结构新颖、具有抗肿瘤作用的小分子抑制剂仍然是药物化学研究领域的热点.

  图 1

  

  图 1.  ERK小分子抑制剂的化学结构

  Figure 1.  Chemical structures of small molecular ERK inhibitors

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  为了寻找新型结构的ERK抑制剂, 我们分别对化合物4、5与ERK激酶的结合模式进行了分析(晶体复合物PDB号: 5EK0和6G9I), 化合物4脲结构中的O原子、N原子分别与Lys52和Gln103形成氢键; 甲基吡啶N原子与Lys112形成氢键; 化合物5的酰胺O原子与Lys52形成氢键, 四氢吡喃的O原子分别与Lys112和Thr108形成氢键.基于化合物与ERK的结合模式, 将化合物4与3、5的结构进行拼合(图 2), 保留化合物4脲的结构, 希望与Lys52和Gln103形成氢键, 同时在化合物4中引入吗啉环, 希望吗啉环的O原子与Lys112和Thr108形成氢键, 设计并合成了两类含有吗啉环的吡啶基苄基脲类化合物17a~17f和18a~18f.从激酶水平和细胞水平检测了目标化合物的对ERK激酶活力, MEK、ERK磷酸化水平, 总MEK、ERK表达水平以及细胞增殖的抑制作用.

  图 2

  

  图 2.  目标化合物的设计思路

  Figure 2.  Design of targeted compounds

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  1.   结果与讨论

  1.1   目标化合物的合成

  如Scheme 1所示, 4-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐(6)与对溴苯酚(7)反应得到中间体N-2-(4-溴苯氧基)乙基吗啡啉(8)^[9], 中间体8与联硼酸频哪醇酯在钯催化下发生Suzuki偶联反应, 生成N-2-(4-硼酸频哪醇酯基苯氧基)乙基吗啡啉(9)^[10].不同取代的苄胺10与三光气反应生成相应的异氰酸酯类化合物11, 再与正丁基锂去质子化的5-溴-2-氨基吡啶反应生成不同取代的吡啶基苯乙基脲12a~12f^[11], 中间体9和中间体12a~12f在无氧环境中通过钯催化的Suzuki偶联反应生成目标化合物17a~17f.吗啡啉(13)与1, 4-二溴苯(14)反应生成N-4-溴苯基吗啡啉(15)^[12], 中间体15与联硼酸频哪醇酯在钯催化下发生Suzuki偶联反应, 生成N-4-硼酸频哪醇酯基苯氧基吗啡啉(16)^[13].中间体16与中间体12a~12f, 经Suzuki偶联反应生成目标化合物18a~18f^[14].目标化合物的结构均经过¹H NMR、¹³C NMR和HRMS鉴定, 结构正确.

  图式 1

  

  图式 1.  目标化合物17a~17f和18a~18f的合成路线

  Scheme 1.  Synthetic route of targeted compounds 17a~17f and 18a~18f

  Reagents and conditions: (i) K₂CO₃, DMF, 60 ℃, 15 h; (ii) bis(pinacolato)diboron, PdCl₂(dppf), KOAc, DMF, 80 ℃, 18 h; (iii) triphosgene, sat. NaHCO₃, DCM, 0 ℃, 2.5 h; (iv) 5-bromopyridin-2-amine, n-BuLi, THF, r.t., 12 h; (v) Pd(AmPhos)₂Cl₂, Na₂CO₃, EtOH, H₂O, Ar, 60 ℃, 3 h; (vi) potassium tert-butoxide, Pd₂(dba)₃, BINAP, toluene, 125 ℃, 8 h

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  1.2   抗细胞增殖实验

  在获得目标化合物之后, 首先测试了目标化合物对人结直肠癌细胞SW480和HCT-116增殖的抑制作用, 并选择人正常肝细胞L02作为对照, 测试了目标化合物对正常细胞的毒性(表 1).如表 1所示, 大部分目标化合物对两种肿瘤细胞系具有中等强度的抑制作用, 对正常细胞L02的毒性较低.当苄基苯环上有取代基时, 化合物18b~18f活性优于17b~17f, 表明吗啉环直接与吡啶基苯环相连有利于这类化合物的抗肿瘤活性.当苄基苯环上为甲氧基(17b和18b)或甲基(17c和18c)取代时活性较差, 说明苄基苯环上有给电子基团或位阻增加可能对活性不利.苄基苯环上有卤素取代, 特别是氟原子取代时活性较好, 4-位取代优于3-位.目标化合物中, 吗啉环直接与吡啶基苯环相连的4-位氟原子取代化合物18f活性最佳, 对SW480和HCT-116细胞的抑制作用IC₅₀分别达到0.36和0.55 µmol/L, 对正常细胞L02毒性较低(＞10 µmol/L).

