English

• 硫化氢(H₂S)是一种刺激性气体, 可被人体经呼吸道吸收, 对粘膜有强烈刺激, 是一种神经毒素^[1].有报道指出H₂S也是一种内源性气体信号分子, 它可调节一系列生理反应如血管扩张、心肌保护、调节炎症等来维持细胞健康^[2].研究表明, 内源性硫化氢可影响心血管、神经、免疫、内分泌、消化系统的传导, 细胞内H₂S含量异常可能导致唐氏综合症、老年痴呆症、肝硬化和糖尿病等多种疾病^[3~5].由于H₂S在生理和病理过程中的多重作用, 近年来成为生物领域研究的热点, 因此检测H₂S具有非常重要的意义^[6].

  在H₂S检测技术手段中, 与传统方法(如色谱法^[7]、电化学分析^[8]、比色法^[9]等)相比, 荧光探针法具有选择性好、灵敏度高、对生物样品损伤小以及可实时原位检测等优势成为检测H₂S的重要手段^[10].近年来识别H₂S的荧光探针已有大量报道^[11~16], 所设计探针检测机理多从硫化氢的还原反应^[17~21]、亲核加成反应^[22~24]、金属硫化物的沉淀反应^{[25, 26]}、间二硝基苯醚硫解反应^[27~29]、模拟硒酶氧化还原反应^{[30, 31]}等入手, 可实现高效专一性识别.然而部分探针仍有一定的缺点, 如发射波长较短, 导致对细胞或生物活体样本的损伤, 因此需要开发近红外荧光探针, 可避免生物背景干扰, 最大限度地获得较高的信噪比.本工作以1, 4-二乙基-7-羟基四氢喹喔啉-6-甲醛为中间体, 设计合成一种肼二腙类长波长发射的荧光探针L (Eq. 1), 该探针可裸眼识别Cu²⁺和Co²⁺; 利用配合物L-Cu²⁺可荧光“OFF-ON”识别H₂S, 其他阴离子没有干扰; 利用分子对接程序发现分子L对2x0v蛋白有很好的结合作用, 在医药领域有潜在应用.

  (1)

  1.   结果与讨论

  1.1   探针L的荧光选择性及紫外-可见区分Cu²⁺和Co²⁺

  1, 4-二乙基-7-羟基四氢喹喔啉-6-甲醛是很好的荧光团^[32~34], 为了增加其发射波长, 我们用肼作为连接基团延长其共轭体系, 合成了肼二腙类荧光探针L (Scheme 1), 并通过NMR和质谱对其结构进行了表征.将探针L用溶剂二甲基亚砜(DMSO)配制成1×10^－5 mol/L溶液, 向探针L溶液中分别加入1.5×10^－5 mol/L的各种金属阳离子, 测试探针L荧光光谱变化.探针L的最大发射波长为610和652 nm, 达到了近红外区域, 最大吸收波长为480 nm, 红移了130 nm, 斯托克斯位移较大.当加入Cu²⁺和Co²⁺后引起L荧光淬灭(图 1a), 而加入其他金属离子L的荧光光谱没有发生明显改变, 由此可见, 探针L对Cu²⁺和Co²⁺具有良好的荧光选择性.为了区分Cu²⁺和Co²⁺, 又测试了探针L的DMSO溶液紫外-可见吸收光谱, 当加入各种不同金属阳离子后, Cu²⁺能引起最大吸收波长红移且吸光度降低约50%, Co²⁺引起最大吸收波长蓝移且吸光度降低约80%(图S5), 其他离子没有引起任何变化.在自然光下, 探针L结合Cu²⁺后溶液颜色由黄色变成粉色, 而结合Co²⁺后溶液褪成无色(图 1b), 由此可见, 通过紫外-可见光谱和裸眼即可识别Cu²⁺和Co²⁺.

