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• 华法林, 作为维生素K的拮抗剂, 是目前唯一广泛应用于临床、口服吸收效果最好的抗凝血药物, 特别适用于抗凝患者的长期治疗^{[1, 2]}.华法林的传统合成是以三乙胺、吡啶、喹啉等碱性物质为催化剂, 4-羟基香豆素和苄叉丙酮为底物经Michael加成获得.其中, 手性伯胺或经修饰改进的伯胺^[3~8]作为催化剂可获得理想的收率及较好的对映选择性, 但这些基于咪唑烷酮^[9]、生物碱、氨基酸衍生物和其他手性物质的有机催化剂相当昂贵^[10].除了以上有机试剂催化方法, 还有人采用金属或金属与有机双催化剂, 或者使用手性助剂^[11].可是, 有机金属催化剂却隐藏着有毒金属产物的污染等问题.而且, 金属或者有机催化剂, 常常具备以下诸多缺点:多步反应、消耗不可再生的原材料^[11](包括一些有毒物质和昂贵的材料).因此, 化学家们致力于研究获得廉价、环境友好型的绿色催化剂.

  随着绿色化学研究的推进, 我们对酶用于有机合成的研究越来越深入.酶作为一种生物可再生的、生物可降解的无环境毒害的资源^[9], 凭借其各种适宜于化学催化的特性, 得到了生化学家们的青睐.据我们了解, 到目前为止, 关于酶催化合成华法林的研究有三篇报道. Sano等^[11]用脂肪酶AS催化, 得到85%的收率及45% ee. Liu等^[12]将脂肪酶作为基质, 金属有机材料作为酶的骨架(MOFs), 催化Michael反应合成华法林, 得到了87%的收率, 但是没有对映选择性.我们小组^[13]用猪胰脂肪酶(PPL)催化合成华法林, 得到94%的收率及28% ee.以上所用的酶都是经纯化提取的.

  酶的粗提物作为一种新型的生物催化剂, 相比于分离纯化困难、耗时、昂贵的纯酶, 具备便宜易获得的特点, 并且避免了在酶的纯化过程中使用的对环境造成危害的试剂和药品, 更符合环境友好的要求^{[14, 15]}.我们发现, 蚯蚓粗提物是一种很好的生物催化剂.蚯蚓是自然界中分布较广的无害生物, 在自然界中扮演分解者的角色.蚯蚓消化道有多种水解酶, 其中蛋白酶是目前研究最透彻的.据报道, 粉正蚓中丝氨酸蛋白酶是由6种同工酶构成, 具溶解纤维蛋白的活性^[16].常文瑞院士团队^[17]分离并鉴定出7种蚯蚓纤溶酶的活性组分(组分A为丝氨酸蛋白酶).由此可知, 蚯蚓中存在一系列结构不同的蛋白酶.我们用赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)来制作蚯蚓粗提物, 并且发现蚯蚓粗提物可用于催化不对称Mannich、aldol、Henry、Biginelli反应, 以及三组分的aza-Diels-Alder (Mannich-Michael)反应合成异喹啉及其衍生物, 还可以催化domino反应合成香豆素^{[14, 15]}.可见, 蚯蚓粗提物作为简单易得的绿色催化剂, 应用前景广阔.

  因此, 我们选择蚯蚓粗提物这一天然存在的生物催化剂用于抗凝血药华法林的合成, 并获得了最优催化条件:含水量为10%, 蚯蚓粗提物100 mg, 50 ℃下反应48 h, 4-羟基香豆素与苄叉丙酮投料比为1:3时华法林的最高收率为98%, 其衍生物的收率为57%~99%, 并具有一定的对映选择性(达20% ee).

  1   结果与讨论

  我们采用之前报道的方法来制备蚯蚓粗提物^[14], 用新鲜的赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)和去离子水制成匀浆, 通过蔗糖透析浓缩, 再离心获得上清液, 干燥后研磨成粉末, 即可获得蚯蚓粗提物.我们选用4-羟基香豆素和苄叉丙酮作为模型反应(Eq. 1), 蚯蚓粗提物作为催化剂, 进行反应条件的优化.

  首先进行了溶剂的筛选.二甲亚砜作为溶剂时得到高达87%的收率及20%ee(表 1, Entry 1), 远远高出所筛选的其他溶剂的收率.水作为溶剂时仅得到3%的收率和3%的ee值(表 1, 序号10).因此, 我们选择了二甲亚砜作为该反应的最佳溶剂.在所有筛选的溶剂里, 蚯蚓粗提物呈悬浮状, 是一个非均相的反应体系.