  表 1

  

  表 1  目标化合物对细胞增殖和ERK2激酶活性的抑制作用

  Table 1.  Inhibitory effects of targeted compounds on cell proliferation and ERK2 kinase activities

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  Compound	R	IC50/(μmol•L－1)
  		SW480	HCT-116	L02	ERK2
  17a	H	0.42	0.81	7.24	0.092
  17b	3-MeO	5.48	7.36	＞10	N.D.a
  17c	4-Me	＞10	＞10	＞10	N.D.a
  17d	4-Cl	6.59	8.57	9.64	N.D.a
  17e	3-F	1.29	2.34	＞10	N.D.a
  17f	4-F	1.02	0.84	6.24	0.147
  18a	H	1.37	1.28	＞10	N.D.a
  18b	3-MeO	2.38	4.69	＞10	N.D.a
  18c	4-Me	3.99	7.25	＞10	N.D.a
  18d	4-Cl	1.70	0.85	8.14	0.189
  18e	3-F	1.20	1.49	＞10	N.D.a
  18f	4-F	0.36	0.55	＞10	0.051
  1 (SCH772984)		0.21	0.11	＞10	0.008
  N.D. represents not determined.

  1.3   ERK激酶活力抑制作用

  选择对肿瘤细胞增殖具有较好抑制作用的4个化合物(17a、17f、18d和18f), 检测了化合物对ERK激酶活力的影响. ERK有ERK1和ERK2两种亚型, 其同源性为88%, 在激酶活性位点的氨基酸序列是保守的, 因此, 我们根据文献^[7]的方法对磷酸化ERK2(活性形式)的激酶活力进行检测.结果如表 1所示, 四个化合物对磷酸化ERK2激酶活力均有不同程度的抑制作用, 与抑制细胞增殖作用一致.其中活性最好的是18f, 其IC₅₀达到0.051 μmol•L^－1, 表明18f对ERK2的激酶活力具有较好的抑制作用.

  1.4   化合物18f对MEK、ERK磷酸化和总MEK、ERK表达的影响

  为了研究18f对ERK磷酸化水平和上游信号通路的影响, 我们用蛋白免疫印迹(western blot)检测了MEK、ERK的磷酸化和总MEK、ERK表达水平.如图 3所示, 与阴性对照二甲基亚砜(DMSO)相比, 18f浓度依赖地降低了ERK磷酸化(p-ERK)水平, 抑制作用与阳性对照1作用相当, 但对MEK磷酸化(p-MEK)以及总MEK (t-MEK)、ERK (t-ERK)表达没有影响.上述表明, 与化合物1类似, 18f可以同时抑制ERK的激酶活力和磷酸化激活, 但对上游MEK信号没有影响.

  图 3

  

  图 3.  18f对MEK、ERK磷酸化和总MEK、EKR表达的影响

  Figure 3.  Effects of 18f on phosphorylation and total expression of ERK and MEK

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  2.   结论

  针对恶性肿瘤发生发展中的关键激酶ERK, 通过拼合原理, 设计合成了12个吗啡啉乙基苯取代和吗啡啉苯基取代的吡啶基苄基脲类化合物, 并进行了抑制细胞增殖和抑制ERK激酶活力、磷酸化的药理活性测试, 初步确定了这类化合物的构效关系.其中化合物18f对肿瘤细胞增殖和ERK激酶活力、磷酸化作用均具有较好的抑制作用.上述研究结果为研发新型吡啶基苄基脲类ERK抑制剂提供了新的先导化合物, 具有重要理论研究意义和潜在临床应用价值.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  柱色谱采用combiflash色谱系统(Teledyne ISCO Rf200)在硅胶(300~400目)上进行色谱.质谱采用安捷伦科技公司的LC-TOF型质谱仪(ESIMS)测定; 核磁共振波谱使用Bruker 400 MHz核磁共振仪测定, 内标四甲基硅烷(TMS), 溶剂CDCl₃, 所有的试剂均为市售分析纯, 使用时未进一步纯化.

