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• 茜草科(Rubiaceae)乌檀属(Nauclea)植物全世界约有35种, 主要分布于热带亚洲、非洲和大洋洲.乌檀属植物中存在着大量结构新颖的吲哚生物碱类化合物, 具有广泛而显著的生物活性, 如抗肿瘤、抗炎和抗菌等活性^[1~4], 因此一直以来是天然药物化学学科的研究热点之一.我国原产的乌檀属植物仅有胆木Nauclea officinalis Pierre 1种, 集中分布于海南、广东和广西等省区^[5].胆木性味苦、寒, 具有清热解毒、消肿止痛之功效.在海南民间常用于感冒发热、肺炎、肠炎、痢疾以及脓疡等疾病的治疗.国内目前有“胆木注射液”和“胆木浸膏片”等中药制剂, 临床上用于治疗急性咽喉炎、急性扁桃腺炎、急性结膜炎及上呼吸道感染.本课题组一直致力于从热带药用植物中发现新的抗肿瘤活性物质, 尤其是从具有海南特色的热带药用植物中发现结构新颖的抗肿瘤活性物质.本课题组在前期研究中发现胆木枝叶的乙醇提取液对人肺癌细胞株A549和人结肠癌细胞株SW480表现出了较为显著的生长抑制活性.对人肺癌细胞株A549和人结肠癌细胞株SW480的生长抑制活性的IC₅₀值分别为5.28和12.02 μg/mL.为了进一步探明胆木的抗肿瘤药效物质基础, 并发现结构新颖的抗肿瘤活性物质, 本研究对胆木枝叶的乙醇提取物中的化学成分进行了系统研究, 截止目前已经分离得到了4个吲哚生物碱类化合物, 分别鉴定为nauclofficine (1)、naucleamide A (2)、naucleamide D (3)和latifoliamide A (4).其中化合物1为新生物碱, 化合物2~4为首次从胆木中分离得到的化合物.此外, 我们对化合物1~4的体外细胞毒活性进行了评价, 结果表明化合物1~4对HL-60, A549, SMMC-7721, MCF-7和SW480等5种人肿瘤细胞株均表现出了显著的生长抑制活性.本文旨在报道这些化合物的的提取分离, 结构鉴定以及它们的细胞毒活性.

  1.   结果与讨论

  化合物1为淡黄色无定形粉末, 改良碘化铋钾反应阳性; 比旋光度$[\alpha]_{\rm{D}}^{{\rm{25}}}$为－98.2 (c 0.12, CH₃OH); 化合物1的HRESIMS谱给出化合物的分子式为C₂₀H₂₂N₂O₃ (m/z: 361.1514 [M+Na]⁺, calcd 361.1523), 不饱和度为11;在UV光谱中, 最大吸收峰λ_max (log ε)分别在231 (4.72)和286 (3.26) nm, 说明化合物1为吲哚生物碱类化合物^{[6, 7]}.在化合物1的IR光谱中显示出了羟基和氨基(3428 cm^-1)、共轭的醛羰基(1698 cm^-1)、酰胺羰基(1648 cm^-1)和苯环(1592和1456 cm^-1)的特征吸收峰.在化合物1的¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆)谱中, 低场区存在1个尖锐的单峰质子信号, 化学位移为δ_H 10.95 (s, 1H), 提示化合物的结构中存在1个仲氨基结构单元, 进一步说明化合物1为吲哚生物碱类化合物.低场区存在1个尖锐的化学位移为δ_H 9.40 (1H, s)的单峰质子信号, 提示化合物的结构中存在1个醛基结构, 且¹³C NMR谱中存在的典型的醛羰基碳信号δ_C 196.0进一步支持了以上推断.低场区存在4个相互偶合的芳香质子信号δ_H 7.39 (d, J＝7.8 Hz, 1H, H-9), 6.97 (dd, J＝7.8, 7.6 Hz, 1H, H-10), 7.05 (dd, J＝8.0, 7.6 Hz, 1H, H-11)和7.31 (J＝8.0 Hz, 1H, H-12), 提示化合物的结构中存在一个邻二取代苯环.此外, 在化合物1的¹H NMR谱低场区还存在一个烯氢质子信号, δ_H 6.87 (q, J＝7.0 Hz, 1H), 提示化合物的结构中存在一个三取代双键结构单元.化合物1的¹³C NMR和DEPT谱提示, 化合物1结构中含有20个碳原子, 包括12个sp²杂化碳原子, 3个sp³杂化次甲基碳原子, 4个sp³杂化亚甲基碳原子和1个sp³杂化甲基碳原子. 12个sp²碳原子可以被归属于1个吲哚环结构、1个三取代的双键、一个醛羰基和1个酰胺羰基(表 1).上述数据表明化合物1的化学结构与naucleamide A (2)的化学结构是极其相似的, 它们的化学结构的主要区别在于C-20上的取代基是羟甲基基团还是醛基基团.和naucleamide A (2)相比, 化合物1的C-21在¹³C NMR谱中处于较低场, 它的化学位移值为δ_C 196.0 (C-21), 说明化合物1为naucleamide A (2)的C-20上的羟甲基基团被氧化成醛基基团的衍生物, 而且, H-15和H-19与C-21 (δ_C 196.0)的HMBC相关, 以及H-21与C-15 (δ_C 29.2), C-19 (δ_C 143.8)和C-20 (δ_C 154.1)的HMBC相关进一步证实了以上推断^[6].详细的2D NMR相关分析(包括HSQC、HMBC、¹H-¹H COSY和ROESY谱)确证了化合物1的平面结构, 如图 2所示.化合物1的相对构型是由它的ROESY相关和¹H-¹H偶合常数确定的.在化合物1的ROESY谱中, H-19和H-21的ROESY相关说明C-19与C-20之间的双键为E式构型.此外, N₁-H和H-16与H-3和H-14a的NOESY相关以及H-15与H-14β、H₂-17和17-OH的NOESY相关, 连同¹H-¹H偶合常数(J_{3, 14a}＝6.0 Hz, J_{3, 14β}＝3.8 Hz, J_{14a, 15}＝11.2 Hz和J_{15, 16}＝10.8 Hz)说明H-3和H-16为α取向, 而H-15为β取向^[6].至此, 确定了化合物1的化学结构, 如图 1所示, 并命名为nauclofficine.