  表 1  溶剂对蚯蚓粗提物催化Michael反应的影响^a Table 1.  Influence of solvents on the crude earthwarm extract catalyzed-Michael reaction

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  接着, 探究了蚯蚓粗提物的量对华法林合成的影响.随着蚯蚓粗提物量的增加, 收率和对映选择性也有所增加(表 2, Entries 1~5).蚯蚓粗提物的量为100和110 mg时, 收率最高, 为87%(表 2, Entries 10和11).但当蚯蚓粗提物的量超过110 mg时, 收率减少(表 2, Entries 12和13).原因可能是蚯蚓粗提物在溶剂中呈悬浮状, 过量会影响反应的进行.因此, 选择100 mg蚯蚓粗提物为最佳用量.

  表 2  蚯蚓粗提物的量对Michael反应的影响^a Table 2.  Effects of amount of crude earthwarm extract on the Michael reaction ^a

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  探讨了含水量对蚯蚓粗提物催化合成华法林反应的影响.体系中含水量对收率和对映选择性均有明显影响.随着含水量的增加, 收率有所增加, ee也有所增加(表 3, Entryies 1~3).当含水量为10%的时候, 得到最高产率87%及20% ee(表 3, Entry 4).但是之后随着含水量的增加, 收率和ee明显下降, 可能是在含水量高的体系中, 底物的溶解性下降造成的.因此选择10%的含水量作为最优反应条件.

  表 3  含水量对蚯蚓粗提物催化的Michael反应的影响^a Table 3.  Effects of water content on the crude earthwarm extract catalyzed-Michael reaction

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  接着探讨了投料比对反应的影响.当投料比1:2a为1:1时, 收率仅为59%, ee为22%(表 4, Entry 1), 增加投料比至1:3, 收率提高到87%, ee无明显变化(表 4, Entry 3).继续增加投料比, 收率变化不大, 考虑到收率和原料的经济性, 我们最终选择1:3 (1:2a)作为最佳投料比.

  表 4  底物投料比对蚯蚓粗提物催化的Michael反应的影响^a Table 4.  Influence of mole ratio of substrates on the crude earthwarm extract catalyzed-Michael reaction ^a

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  温度会影响酶的生物活性和稳定性, 因此温度在酶催化的反应中也是一个重要的因素.每一种酶对温度的敏感程度和最适催化温度都不同, 有的耐高温, 有的能耐受其他极端环境.接下来我们探究了温度对蚯蚓粗提物催化的Michael反应的影响.由表 5可知, 从15到50 ℃, 该反应收率随温度升高而有所增加.温度升高到50 ℃时, 可获得最高收率97%(表 5, Entry 6).但与之相反的是, ee值随温度升高呈下降趋势.但温度升高到60 ℃时, 收率有所下降.可能是温度过高而造成酶的活力下降所致.在25和60 ℃之间收率相差不大, 说明我们使用的蚯蚓提取物中的酶在这个温度下能保持稳定. Nakajima等^[16]报道了粉正蚓中的碱性丝氨酸蛋白酶在60 ℃以下, pH 2~11条件下都能保持稳定性, 并且对有机溶剂和去垢剂都有较好的耐受性, 在室温条件下储存多年均保持其活性; Zhao等^[18]的研究表明, 蚯蚓纤溶酶是一种热稳定性非常好的蛋白水解酶, 在50 ℃以下可以长期保持活性.所以, 最终选择50 ℃作为最佳反应温度.

  表 5  温度对蚯蚓粗提物催化的Michael反应的影响^a Table 5.  Effects of temperature on the crude earthwarm extract catalyzed-Michael reaction ^a