  3.2   化学合成

  3.2.1   4-(2-(4-溴苯氧基)乙基)吗啉(8)的合成

  在250 mL茄型瓶中加入4-溴苯酚7 (30 mmol), 4-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐6 (30 mmol), 碳酸钾(60 mmol)以及N, N-二甲基甲酰胺(100 mL), 60 ℃下搅拌15 h, 冷却至室温后过滤旋干, 粗产物溶于200 mL乙酸乙酯中, 2 mol/L氢氧化钠洗2次, 饱和氯化钠洗2次, 无水硫酸钠干燥, 经柱分离[V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝4:1]后得到无色油状液体8^[9], 收率86.1%. ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 7.72 (d, J＝8.6 Hz, 2H), 6.87 (d, J＝8.6 Hz, 2H), 3.84 (t, J＝4.8 Hz, 4H), 3.21 (t, J＝4.8 Hz, 4H), 1.32 (s, 12H); HRMS (ESI) calcd for C₁₆H₂₅BNO₃ (M+H]⁺ 289.1958, found 289.1958.

  3.2.2   4-(2-(4-(4, 4, 5, 5-四甲基-1, 3, 2-二氧杂硼烷-2-基)苯氧基)乙基)吗啉(9)的合成

  在封管中加入化合物8 (10 mmol), 醋酸钾(48 mmol), 联硼酸频哪醇酯(15 mmol)以及N, N-二甲基甲酰胺(50 mL), 通入氮气后加入[双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.1 mmol), 80 ℃下反应18 h.冷却后将混合物用乙酸乙酯稀释, 再依次用水和饱和氯化钠洗涤, 无水硫酸钠干燥, 经柱分离[V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝1:1]后得到褐色油状液体9, 收率81.2%, ¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ: 61.33 (s, 12H), 2.56~2.59 (t, J＝4.6, 4H), 2.8~2.9 (m, 2H), 3.71~3.74 (t, J＝4.7, 4H), 4.13~4.14 (m, 2H), 6.88~6.90 (d, J＝8.5, 2H), 7.72~7.75 (d, J＝8.5, 2H); HRMS (ESI) calcd for C₁₈H₂₉BNO₄ [M+H]⁺ 333.2220, found 333.2222.

  3.2.3   脲的衍生物12a~12f的合成

  在0 ℃下, 将取代苄胺10 (1 mmol)加入到饱和碳酸氢钠溶液(5 mL)和二氯甲烷(5 mL)的混合物中, 然后缓慢加入三光气(0.35 mmol), 0 ℃下反应2.5 h后, 二氯甲烷萃取(10 mL×2), 合并有机层, 用饱和氯化铵和饱和氯化钠洗涤, 无水硫酸钠干燥, 过滤浓缩得到中间体11.将5-溴吡啶-2-胺(1 mmol)加入到1.5 mL四氢呋喃溶液中, 向其缓慢滴入正丁基锂(1 mmol), 加毕后再将溶于四氢呋喃(1.5 mL)的化合物11缓慢加入, 室温下搅拌过夜.反应结束后将反应液加入剧烈搅拌的水中, 分别得到脲类中间体12a~12f, 滤出固体, 未进行纯化直接用于下一步.

  3.2.4   4-(4-溴苯基)吗啉(15)的合成

  在封管中加入二溴苯14 (10 mmol), 吗啡啉13 (10 mmol), 叔丁醇钾(12 mmol), (±)-2, 2'-双-(二苯膦基)- 1, 1'-联萘(0.5 mmol)以及甲苯(50 mL), 通入氮气后加入三(二亚苄-BASE丙酮)二钯(0)(0.25 mmol), 125 ℃下反应8 h.室温冷却后过滤旋干得到褐色的固体, 经柱分离[V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝4:1]后得到白色固体15, 收率75.6%. m.p. 112.1~113.7 ℃ (m.p.^[12] 114.5~115.5 ℃); ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.35 (d, J＝8.8 Hz, 2H), 6.77 (d, J＝8.8 Hz, 2H), 3.84 (t, J＝4.8 Hz, 4H), 3.11 (t, J＝4.8 Hz, 4H); HRMS (ESI) calcd for C₁₀H₁₃- BrNO [M+H]⁺ 242.0175, found 242.0177.