  图 1

  

  图 1.  (a) 探针L的DMSO溶液(1×10^－5 mol/L)中加入不同金属阳离子(1.5×10^－5 mol/L)后荧光光谱的变化(λ_ex＝470 nm)及(b)在自然光下探针L (1×10^－5 mol/L)中加入不同阳离子的颜色变化

  Figure 1.  (a) Fluorescence change of L (1×10^－5 mol/L) after adding the different metal cations (1.5×10^－5 mol/L) in DMSO solution (λ_ex＝470 nm) and (b) the color change of L (1×10^－5 mol/L) upon addition of a variety of cations under sunlight

  1: Cu²⁺, 2: Co²⁺, 3: L, 4: Ag⁺, 5: Al³⁺, 6: Ca²⁺, 7: Cd²⁺, 8: Co²⁺, 9: Fe²⁺, 10: Fe³⁺, 11: Hg²⁺, 12: K⁺, 12: Mg²⁺, 13: Mn²⁺, 14: Na⁺, 15: Ni²⁺, 16: Pb²⁺, 17: Pd²⁺, 18: Zn²⁺

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  1.2   探针L荧光识别Cu²⁺的性能

  探针L中加入Cu²⁺后能引起荧光淬灭, 说明L与Cu²⁺可以结合形成配合物, 我们想利用配合物L-Cu²⁺识别H₂S, 因为根据软硬酸碱规则, 硫离子对Cu²⁺有更强的亲和力, 当加入硫化氢后, 硫离子结合Cu²⁺形成不溶性的CuS沉淀, 相应的荧光分子又会重新发射出荧光, 因此, 需要进一步考察探针L识别Cu²⁺的荧光性能.

  荧光滴定实验表明当Cu²⁺浓度达到1.5倍时探针L荧光淬灭完全, 利用滴定数据用origin软件进行线性拟合^[35], 得到探针L的检测限为3.46×10^－6 mol/L, 达到微摩尔级, 灵敏度较高.抗干扰实验表明除了Co²⁺外其他离子基本没有干扰, Job’s plot实验证明探针L与Cu²⁺的结合比是2:1, 说明配合物L-Cu²⁺是由两个L结合了一个Cu²⁺, 其推测的结合模式见Eq. 2, 利用L-Cu²⁺继续考察对H₂S的识别性能.

  (2)

  1.3   配合物L-Cu²⁺对阴离子的选择性

  为了使L-Cu²⁺具有更好的实用性, 我们在DMSO/HEPES (V:V＝7:3)的缓冲溶液测试了L-Cu²⁺对各种阴离子的选择性.向1×10^－5 mol/L的L-Cu²⁺溶液中分别加入5×10^－5 mol/L的各种阴离子, 测试L-Cu²⁺的荧光光谱变化.当加入HS^－后, 配合物L-Cu²⁺的荧光显著增强, 几乎达到L的发射强度(图 2), 且在365 nm紫外灯下可看到L-Cu²⁺由无荧光变成红色荧光, 而加入其他阴离子L-Cu²⁺的荧光均没有明显变化.由此可见, L-Cu²⁺对H₂S具有较好的选择性.此外, 我们测试了L-Cu²⁺中加入HS^－后溶液的高分辨质谱, 在质谱中找到了L的分子离子峰, 说明H₂S成功脱除Cu²⁺释放出探针L, 其识别机理如Eq. 2所示, 可见L-Cu²⁺可有效识别H₂S.

  图 2

  

  图 2.  配合物L-Cu²⁺溶液中加入不同阴离子后的荧光变化

  Figure 2.  Fluorescence change of L-Cu²⁺

  (1×10^－5 mol/L) after adding the different anions (5×10^－5 mol/L) in DMSO/H₂O (V:V＝7:3, HEPES, 1×10^－2 mol/L, pH＝7.4)

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  图 3

  

  图 3.  在365 nm手提式紫外灯照射下L-Cu²⁺中加入不同阴离子的荧光颜色变化

  Figure 3.  Fluorescence color change of L-Cu²⁺ (1×10^－5 mol/L) upon addition of a variety of anions under portable UV lamp at 365 nm