  表 1

  

  表 1  化合物1的NMR数据(DMSO-d₆)

  Table 1.  NMR spectral data of compound 1 (DMSO-d₆)

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  Position	δH (J in Hz)a	δCb
  2		134.4 s
  3	4.89 (dd, J＝6.0, 3.8 Hz, 1H)	52.6 d
  5α	4.80 (ddd, J＝12.3, 5.6, 5.2 Hz, 1H)	41.4 t
  5β	2.92 (ddd, J＝12.3, 5.2, 4.2 Hz, 1H)
  6α	2.75 (m, 1H)	20.7 t
  6β	2.63 (m, 1H)
  7		108.3 s
  8		126.8 s
  9	7.39 (d, J＝7.8 Hz, 1H)	117.6 d
  10	6.97 (dd, J＝7.8, 7.6 Hz, 1H)	118.6 d
  11	7.05 (dd, J＝8.0, 7.6 Hz, 1H)	120.9 d
  12	7.31 (d, J＝8.0 Hz, 1H)	111.2 d
  13		136.0 s
  14α	2.55 (ddd, J＝14.2, 11.2, 6.0 Hz, 1H)	28.8 t
  14β	2.23 (ddd, J＝14.2, 4.0, 3.8 Hz, 1H)
  15	3.01 (m, 1H)	29.2 d
  16	2.82 (ddd, J＝10.8, 5.2, 4.0 Hz, 1H)	45.2 d
  17α	3.77 (ddd, J＝11.2, 4.8, 4.0 Hz, 1H)	59.5 t
  17β	3.20 (ddd, J＝11.2, 5.2, 4.8 Hz, 1H)
  18	1.84 (d, J＝7.0 Hz, 3H)	14.5 q
  19	6.87 (q, J＝7.0 Hz, 1H)	143.8 d
  20		154.1 s
  21	9.40 (s, 1H)	196.0 d
  22		170.2 s
  N1-H	10.95 (s, 1H)
  17-OH	4.35 (d, J＝4.8 Hz, 1H)
  a Measured at 400 MHz. b Measured at 100 MHz..