  3.2.5   4-(4-(4, 4, 5, 5-四甲基-1, 3, 2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)吗啉(16)的合成

  在封管中加入化合物15 (10 mmol), 醋酸钾(20 mmol), 联硼酸频哪醇酯(20 mmol)以及N, N-二甲基甲酰胺(50 mL), 通入氮气后加入[双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.5 mmol), 125 ℃下反应8~10 h.冷却后将混合物用乙酸乙酯稀释, 再依次用水和饱和氯化钠洗涤, 无水硫酸钠干燥, 经柱分离后得到白色固体16.收率72.2%. m.p. 98.3~99.6 ℃ (m.p.^[13] 98.6~99.0 ℃); ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.52 (d, J＝8.79 Hz, 2H), 6.82~6.98 (m, 2H), 3.66~3.79 (m, 4H), 3.08~3.23 (m, 4H), 1.26 (s, 12H); HRMS (ESI) calcd for C₁₂H₁₇BrNO₂ [M+H]⁺ 286.0437, found 286.0438.

  3.2.6   目标化合物17a~17f和18a~18f的合成

  在封管中加入9或16 (1 mmol), 1-(5-溴吡啶-2-基)-3-(取代苄基)脲12a~12f (1.1 mmol), 碳酸钠(3 mmol)以及乙醇(5 mL)和水(1 mL), 通入氮气后加入二氯双[二叔丁基-(4-二甲基氨基苯基)膦]钯(II)(0.01 mmol), 60 ℃下回流3 h.冷却至室温后过滤旋干, 通过柱分离[V(石油醚):V(乙酸乙酯):V(甲醇)＝15:15:1]得到目标化合物17a~17f和18a~18f.

  1-苄基-3-(5-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡啶-2-基)脲(17a):白色固体, 收率40.3%. m.p. 129.9~131.2 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 9.86 (s, 1H), 9.21 (s, 1H), 8.31 (d, J＝2.0 Hz, 1H), 7.73 (dd, J＝8.6, 2.3 Hz, 1H), 7.45~7.39 (m, 4H), 7.37~7.32 (m, 2H), 7.29~7.27 (m, 1H), 7.00~6.96 (m, 2H), 6.93~6.89 (m, 1H), 4.66 (d, J＝5.7 Hz, 2H), 4.16 (t, J＝5.6 Hz, 2H), 3.78~3.73 (m, 4H), 2.84 (t, J＝5.6 Hz, 2H), 2.65~2.57 (m, 4H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 158.4, 156.7, 152.3, 143.7, 139.4, 136.5, 130.2, 129.6, 128.5, 127.6, 127.3, 127.0, 115.2, 112.1, 66.9, 65.9, 57.6, 54.1, 43.7; HRMS (ESI) calcd for C₂₅H₂₉N₄O₃ [M+H]⁺ 433.2234, found 433.2238.

  1-(3-甲氧基苄基)-3-(5-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡啶-2-基)脲(17b):白色固体, 收率36.7%. m.p. 146.5~147.8 ℃; ¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 9.81 (s, 1H), 8.32 (d, J＝2.0 Hz, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.75 (dd, J＝8.5, 2.4 Hz, 1H), 7.44~7.41 (m, 2H), 7.28~7.24 (m, 1H), 7.00~6.97 (m, 3H), 6.95~6.94 (m, 1H), 6.82~6.79 (m, 2H), 4.62 (d, J＝5.8 Hz, 2H), 4.15 (t, J＝5.7 Hz, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.76~3.73 (m, 4H), 2.83 (t, J＝5.7 Hz, 2H), 2.61~2.58 (m, 4H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 159.9, 158.5, 156.4, 152.1, 143.7, 141.0, 136.5, 130.2, 129.7, 129.5, 127.6, 119.6, 115.2, 113.0, 112.5, 112.0, 66.9, 66.0, 57.6, 55.2, 54.1, 43.7; HRMS (ESI) calcd for C₂₆H₃₁N₄O₄ [M+H]⁺ 463.2340, found 463.2342.