  1: Br^－, 2: AcO^－, 3: HS^－, 4: Cl^－, 5: ClO^－, 6: CN^－, 7:CO₃^2-, 8: F^－, 9: HPO₄^2-, 10: HCO₃^－, 11:H₂PO₄^-, 12:HSO₃^-, 13:HSO₄^-, 14: I^－, 15:N₃^-, 16:NO₂^-, 17: PPI, 18: SCN^－, 19:SO₃^2-, 20:PO₄^3-

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  1.4   配合物L-Cu²⁺对HS^－的滴定

  我们通过滴定实验来进一步了解HS^－对L-Cu²⁺荧光的影响.如图 4所示, 随着HS^－浓度的增大, 探针L-Cu²⁺荧光强度逐渐增强, 当加入5×10^－5 mol/L的HS^－时荧光强度达到最大, 继续增大HS^－的浓度也不会对其荧光强度产生明显的影响, 这说明L-Cu²⁺识别H₂S具有一定的线性关系.依据HS^－对探针L-Cu²⁺的滴定数据, 计算出配合物L-Cu²⁺的检测限为2.6×10^－4 mol/L(图 5)^[36], 说明该探针具有较好的灵敏度.

  图 4

  

  图 4.  不同浓度的HS^－对L-Cu²⁺的滴定实验

  Figure 4.  Titration experiment of L-Cu²⁺ to different concentrations of HS^－

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  图 5

  

  图 5.  配合物L-Cu²⁺识别H₂S的检测限

  Figure 5.  Detection limit of L-Cu²⁺ to H₂S

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  1.5   配合物L-Cu²⁺识别H₂S的抗干扰能力

  为了验证其他阴离子是否会对H₂S的识别产生干扰, 我们做了不同阴离子共存时L-Cu²⁺识别H₂S的抗干扰实验, 结果如图 6所示. 图 6中可看出加入19种阴离子后L-Cu²⁺的荧光没有明显变化, 而加入HS^－后19种溶液中的荧光强度都得到明显增强, 说明这些阴离子的存在对L-Cu²⁺识别H₂S没有干扰.

  图 6

  

  图 6.  L-Cu²⁺的DMSO/HEPES (V/V＝7/3)溶液中分别加入各种阴离子和随后加入HS^－的荧光强度(652 nm)变化

  Figure 6.  Fluorescence intensity (652 nm) changes of L-Cu²⁺ in DMSO/HEPES (V/V＝7/3) solution upon individual addition of miscellaneous anions and followed by further addition of HS^－

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  1.6   pH对L-Cu²⁺识别H₂S的影响

  为了进一步考察L-Cu²⁺的实用性, 我们测试了pH值对L-Cu²⁺识别H₂S的影响.从图 7中可看出L-Cu²⁺在pH值为7~13时, 荧光强度较低, 当加入HS^－时, pH在6~11时荧光增强明显, 综合两个结果, 配合物L-Cu²⁺在pH为7~11范围内能够有效选择性识别H₂S.

  图 7

  

  图 7.  配合物L-Cu²⁺和L-Cu²⁺+HS^－在不同pH值下的荧光变化(λ_ex＝470 nm)

  Figure 7.  Fluorescence changes of L-Cu²⁺ and L-Cu²⁺+HS^－ solution at the different pH (λ_ex＝470 nm)

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  1.7   配合物L-Cu²⁺识别H₂S的应用

  为了探讨L-Cu²⁺识别H₂S的实际应用, 我们将裁剪好的6张滤纸条浸入L的DMSO/HEPES溶液(V:V＝7:3, 5×10^－2 mol/L)中制备试纸条, 在空气中干燥后取5张试纸条浸入7.5×10^－2 mol/L的Cu²⁺溶液中, 晾干后取4张试纸条依次滴加10×10^－2, 15×10^－2, 20×10^－2, 25×10^－2 mol/L的HS^－溶液各20 μL, 自然晾干.从日光照片可看出含探针L的试纸条是黄色, 结合铜离子后试纸条变成褐色, 加入不同浓度的HS^－后颜色逐渐变浅, 最后变成黄色(图 8a).从荧光照片可看出, 加入铜离子的试纸条荧光淬灭, 加入低浓度的HS^－出现微弱荧光, 随着HS^－浓度的增大荧光逐渐增强, 最后恢复到探针L的橙红色荧光(图 8b).该实验表明L-Cu²⁺可裸眼和荧光快速检测H₂S, 具有一定的应用价值.