  图 2

  

  图 2.  Nauclofficine (1)的选择性的2D NMR相关

  Figure 2.  Selected 2D NMR correlations for nauclofficine (1)

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  图 1

  

  图 1.  化合物1~4的化学结构

  Figure 1.  Chemical structures of compounds 1~4

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  化合物2~4为已知的吲哚生物碱类化合物, 经波谱分析并与文献中相应化合物的波谱数据进行对照, 将它们分别鉴定为naucleamide A (2)^[6]、naucleamide D (3)^[6]和latifoliamide A (4)^[7].

  采用噻唑蓝(MTT)法, 以HL-60(人原髓细胞白血病细胞), A549(人肺癌细胞), SMMC-7721(人肝癌细胞), MCF-7 (人乳腺癌细胞)和SW480 (人结肠癌细胞)等5种常见人肿瘤细胞株为活性评价细胞株, 以顺铂为阳性对照药物, 对化合物1~4的体外细胞毒活性进行了评价.实验结果表明, 化合物1~4对这5种肿瘤细胞株均显示出了显著的生长抑制活性, 它们对这些肿瘤细胞株的细胞毒活性与阳性对照药顺铂的活性相当.而且, 对于某些细胞株的细胞毒活性强于阳性对照药物顺铂的活性, 具体活性数据如表 2所示.据我们所知, 截止目前关于与化合物1~4化学结构类似的吲哚生物碱的细胞毒活性报道较罕见, 仅泰国学者从乌檀属植物东方乌檀中分离鉴定了两个吲哚生物碱类化合物, naucleaoral A和naucleaoral B, 它们具有与化合物1相似的化学结构, 并且同样表现出了显著的细胞毒活性^[2].这些研究结果表明, 具有显著的细胞毒活性的吲哚生物碱的发现对于研究开发新型抗肿瘤药物可能具有重要意义.

  表 2

  

  表 2  化合物1~4对肿瘤细胞的生长抑制活性^a

  Table 2.  Cytotoxic activities of compounds 1~4

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  化合物	IC50/(μg•mL-1)b
  	HL-60	SMMC-7721	A-549	MCF-7	SW480
  1	1.08±0.05	2.32±0.17	3.09±0.13	1.37±0.09	2.87±0.08
  2	3.15±0.13	8.36±0.21	12.03±0.11	5.24±0.12	4.18±0.10
  3	2.68±0.09	3.26±0.12	6.67±0.18	5.19±0.11	7.24±0.12
  4	2.17±0.08	7.21±0.23	9.18±0.15	3.25±0.07	5.97±0.16
  Cisplatinc	1.58±0.07	13.69±0.12	17.02±0.16	22.65±0.17	28.24±0.32
  a所有结果用平均值+标准差来表示, 每组实验平行测定三次. b IC50为50%生长抑制浓度. c顺铂为阳性对照.

  2.   实验部分

  2.1   仪器与试剂

  JASCO DIP-370型数字旋光仪; Beckman DU640分光光度仪; Bio-Rad FTS-135型红外光谱仪; Bruker AV-400型核磁共振波谱仪(TMS为内标); Agilent G3250AA LC/MSD TOF质谱仪; Waters Micromass Q-TOF Micro System质谱仪; Waters 600半制备型高效液相色谱仪, Waters Spherisorb^®ODS2分析型色谱柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm), Waters Spherisorb^®ODS2制备型色谱柱(5 μm, 20 mm×250 mm); 葡聚糖凝胶Sephadex LH-20[安法玛西亚技术(上海)有限公司]; 反相硅胶RP-18 (Merck公司); 柱层析硅胶和薄层层析硅胶板(青岛海洋化工厂).

  2.2   植物标本

  胆木枝叶于2015年5月采集于海南省昌江县霸王岭国家森林公园, 经海南师范大学热带药用植物化学教育部重点实验室付艳辉研究员鉴定为茜草科乌檀属植物胆木Nauclea officinalis Pierre的枝叶, 凭证标本(标本号: 20150508)保存于海南师范大学热带药用植物化学教育部重点实验室植物标本室.