  1-(4-甲基苄基)-3-(5-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡啶-2-基)脲(17c):白色固体, 收率43.6%. m.p. 179.4~180.7 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 9.82~9.74 (m, 1H), 9.37 (s, 1H), 8.30 (d, J＝2.3 Hz, 1H), 7.72 (dd, J＝8.6, 2.4 Hz, 1H), 7.45~7.40 (m, 2H), 7.31~7.28 (m, 2H), 7.17~7.13 (m, 2H), 7.00~6.96 (m, 2H), 6.96~6.92 (m, 1H), 4.61 (d, J＝5.7 Hz, 2H), 4.15 (t, J＝5.7 Hz, 2H), 3.77~3.73 (m, 4H), 2.83 (t, J＝5.7 Hz, 2H), 2.62~2.58 (m, 4H), 2.33 (s, 3H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 158.4, 156.4, 152.2, 143.8, 136.6, 136.5, 136.3, 130.3, 129.6, 129.2, 127.6, 127.3, 115.2, 111.9, 66.9, 66.0, 57.6, 54.1, 43.5, 21.1; HRMS (ESI) calcd for C₂₆H₃₁N₄O₃ [M+H]⁺ 447.2391, found 447.2395.

  1-(4-氯苄基)-3-(5-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡啶- 2-基)脲(17d):白色固体, 收率39.5%. m.p. 154.6~155.9 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 9.94 (s, 1H), 8.99~8.98 (m, 1H), 8.33 (d, J＝2.2 Hz, 1H), 7.75 (dd, J＝8.6, 2.4 Hz, 1H), 7.44~7.42 (m, 2H), 7.33~7.27 (m, 1H), 7.18~7.16 (m, 1H), 7.13~7.10 (m, 1H), 7.00~6.97 (m, 2H), 6.95~6.92 (m, 1H), 6.89~6.87 (m, 1H), 4.64 (d, J＝5.9 Hz, 2H), 4.15 (t, J＝5.7 Hz, 2H), 3.77~3.72 (m, 4H), 2.83 (t, J＝5.7 Hz, 2H), 2.63~2.57 (m, 4H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 158.5, 156.8, 152.2, 143.6, 138.0, 136.5, 132.7, 130.2, 129.7, 128.7, 128.6, 127.6, 115.2, 112.1, 66.9, 66.0, 57.6, 54.1, 43.1; HRMS (ESI) calcd for C₂₅H₂₈ClN₄O₃ [M+H]⁺ 467.1844, found 467.1845.

  1-(3-氟苄基)-3-(5-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡啶- 2-基)脲(17e):白色固体, 收率41.8%. m.p. 132.3~134.0 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 9.94 (s, 1H), 9.50~9.42 (m, 1H), 8.32 (d, J＝2.2 Hz, 1H), 7.74 (dd, J＝8.6, 2.4 Hz, 1H), 7.47~7.40 (m, 2H), 7.33~7.26 (m, 1H), 7.18~7.16 (m, 1H), 7.14~7.11 (m, 1H), 7.01~6.96 (m, 2H), 6.95~6.92 (m, 2H), 4.64 (d, J＝5.9 Hz, 2H), 4.15 (t, J＝5.7 Hz, 2H), 3.79~3.72 (m, 4H), 2.83 (t, J＝5.7 Hz, 2H), 2.65~2.54 (m, 4H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 163.9, 162.2, 158.5, 156.5, 152.0, 143.7, 142.1, 136.6, 130.1, 129.9, 127.6, 122.8, 115.2, 114.2, 113.9, 112.0, 66.9, 66.0, 57.6, 54.1, 43.2; HRMS (ESI) calcd for C₂₅H₂₇FN₄O₃ [M+H]⁺ 451.2140, found 451.2141.

  1-(4-氟苄基)-3-(5-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡啶- 2-基)脲(17f):白色固体, 收率40.1%. m.p. 141.0~142.3 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 9.87 (s, 1H), 9.54 (s, 1H), 8.31 (d, J＝2.2 Hz, 1H), 7.73 (dd, J＝8.6, 2.3 Hz, 1H), 7.45~7.41 (m, 2H), 7.39~7.34 (m, 2H), 7.04~6.96 (m, 4H), 6.95~6.90 (m, 1H), 4.60 (d, J＝5.8 Hz, 2H), 4.15 (t, J＝5.7 Hz, 2H), 3.77~3.72 (m, 4H), 2.83 (t, J＝5.7 Hz, 2H), 2.63~2.57 (m, 4H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 162.0, 158.5, 156.5, 152.1, 143.7, 136.6, 135.2, 130.2, 129.8, 128.9, 127.6, 115.3, 115.2, 112.0, 66.9, 66.0, 57.6, 54.1, 43.1; HRMS (ESI) calcd for C₂₅H₂₈FN₄O₃ [M+H]⁺ 451.2140, found 451.2141.