  图 8

  

  图 8.  配合物L-Cu²⁺负载到定性滤纸上检测H₂S的(a)日光照片和(b)荧光照片(365 nm手提紫外光照射)

  Figure 8.  (a) The sunlight and (b) the fluorescence image of filter paper soaked with L-Cu²⁺ to detect H₂S (irradiated by 365 nm UV light)

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  1.8   分子L对蛋白质的结合作用

  为了扩大分子L的应用范围, 我们通过Discovery Studio (DS)分子模拟软件对其蛋白质靶标进行了预测.分子L的结构被优化后, 在PharmaDB库(DS软件自带的药效团数据库)中进行靶标蛋白虚拟筛选, 得到如图 9所示结果^[37].根据拟合分数进行降序排列, 打分前5位的靶标蛋白进行归纳总结, 我们发现分子L与两个来自人类的P53蛋白拟合分数较高, 因此选择打分最高的2x0v蛋白利用DS软件中的CDOCKER程序进行分子对接.在对接结果中选取能量最低(CDOCKER energy－122.80 kJ/mol; CDOCKER interaction energy－243.37 kJ/mol)的分子构象进行2D谱图分析^[38], 从图 10b可看出分子L与LEUB145残基形成了氢键, 与PROB153残基存在π-σ相互作用, 与GLUB221残基存在π-阴离子相互作用等.这些结果说明分子L与2x0v蛋白有很好的结合作用, 其结合效果和作用机制还需要通过实验进一步验证.可见, 分子L有望在医药领域得到应用.

  图 9

  

  图 9.  DS软件预测分子L的靶蛋白图

  Figure 9.  Profiling of the predicted protein targets of molecule L via Discovery Studio

  The Y-axis represents the compound L, the X-axis indicates the predicted pharmacophore models of L. The color from blue to red represents a higher fit value and a better fit

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  图 10

  

  图 10.  分子L与2x0v蛋白晶体结构分子对接的3D模式(a)和2D模式(b)

  Figure 10.  3D docking modes (a) and 2D docking modes (b) for molecule L into protein crystal structure of 2x0v

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  2.   结论

  设计合成一种新型的具有发射波长较长、较大斯托克斯位移的荧光探针L, 对其结构进行了表征.该探针在DMSO溶液中可裸眼识别Cu²⁺和Co²⁺, 具有高度的选择性.利用探针L与Cu²⁺形成的配合物, 在DMSO/H₂O (V:V＝7:3, HEPES, 1×10^－2 mol/L, pH＝7.4)缓冲溶液中可荧光“OFF-ON”识别H₂S.试纸条实验表明L-Cu²⁺可通过裸眼和荧光双通道快速检测H₂S.此外, 利用分子模拟软件, 通过分子对接程序证明分子L对2x0v蛋白(来自人类的P53蛋白)有很好的结合作用, 进一步扩大了分子L的应用范围.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  970CRT荧光分光光度计(上海三科); pH计为PHS-25B(上海大普); SP-1900型双光束紫外分光光度计(上海光谱公司); 核磁共振光谱仪(400 MHz, Agilent公司, 美国); 液相色谱/质谱分析仪为Bruker micr OTOF-Q.