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  为了探究蚯蚓粗提物在Michael反应中的作用, 我们开展了一系列对照实验.首先, 在无催化剂的条件下, 空白实验只检测到痕量的产物生成(表 6, Entry 1).在蚯蚓粗提物催化下得到的97%收率和14% ee(表 6, Entry 2), 表明蚯蚓粗提物确实催化了该Michael反应.由于蚯蚓消化道内存在大量丝氨酸蛋白酶, 因此使用丝氨酸蛋白酶的抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)^[19]预处理蚯蚓粗提物, 经PMSF处理过的蚯蚓粗提物用于催化模型反应, 得到63%收率和3% ee(表 6, Entry 3). PMSF本身对该Michael反应也有一定的催化作用, 用等量的PMSF催化得到43%收率(表 6, Entry 4).除去PMSF的影响, 可以推测PMSF抑制的蚯蚓粗提物参与的催化只有20%的收率, 相比较于未经抑制的蚯蚓粗提物催化得到的97%收率, PMSF显著地抑制了蚯蚓粗提物的活性, 使收率下降了77%.上述实验表明, 蚯蚓粗提物确实催化了该Michael反应.最后, 对蚯蚓粗提物进行了蛋白酶活力测定(测定蛋白酶的水解活性).采用Sigma公司提供的酪蛋白为底物的蛋白酶活力测定实验方法, 测得蚯蚓粗提物的蛋白酶活力为0.1 U/mg (1961年世界生物化学协会酶学委员会用国际单位U来定义酶的活性, 定义为在一定的标准条件下, 1 U即每分钟催化1 mol底物的酶量^[20]).酶活实验表明, 蚯蚓粗提物中确实含有蛋白酶.

  表 6  对照实验^a Table 6.  Control experiments

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  接着, 探究了反应时间对蚯蚓粗提物催化的Michael反应的影响.在反应时间为24、36、48 h下, 模型反应分别得到71%、83%、98%的收率, 随着时间的延长, ee变化不大(13%~15%).这一实验表明, 在优化的条件下模型反应在48 h的时候已经进行得很充分.

  在此基础上, 我们对蚯蚓粗提物催化的Michael反应进行了底物的扩展.考察了不同取代的苄叉丙酮作为底物时的情况.发现, 无论苯环上取代的是供电子还是吸电子基团, 都能得到满意的收率.其中, 无取代的苄叉丙酮得到最高收率98%(表 7, Entry 1). 3-甲氧基苄叉丙酮得到91%的收率(表 7, Entry 3), 但是2-和4-甲氧基苄叉丙酮得到收率较低(表 7, Entries 2和4), 可能是由于甲氧基推电子的共轭效应所致. 2-和3-氯取代苄叉丙酮得到收率较4-氯取代苄叉丙酮高(表 7, Entries 5~7).氟取代的苄叉丙酮也能得到较好的收率(表 7, Entries 8~10).该方法还适用于萘取代的烯酮, 得到高达99%的收率和16%的ee(表 7, Entry 11).说明蚯蚓粗提物催化Michael反应的普适性较好.在所考察的底物中, 对映选择性最高达到20% ee(表 7, Entry 8).所有产物均为已知化合物, 物理性质和表征数据与参考文献一致^{[4, 13, 21]}.

  表 7  蚯蚓粗提物催化的Michael反应的底物扩展^a Table 7.  Substrate scope of the crude earthwarm extract catalyzed-Michael reaction ^a

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  2   结论

  通过蚯蚓粗提物催化的Michael反应成功合成了抗凝血药华法林及其一系列衍生物, 并获得良好的收率(最高可达99%).虽然对映选择性不太理想, 但该方法以蚯蚓粗提物这一价廉易得、制备简单的天然物质作为绿色环保可再生的生物催化剂, 为华法林的合成提供了一种高效、简洁的方法.

  3   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  核磁共振波谱分析仪Bruker-AM 600(600 MHz); 显微熔点仪WPX-4(上海易测仪器设备有限公司).蚯蚓粗提物, 由我们课题组制备^[14].取代苄叉丙酮2b, 2c, 2e, 2f, 2h, 2i, 2k制备方法参见文献[22]. 2d, 2g, 2j制备方法参照文献[23].所有试剂均为分析纯市售品而未经进一步纯化.

  3.2   实验方法

  在圆底烧瓶中依次加入4-羟基香豆素(1)(0.5 mmol)、苄叉丙酮或其衍生物2 (1.5 mmol)、蚯蚓粗提物(100 mg)、二甲亚砜(0.90 mL)和水(0.10 mL), 混合物在50 ℃下搅拌反应, 通过薄层色谱(TLC)监测.待反应结束, 在反应瓶中加入乙酸乙酯(4 mL), 通过抽滤除去蚯蚓粗提物, 再用乙酸乙酯洗涤滤渣, 滤液用水洗涤, 有机相经无水硫酸钠干燥, 真空抽滤去除无水硫酸钠, 再通过减压蒸馏除去溶剂, 然后将粗产物通过柱层析纯化分离得到纯的目标产物.

  3.3   实验数据

  所有产物均为已知化合物, 物理性质和表征数据与参考文献一致^{[4, 7, 13, 21, 24]}.