  1-苄基-3-(5-(4-吗啉代苯基)吡啶-2-基)脲(18a):白色固体, 收率43.2%. m.p. 203.2~204.5 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 9.85 (s, 1H), 8.76 (s, 1H), 8.32 (d, J＝2.3 Hz, 1H), 7.75 (dd, J＝8.6, 2.4 Hz, 1H), 7.46~7.42 (m, 2H), 7.42~7.38 (m, 2H), 7.37~7.32 (m, 2H), 7.29~7.26 (m, 1H), 7.00~6.96 (m, 2H), 6.89~6.85 (m, 1H), 4.65 (d, J＝5.8 Hz, 2H), 3.91~3.86 (m, 4H), 3.23~3.19 (m, 4H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 156.4, 151.9, 150.7, 143.5, 139.6, 136.4, 129.8, 128.8, 128.5, 127.3, 127.2, 127.0, 115.9, 111.9, 66.8, 49.0, 43.7; HRMS (ESI) calcd for C₂₃H₂₅N₄O₂ [M+H]⁺ 389.1972, found 389.1972.

  1-(3-甲氧基苄基)-3-(5-(4-吗啉代苯基)吡啶-2-基)脲(18b):白色固体, 收率40.8%. m.p. 201.8~203.1 ℃; ¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 9.82 (s, 1H), 8.33 (d, J＝2.1 Hz, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.76 (dd, J＝8.5, 2.3 Hz, 1H), 7.44 (d, J＝8.7 Hz, 2H), 7.28~7.25 (m, 1H), 6.98 (d, J＝8.7 Hz, 3H), 6.95~6.94 (m, 1H), 6.82~6.79 (m, 2H), 4.62 (d, J＝5.8 Hz, 2H), 3.90~3.87 (m, 4H), 3.80 (s, 3H), 3.22~3.19 (m, 4H); ¹³C NMR (151 MHz, DMSO-d₆) δ: 159.8, 158.5, 155.3, 152.3, 150.9, 143.0, 136.0, 129.9, 129.7, 127.1, 119.6, 115.8, 113.2, 113.0, 112.4, 112.1, 66.5, 55.4, 48.7, 43.4; HRMS (ESI) calcd for C₂₄H₂₇N₄O₃ [M+H]⁺419.2078, found 419.2080.

  1-(4-甲基苄基)-3-(5-(4-吗啉代苯基)吡啶-2-基)脲(18c):白色固体, 收率42.5%. m.p. 197.1~198.2 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 9.85~9.75 (m, 1H), 9.27 (s, 1H), 8.32 (d, J＝2.2 Hz, 1H), 7.74 (dd, J＝8.6, 2.4 Hz, 1H), 7.46~7.41 (m, 2H), 7.32~7.27 (m, 2H), 7.17~7.13 (m, 2H), 7.00~6.96 (m, 2H), 6.95~6.91 (m, 1H), 4.61 (d, J＝5.7 Hz, 2H), 3.91~3.86 (m, 4H), 3.23~3.17 (m, 4H), 2.34 (s, 3H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 156.2, 151.9, 150.7, 143.6, 136.6, 136.3, 136.3, 129.8, 129.2, 128.8, 127.3, 127.2, 115.9, 111.8, 66.8, 49.0, 43.5, 21.1; HRMS (ESI) calcd for C₂₄H₂₇N₄O₂ [M+H]⁺ 403.2129, found 402.2132.