  二氯亚锡、乙二醛、硼氢化钠、冰醋酸、三氯氧磷、水合肼、铝粉、碘、无水硫酸钠等均来自阿拉丁(上海, 中国), 无需纯化即可使用; 化合物1, 4-二乙基-7-羟基四氢喹喔啉-6-甲醛按照文献[32]方法合成; 本实验所使用的溶剂均是市售分析纯, 需干燥后使用.

  3.2   合成方法

  称取1, 4-二乙基-7-羟基四氢喹喔啉-6-甲醛(468 mg, 2.0 mmol), 水合肼(50 mg, 1. 0 mmol), 将其溶于干燥的乙醇(20 mL)中, 在回流条件下, 搅拌24 h, 用薄层色谱(TLC)跟踪反应进程.反应结束后, 向反应混合物中加入60 mL蒸馏水, 析出固体, 抽滤, 并用冷乙醇洗涤沉淀3次, 得到325 mg红色粉末即为分子L, 产率为70%. m.p. 242.4~246.3 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 11.56 (s, 2H), 8.43 (s, 2H), 6.39 (s, 2H), 6.18 (s, 2H), 3.47 (s, 4H), 3.37 (q, J＝6.8 Hz, 4H), 3.25 (d, J＝6.8 Hz, 4H), 3.16 (s, 4H), 1.18 (q, J＝6.8 Hz, 12H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 160.9, 154.5, 140.8, 128.4, 112.7, 106.3, 97.2, 47.4, 45.3, 45.2, 10.9, 10.2; HRMS (ESI⁺) calcd for C₂₆H₃₆N₆O₂ 464.2900, found 464.2958.

  3.3   荧光光谱测定方法

  3.3.1   各种金属离子和阴离子溶液的配制

  用钠盐或钾盐配置所需的阴离子溶液, 用硝酸盐配置所需的金属离子溶液.以NaNO₃为例:准确称取8.5 mg NaNO₃固体, 用蒸馏水定容于10 mL容量瓶中, 充分溶解, 摇匀, 得到1×10^－2 mol/L的NaNO₃溶液, 其他阴离子(Br^－, AcO^－, Cl^－, ClO^－, CN^－, CO₃^2-, F^－, H₂PO₄^-, HCO₃^-, HPO₄^2-, HSO₃^-, HSO₄^-, I^－, N₃^-, NO₂^-, PPI, S^2－, SCN^－, HS^－, SO₃^2-, PO₄^2-)和其他金属离子(Cu²⁺, Co²⁺, Ag⁺, Al³⁺, Ca²⁺, Cd²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Hg²⁺, K⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Na⁺, Ni²⁺, Pb²⁺, Pd²⁺, Zn²⁺)的溶液均用相同方法配置, 在此基础上用蒸馏水稀释, 即可得到所需浓度的离子溶液.

  3.3.2   L-Cu²⁺溶液的配制

  称取11.6 mg分子L, 用DMSO定容于25 mL的容量瓶中, 配置成测试所需的1×10^－3 mol/L探针L溶液.向25 mL探针L溶液中加入5×10^－3 mol/L (0.75 mL) Cu²⁺水溶液, 准确量取1.0 mL上述1×10^－3 mol/L溶液, 用100 mL容量瓶加V(DMSO):V(HEPES)＝7:3缓冲溶液定容, 配制成1×10^－5 mol/L的L-Cu²⁺溶液.荧光光谱测定均在室温下进行, 样品池为石英比色皿, 识别Cu²⁺时灵敏度为3, EX狭缝宽为5, EM狭缝宽为5;识别H₂S时灵敏度为3, EX狭缝宽为10, EM狭缝宽为10, 激发波长均为470 nm.

  辅助材料(Supporting Information) 探针L的¹H NMR、¹³C NMR和HRMS谱图, L识别Cu²⁺及L-Cu²⁺识别H₂S的光谱数据及Discovery Studio预测的靶标蛋白数据.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-jour-nal.cn/)上下载.