  4-羟基-3-(3-氧-1-苯丁基)-苯并吡喃-2-酮(3a):得151 mg, 产率98%.白色粉末, m.p. 163~164 ℃(文献值^[7] 169~171 ℃); ¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 9.49 (br. s, 0.12H), 7.96 (d, J＝7.9 Hz, 0.18H), 7.92 (d, J＝7.9 Hz, 0.50H), 7.83 (d, J＝7.5 Hz, 0.59H), 7.58 (t, J＝7.8 Hz, 0.50H), 7.50 (d, J＝7.9 Hz, 0.68H), 7.35~7.23 (m, 7.58H), 4.74 (d, J＝8.6 Hz, 0.18H), 4.29 (dd, J＝6.4, 3.1 Hz, 0.50H), 4.19 (dd, J＝11.2, 6.9 Hz, 0.60H), 3.87 (dd, J＝19.4, 10.0 Hz, 0.19H), 3.32 (s, 0.13H), 2.58~2.40 (m, 1.75H), 2.30 (s, 0.50H), 2.03 (dd, J＝24.9, 13.0 Hz, 0.71H), 1.72 (s, 1.68H), 1.69 (s, 1.38H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 162.1, 161.0, 159.7, 158.8, 153.0, 153.0, 143.2, 141.6, 129.2, 128.6, 127.1, 127.0, 123.8, 123.6, 116.6, 116.5, 116.0, 104.2, 101.3, 100.6, 99.1, 45.2, 42.6, 40.2, 35.4, 35.0, 34.4, 30.0, 28.1, 27.6.

  4-羟基-3-[1-(2-甲氧苯基)-3-氧代丁基]-苯并吡喃-2-酮(3b):得96 mg, 产率57%.白色粉末, m.p. 181~183℃(文献值^[7] 198~199 ℃); ¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 9.15 (s, 0.38H), 7.93 (t, J＝9.3 Hz, 1.15H), 7.84 (d, J＝7.8 Hz, 0.36H), 7.72 (d, J＝7.6 Hz, 0.39H), 7.58 (t, J＝7.7 Hz, 0.79H), 7.50 (dt, J＝22.0, 7.7 Hz, 0.82H), 7.40~7.19 (m, 5.37H), 7.11~6.84 (m, 4.36H), 4.99 (dd, J＝8.2, 5.5 Hz, 0.44H), 4.60 (s, 0.34H), 4.56 (d, J＝5.9 Hz, 0.94H), 3.97 (s, 1.18H), 3.93 (s, 2.32H), 3.86 (s, 1.29H), 3.50 (s, 0.77H), 3.27 (s, 0.37H), 2.68 (dd, J＝14.5, 1.7 Hz, 0.80H), 2.51 (dd, J＝13.8, 6.9 Hz, 0.41H), 2.32 (dd, J＝14.5, 7.1 Hz, 0.80H), 2.21 (s, 1.18H), 2.06 (d, J＝6.6 Hz, 0.52H), 1.72 (s, 0.99H), 1.69 (s, 2.27H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 162.2, 161.9, 160.9, 159.7, 157.2, 157.0, 155.4, 153.0, 152.9, 152.7, 131.8, 131.5, 131.3, 129.0, 128.7, 128.0, 127.5, 126.4, 123.8, 123.8, 123.6, 123.5, 123.0, 122.6, 121.8, 121.0, 120.8, 116.6, 116.5, 116.4, 116.1, 115.7, 111.4, 111.0, 110.9, 106.3, 101.3, 100.7, 99.2, 56.2, 55.6, 55.4, 45.4, 37.1, 30.2, 29.3, 28.2, 28.1.

  4-羟基-3-[1-(3-甲氧苯基)-3-氧代丁基]-苯并吡喃-2-酮(3c)^[24]:得154 mg, 产率91%.白色粉末, m.p. 100~102℃; ¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 9.42 (s, 0.08H), 7.92 (d, J＝7.8 Hz, 0.36H), 7.84 (d, J＝7.8 Hz, 0.38H), 7.61~7.50 (m, 0.89H), 7.40~7.24 (m, 2.56H), 7.23 (d, J＝7.1 Hz, 0.39H), 6.84 (ddd, J＝38.3, 17.8, 7.8 Hz, 2.60H), 4.71 (d, J＝8.0 Hz, 0.12H), 4.29 (d, J＝4.2 Hz, 0.39H), 4.16 (dd, J＝11.2, 6.9 Hz, 0.41H), 3.84 (dd, J＝19.4, 9.9 Hz, 0.18H), 3.79 (s, 2.47H), 3.49~3.23 (m, 0.89H), 2.57 (dd, J＝14.2, 2.6 Hz, 0.39H), 2.50 (dd, J＝14.0, 6.9 Hz, 0.40H), 2.43 (dd, J＝14.2, 7.0 Hz, 0.41H), 2.31 (s, 0.30H), 2.08~1.98 (m, 0.46H), 1.74 (s, 1.13H), 1.70 (s, 1.45H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃)δ: 162.0, 161.1, 160.4, 159.8, 159.6, 158.6, 153.1, 153.0, 152.8, 144.9, 143.2, 132.0, 131.5, 130.4, 129.6, 129.2, 123.9, 123.8, 123.6, 123.1, 122.7, 120.3, 116.7, 116.5, 116.2, 115.9, 115.6, 114.4, 113.4, 111.6, 104.2, 101.1, 100.5, 99.0, 55.2, 55.2, 45.3, 42.5, 40.0, 35.4, 35.0, 34.1, 30.0, 28.2, 27.8.