  1-(4-氯苄基)-3-(5-(4-吗啉代苯基)吡啶-2-基)脲(18d):白色固体, 收率37.8%. m.p. 180.2~181.8 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 9.91 (s, 1H), 9.30 (s, 1H), 8.33 (d, J＝2.1 Hz, 1H), 7.75 (dd, J＝8.6, 2.3 Hz, 1H), 7.46~7.42 (m, 2H), 7.35~7.28 (m, 4H), 7.00~6.96 (m, 2H), 6.89~6.85 (m, 1H), 4.60 (d, J＝5.8 Hz, 2H), 3.91~3.85 (m, 4H), 3.23~3.18 (m, 4H); ¹³C NMR (151 MHz, DMSO-d₆) δ: 151.6, 147.0, 146.0, 138.8, 133.3, 131.6, 128.0, 125.2, 124.1, 123.9, 123.9, 122.5, 111.1, 107.1, 62.0, 44.3, 38.4; HRMS (ESI) calcd for C₂₃H₂₄ClN₄O₂ [M+H]⁺ 423.1582, found 423.1587.

  1-(3-氟苄基)-3-5-(4-吗啉代苯基)吡啶-2-基)脲(18e):白色固体, 收率45.2%. m.p. 212.3~213.4 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 9.92 (s, 1H), 8.91 (s, 1H), 8.34 (d, J＝2.2 Hz, 1H), 7.76 (dd, J＝8.6, 2.3 Hz, 1H), 7.44 (d, J＝8.8 Hz, 2H), 7.33~7.26 (m, 1H), 7.16 (d, J＝7.7 Hz, 1H), 7.11 (d, J＝9.9 Hz, 1H), 6.98 (d, J＝8.9 Hz, 2H), 6.94 (dd, J＝8.3, 2.2 Hz, 1H), 6.88 (d, J＝8.4 Hz, 1H), 4.63 (d, J＝5.9 Hz, 2H), 3.91~3.86 (m, 4H), 3.23~3.18 (m, 4H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 167.5, 160.1, 157.0, 155.6, 149.0, 148.4, 140.8, 135.5, 134.1, 132.6, 131.8, 128.2, 120.6, 118.9, 118.7, 116.8, 71.2, 53.4, 47.4; HRMS (ESI) calcd for C₂₃H₂₄FN₄O₂ [M+H]⁺ 407.1878, found 407.1879.

  1-(4-氟苄基)-3-(5-(4-吗啉代苯基)吡啶-2-基)脲(18f):白色固体, 收率43.9%. m.p. 186.5~187.9 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 9.84 (s, 1H), 8.62 (s, 1H), 8.33 (d, J＝2.2 Hz, 1H), 7.76 (dd, J＝8.6, 2.4 Hz, 1H), 7.46~7.42 (m, 2H), 7.39~7.33 (m, 2H), 7.05~7.00 (m, 2H), 7.00~6.95 (m, 2H), 6.84 (d, J＝8.5 Hz, 1H), 4.59 (d, J＝5.8 Hz, 2H), 3.91~3.85 (m, 4H), 3.24~3.17 (m, 4H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 162.0, 156.2, 151.7, 150.8, 143.5, 136.5, 135.1, 130.0, 128.9, 128.6, 127.2, 115.9, 115.3, 111.8, 66.8, 49.0, 43.1; HRMS (ESI) calcd for C₂₃H₂₄FN₄O₂ [M+H]⁺ 407.1878, found 407.1882.

  3.3   化合物抑制细胞增殖活性测试

  将HCT-116细胞按5×10³个/孔接种于96孔板, 37 ℃、体积分数为5%的CO₂条件下养培养24 h, 待细胞贴壁后, 加入不同浓度的受试化合物, 继续培养48 h, 弃去培养基, 加入200 μL含0.5 mg/mL噻唑蓝(MTT)的培养基, 37 ℃下孵育4 h.弃去培养基, 每孔加入150 μL DMSO, 低速震荡10 min.酶标仪(PE VICTOR Nivo)上测定570 nm处的吸光度.每个受试化合物, 设置6个浓度梯度, 并设阴性对照组(加入空白溶剂), 计算抑制率.根据不同浓度的抑制率, 使用Graph Pad Prism软件计算半数抑制浓度(IC₅₀).