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  图 1  (a) 探针L的DMSO溶液(1×10^－5 mol/L)中加入不同金属阳离子(1.5×10^－5 mol/L)后荧光光谱的变化(λ_ex＝470 nm)及(b)在自然光下探针L (1×10^－5 mol/L)中加入不同阳离子的颜色变化

  Figure 1  (a) Fluorescence change of L (1×10^－5 mol/L) after adding the different metal cations (1.5×10^－5 mol/L) in DMSO solution (λ_ex＝470 nm) and (b) the color change of L (1×10^－5 mol/L) upon addition of a variety of cations under sunlight

  1: Cu²⁺, 2: Co²⁺, 3: L, 4: Ag⁺, 5: Al³⁺, 6: Ca²⁺, 7: Cd²⁺, 8: Co²⁺, 9: Fe²⁺, 10: Fe³⁺, 11: Hg²⁺, 12: K⁺, 12: Mg²⁺, 13: Mn²⁺, 14: Na⁺, 15: Ni²⁺, 16: Pb²⁺, 17: Pd²⁺, 18: Zn²⁺

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  图 2  配合物L-Cu²⁺溶液中加入不同阴离子后的荧光变化

  Figure 2  Fluorescence change of L-Cu²⁺

  (1×10^－5 mol/L) after adding the different anions (5×10^－5 mol/L) in DMSO/H₂O (V:V＝7:3, HEPES, 1×10^－2 mol/L, pH＝7.4)

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  图 3  在365 nm手提式紫外灯照射下L-Cu²⁺中加入不同阴离子的荧光颜色变化

  Figure 3  Fluorescence color change of L-Cu²⁺ (1×10^－5 mol/L) upon addition of a variety of anions under portable UV lamp at 365 nm

  1: Br^－, 2: AcO^－, 3: HS^－, 4: Cl^－, 5: ClO^－, 6: CN^－, 7:CO₃^2-, 8: F^－, 9: HPO₄^2-, 10: HCO₃^－, 11:H₂PO₄^-, 12:HSO₃^-, 13:HSO₄^-, 14: I^－, 15:N₃^-, 16:NO₂^-, 17: PPI, 18: SCN^－, 19:SO₃^2-, 20:PO₄^3-

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  图 4  不同浓度的HS^－对L-Cu²⁺的滴定实验

  Figure 4  Titration experiment of L-Cu²⁺ to different concentrations of HS^－

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  图 5  配合物L-Cu²⁺识别H₂S的检测限

  Figure 5  Detection limit of L-Cu²⁺ to H₂S

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  图 6  L-Cu²⁺的DMSO/HEPES (V/V＝7/3)溶液中分别加入各种阴离子和随后加入HS^－的荧光强度(652 nm)变化

  Figure 6  Fluorescence intensity (652 nm) changes of L-Cu²⁺ in DMSO/HEPES (V/V＝7/3) solution upon individual addition of miscellaneous anions and followed by further addition of HS^－

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  图 7  配合物L-Cu²⁺和L-Cu²⁺+HS^－在不同pH值下的荧光变化(λ_ex＝470 nm)

  Figure 7  Fluorescence changes of L-Cu²⁺ and L-Cu²⁺+HS^－ solution at the different pH (λ_ex＝470 nm)

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  图 8  配合物L-Cu²⁺负载到定性滤纸上检测H₂S的(a)日光照片和(b)荧光照片(365 nm手提紫外光照射)

  Figure 8  (a) The sunlight and (b) the fluorescence image of filter paper soaked with L-Cu²⁺ to detect H₂S (irradiated by 365 nm UV light)

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  图 9  DS软件预测分子L的靶蛋白图

  Figure 9  Profiling of the predicted protein targets of molecule L via Discovery Studio

  The Y-axis represents the compound L, the X-axis indicates the predicted pharmacophore models of L. The color from blue to red represents a higher fit value and a better fit

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  图 10  分子L与2x0v蛋白晶体结构分子对接的3D模式(a)和2D模式(b)

  Figure 10  3D docking modes (a) and 2D docking modes (b) for molecule L into protein crystal structure of 2x0v

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