  4-羟基-3-[1-(4-甲氧苯基)-3-氧代丁基]-苯并吡喃-2-酮(3d):得123 mg, 产率73%.白色粉末. m.p. 53~55℃(文献值^[7] 164~166 ℃); ¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 9.45 (s, 0.15H), 7.92 (dd, J＝17.2, 7.9 Hz, 0.60H), 7.81 (d, J＝8.0 Hz, 0.66H), 7.57 (dd, J＝11.3, 4.3 Hz, 0.49H), 7.48 (dd, J＝12.2, 4.6 Hz, 0.74H), 7.36~7.09 (m, 5.74H), 6.85 (dd, J＝12.0, 8.8 Hz, 2.42H), 4.69 (dd, J＝9.7, 2.4 Hz, 0.16H), 4.23 (dd, J＝6.4, 3.3 Hz, 0.50H), 4.14 (dd, J＝11.2, 6.8 Hz, 0.79H), 3.87~3.80 (m, 0.32H), 3.78 (d, J＝5.1 Hz, 3.55H), 3.61 (s, 0.55H), 2.53~2.34 (m, 1.75H), 2.28 (s, 0.47H), 2.00 (dd, J＝13.8, 11.4 Hz, 0.65H), 1.70 (s, 1.49H), 1.68 (s, 1.50H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 162.2, 161.4, 159.6, 158.8, 158.7, 158.2, 152.9, 133.3, 131.4, 128.1, 123.8, 123.6, 123.1, 116.6, 116.4, 114.6, 113.7, 104.4, 101.6, 100.7, 99.2, 55.3, 55.2, 34.4, 33.6, 28.0, 27.6.

  4-羟基-3-[1-(2-氯苯基)-3-氧代丁基]-苯并吡喃-2-酮(3e)^{[4, 13, 21]}:得150 mg白色粉末, 产率88%. m.p.168~170 ℃; ¹H NMR (600 MHz, CDCl3) δ: 9.59 (s, 0.17H), 7.99 (d, J＝7.9 Hz, 0.17H), 7.90 (d, J＝7.8 Hz, 0.57H), 7.83 (d, J＝7.8 Hz, 0.69H), 7.71 (d, J＝7.8 Hz, 0.18H), 7.53 (ddd, J＝27.6, 17.7, 10.1 Hz, 1.53H), 7.42 (d, J＝7.8 Hz, 0.63H), 7.40~7.26 (m, 3.87H), 7.15 (td, J＝15.1, 7.6 Hz, 3.96H), 4.85 (d, J＝10.8 Hz, 0.20H), 4.59-4.53 (m, 0.59H), 4.14 (q, J＝7.1 Hz, 0.66H), 3.99 (dd, J＝19.0, 11.0 Hz, 0.81H), 3.48 (s, 0.55H), 3.20 (d, J＝19.1 Hz, 0.18H), 2.57 (dd, J＝14.5, 3.3 Hz, 1.33H), 2.38 (dd, J＝14.4, 7.5 Hz, 0.64H), 2.30 (s, 0.47H), 2.06 (s, 1.00H), 1.75 (s, 2.53H), 1.71 (s, 1.64H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 161.7, 161.0, 153.0, 153.0, 139.0, 133.8, 132.0, 131.6, 130.3, 129.2, 128.2, 128.1, 127.7, 127.1, 126.8, 123.9, 123.7, 122.9, 122.7, 116.7, 116.6, 116.1, 115.9, 115.6, 101.3, 100.4, 99.1, 45.9, 37.2, 32.7, 32.5, 30.0, 28.2, 28.0.