  2.3   提取与分离

  将阴干的胆木枝叶(30.0 kg)粉碎后用85%乙醇浸泡提取三次, 每次提取一周, 合并提取液后浓缩至无醇味得总提取物, 总提取物加水混悬后分别依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取, 回收溶剂后得石油醚萃取部位(869.8 g)和乙酸乙酯萃取部位(762.6 g).乙酸乙酯萃取部位(760.0 g)经硅胶(100~200目)柱色谱分离, 以氯仿-甲醇(100:0→0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱, 合并相同流分, 得到5个流分Fr.E1~Fr.E5, Fr.E3 (63.2 g)经反相硅胶柱色谱分离, 以甲醇-水(V:V＝50:50→100:0)为洗脱剂进行梯度洗脱, 合并相同流份, 得到7个亚流分Fr.E3A~Fr.E3G. Fr.E3B经SephadexLH-20柱色谱(甲醇)进一步纯化后, 经制备型高效液相色谱[Waters Spherisorb^®ODS2制备型色谱柱, 20 mm×250 mm, 5 μm, CH₃OH/H₂O (V:V＝70:30), 13.0 mL/min, t_R 28.2, 36.8, 39.7和48.2 min]制备得到化合物1 (32.1 mg)、2 (43.6 mg)、3 (26.9 mg)和4 (17.2 mg).

  2.4   波谱数据

  Nauclofficine (1):淡黄色无定形粉末, $[\alpha]_{\rm{D}}^{{\rm{25}}}$－98.2 (c 0.12, CH₃OH); UV (CH₃OH) λ_max (log[ε/(L•mol^-1• cm^-1)]) 231 (4.72), 286 (3.26) nm; ECD (0.00018 M, CH₃OH) λ_max ε/(L•mol^-1•cm^-1): 218 (－4.26), 236 (－16.23), 252 (－12.78) nm]; ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d₆)和¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆)数据见表 1; IR (KBr) v_max: 3428, 2917, 2721, 1698, 1648, 1592, 1456 cm^-1; HRESIMS calcd for C₂₀H₂₂N₂O₃Na [M+Na]⁺ 361.1523, found 361.1514.

  2.5   活性筛选

  MTT法评价化合物的抗肿瘤活性^{[8, 9]}:取含10%胎牛血清的培养液(DMEM或者RMPI1640)配成单个细胞悬液, 以每孔5000~10000个细胞接种到96孔板, 每孔体积100 μL, 加入待测化合物溶液(用细胞培养液溶解样品, 固定样品浓度为40 μmol/L初筛, 在该浓度对肿瘤细胞生长抑制率在50%以上的化合物设5个浓度进行梯度复筛, 每孔终体积200 μL, 每种处理均设3个复孔. 37 ℃培养48 h后, 吸弃孔内培养上清液, 每孔加MTT溶液20 μL以及培养液100 μL.继续孵育1~4 h, 使反应充分进行.研究中顺铂被用作阳性对照药.选择490 nm波长, 酶联免疫检测仪(Bio-Rad 680)读取各孔光吸收值, 记录结果, 以浓度为横坐标, 细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线, 应用两点法计算化合物的IC₅₀值.

  辅助材料(Supporting Information)  新化合物1的¹H NMR、¹³C NMR、HSQC、HMBC、¹H-¹H COSY、ROESY和HRESIMS谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

• 1. [1]

     Haudecoeur, R.; Peuchmaur, M.; Pérès, B.; Rome, M.; Taïwe, G. S.; Boumendjel, A.; Boucherle, B. J. Ethnopharmacol. 2018, 212, 106. doi: 10.1016/j.jep.2017.10.011

  2. [2]

     Sichaem, J.; Surapinit, S.; Siripong, P.; Khumkratok, S.; Jong-ara-mruang, J.; Tip-pyang, S. Fitoterapia 2010, 81, 830. doi: 10.1016/j.fitote.2010.05.004

  3. [3]

     Sun, J.; Lou, H.; Dai, S.; Xu, H.; Zhao, F.; Liu, K. Phytochemistry 2008, 69, 1405. doi: 10.1016/j.phytochem.2008.01.008

  4. [4]

     Li, N.; Cao, L.; Cheng, Y.; Meng, Z. Q.; Tang, Z. H.; Liu, W. J.; Wang, Z. Z.; Ding, G.; Xiao, W. Pharm. Biol. 2014, 52, 1445. doi: 10.3109/13880209.2014.895910

  5. [5]

     中国科学院中国植物志编委会, 中国植物志, Vol. 71(1), 科学出版社, 北京, 1999, p. 260.Flora Reipublicae Popularis Sinicae Editorial Board Flora Reipublicae Popularis Sinicae, Vol. 71(1), Science Press, Beijing, 1999, p. 260 (in Chinese).