  3.4   化合物抑制ERK2激酶活性测试

  采用Z'-LYTE®激酶检测试剂盒(ThermoFisher), 应用荧光能量共振转移(FRET)的方法检测磷酸化ERK2的激酶活性.根据说明书, 在384孔板(Corning Cat. #3676)中, 加入5 µL磷酸化的ERK2激酶和底物混合物(Ser/Thr 03), 2.5 µL受试化合物, 2.5 µL腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)溶液, 震荡30 s, 室温孵育1 h后, 加入5 µL Development Reagent溶液, 震荡30 s, 室温孵育1 h.用酶标仪检测荧光强度(PE VICTOR Nivo, 激发光波长为400 nm, 发射光波长为445 nm、520 nm).设置100%磷酸化组(加入磷酸化肽段)和0%磷酸化组(不加ATP溶液)分别作为阴性和阳性对照, 根据100%磷酸化组和0%磷酸化组的荧光强度, 计算受试化合物的抑制率, 并计算IC₅₀值.

  3.5   化合物诱导细胞凋亡测试

  取对数生长期的HCT-116细胞, 加入不同浓度的化合物18f或DMSO(阴性对照), 37 ℃培养24 h, 胰蛋白酶消化细胞, 磷酸缓冲液(PBS)洗涤, 加入100 μL 1×binding buffer吹打混匀, 加入5 μL Annexin-V FITC和5 μL PI染液, 轻微震荡后室温下避光孵育15 min, 用流式细胞仪(Beckman CytoFLEX S)分析细胞凋亡.

  3.6   蛋白免疫印迹

  取对数生长期的HCT-116细胞, 加入不同浓度的化合物18f或DMSO处理24 h.加入裂解液裂解细胞, 蛋白质定量试剂盒(BCA)试剂盒测定总蛋白浓度, 加入上样缓冲液, 沸水浴5~10 min.蛋白样品经SDS-PAGE电泳后、转膜、室温封闭1 h, 加入一抗4 ℃过夜孵育, 二抗孵育后, 滴加化学发光反应液, 置于数字成像仪(Bio-Rad ChemiDoc XRS⁺)中显影, 观察结果.

  辅助材料(Supporting Information)    所有目标化合物的¹H NMR及¹³C NMR谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

  (Cheng, F.)

  
  
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  图 1  ERK小分子抑制剂的化学结构

  Figure 1  Chemical structures of small molecular ERK inhibitors

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  图 2  目标化合物的设计思路

  Figure 2  Design of targeted compounds

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  图式 1  目标化合物17a~17f和18a~18f的合成路线

  Scheme 1  Synthetic route of targeted compounds 17a~17f and 18a~18f

  Reagents and conditions: (i) K₂CO₃, DMF, 60 ℃, 15 h; (ii) bis(pinacolato)diboron, PdCl₂(dppf), KOAc, DMF, 80 ℃, 18 h; (iii) triphosgene, sat. NaHCO₃, DCM, 0 ℃, 2.5 h; (iv) 5-bromopyridin-2-amine, n-BuLi, THF, r.t., 12 h; (v) Pd(AmPhos)₂Cl₂, Na₂CO₃, EtOH, H₂O, Ar, 60 ℃, 3 h; (vi) potassium tert-butoxide, Pd₂(dba)₃, BINAP, toluene, 125 ℃, 8 h

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  图 3  18f对MEK、ERK磷酸化和总MEK、EKR表达的影响

  Figure 3  Effects of 18f on phosphorylation and total expression of ERK and MEK

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  表 1  目标化合物对细胞增殖和ERK2激酶活性的抑制作用

  Table 1.  Inhibitory effects of targeted compounds on cell proliferation and ERK2 kinase activities

  Compound	R	IC50/(μmol•L－1)
  		SW480	HCT-116	L02	ERK2
  17a	H	0.42	0.81	7.24	0.092
  17b	3-MeO	5.48	7.36	＞10	N.D.a
  17c	4-Me	＞10	＞10	＞10	N.D.a
  17d	4-Cl	6.59	8.57	9.64	N.D.a
  17e	3-F	1.29	2.34	＞10	N.D.a
  17f	4-F	1.02	0.84	6.24	0.147
  18a	H	1.37	1.28	＞10	N.D.a
  18b	3-MeO	2.38	4.69	＞10	N.D.a
  18c	4-Me	3.99	7.25	＞10	N.D.a
  18d	4-Cl	1.70	0.85	8.14	0.189
  18e	3-F	1.20	1.49	＞10	N.D.a
  18f	4-F	0.36	0.55	＞10	0.051
  1 (SCH772984)		0.21	0.11	＞10	0.008
  N.D. represents not determined.

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