  6. [6]

     Shigemori, H.; Kagata, T.; Ishiyama, H.; Morah, F.; Ohsaki, A.; Kobayashi, J. I. Chem. Pharm. Bull. 2003, 51, 58. doi: 10.1248/cpb.51.58

  7. [7]

     Agomuoh, A. A.; Ata, A.; Udenigwe, C. C.; Aluko, R. E.; Irenus, I. Chem. Biodiversity 2013, 10, 401. doi: 10.1002/cbdv.v10.3

  8. [8]

     Fu, Y. H.; Di, Y. T.; He, H. P.; Li, S. L.; Zhang, Y.; Hao, X. J. J. Nat. Prod. 2014, 77, 57. doi: 10.1021/np4005823

  9. [9]

     Ma, Y. L.; Liu, Y. P.; Zhang, C.; Zhao, W. H.; Shi, S.; He, D. N.; Zhang, P.; Liu, X. H.; Han T. T.; Fu, Y. H. Bioorg. Chem. 2018, 76, 359. doi: 10.1016/j.bioorg.2017.12.016

• 

  图 2  Nauclofficine (1)的选择性的2D NMR相关

  Figure 2  Selected 2D NMR correlations for nauclofficine (1)

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  图 1  化合物1~4的化学结构

  Figure 1  Chemical structures of compounds 1~4

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  表 1  化合物1的NMR数据(DMSO-d₆)

  Table 1.  NMR spectral data of compound 1 (DMSO-d₆)

  Position	δH (J in Hz)a	δCb
  2		134.4 s
  3	4.89 (dd, J＝6.0, 3.8 Hz, 1H)	52.6 d
  5α	4.80 (ddd, J＝12.3, 5.6, 5.2 Hz, 1H)	41.4 t
  5β	2.92 (ddd, J＝12.3, 5.2, 4.2 Hz, 1H)
  6α	2.75 (m, 1H)	20.7 t
  6β	2.63 (m, 1H)
  7		108.3 s
  8		126.8 s
  9	7.39 (d, J＝7.8 Hz, 1H)	117.6 d
  10	6.97 (dd, J＝7.8, 7.6 Hz, 1H)	118.6 d
  11	7.05 (dd, J＝8.0, 7.6 Hz, 1H)	120.9 d
  12	7.31 (d, J＝8.0 Hz, 1H)	111.2 d
  13		136.0 s
  14α	2.55 (ddd, J＝14.2, 11.2, 6.0 Hz, 1H)	28.8 t
  14β	2.23 (ddd, J＝14.2, 4.0, 3.8 Hz, 1H)
  15	3.01 (m, 1H)	29.2 d
  16	2.82 (ddd, J＝10.8, 5.2, 4.0 Hz, 1H)	45.2 d
  17α	3.77 (ddd, J＝11.2, 4.8, 4.0 Hz, 1H)	59.5 t
  17β	3.20 (ddd, J＝11.2, 5.2, 4.8 Hz, 1H)
  18	1.84 (d, J＝7.0 Hz, 3H)	14.5 q
  19	6.87 (q, J＝7.0 Hz, 1H)	143.8 d
  20		154.1 s
  21	9.40 (s, 1H)	196.0 d
  22		170.2 s
  N1-H	10.95 (s, 1H)
  17-OH	4.35 (d, J＝4.8 Hz, 1H)
  a Measured at 400 MHz. b Measured at 100 MHz..

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  表 2  化合物1~4对肿瘤细胞的生长抑制活性^a

  Table 2.  Cytotoxic activities of compounds 1~4

  化合物	IC50/(μg•mL-1)b
  	HL-60	SMMC-7721	A-549	MCF-7	SW480
  1	1.08±0.05	2.32±0.17	3.09±0.13	1.37±0.09	2.87±0.08
  2	3.15±0.13	8.36±0.21	12.03±0.11	5.24±0.12	4.18±0.10
  3	2.68±0.09	3.26±0.12	6.67±0.18	5.19±0.11	7.24±0.12
  4	2.17±0.08	7.21±0.23	9.18±0.15	3.25±0.07	5.97±0.16
  Cisplatinc	1.58±0.07	13.69±0.12	17.02±0.16	22.65±0.17	28.24±0.32
  a所有结果用平均值+标准差来表示, 每组实验平行测定三次. b IC50为50%生长抑制浓度. c顺铂为阳性对照.

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