  4-羟基-3-[1-(3-氯苯基)-3-氧代丁基]-苯并吡喃-2-酮(3f)^{[13, 21]}:得152 mg, 产率89%.白色粉末m.p. 162~164 ℃; ¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 9.56 (s, 0.19H), 7.98 (d, J＝7.6 Hz, 0.19H), 7.90 (d, J＝7.8 Hz, 0.47H), 7.84 (d, J＝7.2 Hz, 0.71H), 7.56 (dt, J＝14.5, 7.9 Hz, 1.46H), 7.39~7.13 (m, 8.92H), 4.68 (d, J＝9.9 Hz, 0.21H), 4.22 (dd, J＝6.8, 3.5 Hz, 0.53H), 4.19~4.09 (m, 0.98H), 3.86 (dd, J＝19.3, 10.4 Hz, 0.25H), 3.18 (s, 0.47H), 2.53~2.37 (m, 1.85H), 2.32 (s, 0.60H), 1.98 (t, J＝12.8 Hz, 0.80H), 1.76 (s, 2.14H), 1.72 (s, 1.40H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 161.9, 161.1, 159.7, 159.0, 153.0, 153.0, 145.4, 144.3, 134.7, 134.4, 132.1, 132.0, 131.7, 129.9, 129.8, 127.6, 127.1, 127.1, 126.8, 125.5, 125.4, 123.9, 123.7, 123.0, 122.8 116.7, 116.6, 115.8, 115.5, 103.6, 101.1, 100.2, 98.9, 42.3, 40.0, 35.2, 34.6, 28.2, 27.7.

  4-羟基-3-[1-(4-氯苯基)-3-氧代丁基]-苯并吡喃-2-酮(3g):得125 mg, 产率73%.白色粉末, m.p. 166~168 ℃(文献值^[7] 174~176 ℃); ¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 9.59 (s, 0.10H), 7.95 (d, J＝7.9 Hz, 0.13H), 7.88 (d, J＝7.3 Hz, 0.30H), 7.81 (d, J＝7.3 Hz, 0.47H), 7.52 (ddd, J＝19.7, 13.5, 7.3 Hz, 0.96H), 7.35~7.13 (m, 6.21H), 4.68 (d, J＝9.8 Hz, 0.11H), 4.16 (dd, J＝11.3, 6.8 Hz, 0.81H), 3.82 (dd, J＝19.2, 10.0 Hz, 0.20H), 3.29 (d, J＝19.1 Hz, 0.16H), 2.45 (dd, J＝13.8, 7.1 Hz, 0.84H), 2.37 (dd, J＝14.0, 7.1 Hz, 0.35H), 2.29 (s, 0.33H), 1.95 (t, J＝12.7 Hz, 0.56H), 1.72 (s, 1.47H), 1.69 (s, 0.98H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃)δ: 162.1, 161.4, 159.8, 159.1, 153.0, 152.9, 152.8, 141.8, 140.7, 138.5, 132.5, 132.4, 132.1, 132.1, 131.9, 131.7, 129.4, 128.8, 128.7, 128.7, 128.5, 128.2, 124.0, 123.9, 123.7, 123.0, 122.8, 116.6, 116.5, 116.2, 115.8, 115.6, 107.5, 103.7, 101.3, 100.4, 99.1, 45.2, 42.4, 40.1, 34.9, 34.4, 30.0, 28.0, 27.6.

  4-羟基-3-[1-(2-氟苯基)-3-氧代丁基]-苯并吡喃-2-酮(3h):得132 mg, 白色粉末, 产率81%. m.p. 166~168 ℃; ¹H NMR (600 MHz, DMSO) δ: 7.93~7.59 (m, 2.09H), 7.41~7.01 (m, 6.12H), 4.28 (d, J＝43.7 Hz, 0.96H), 3.36 (s, 0.91H), 2.60~2.00 (m, 1.86H), 1.66 (d, J＝52.2 Hz, 3.00H); ¹³C NMR (151 MHz, DMSO) δ: 161.5, 159.9 (d, ¹J_C-F＝241.8 Hz), 152.8, 132.4, 130.6, 130.2, 129.3, 128.3, 124.8, 124.4, 123.2, 116.6, 115.5, 103.1, 101.4, 100.0, 30.0, 29.0, 27.7, 26.8.

  4-羟基-3-[1-(3-氟苯基)-3-氧代丁基]-苯并吡喃-2-酮(3i)^[4]:得146 mg, 产率89%.白色粉末, m.p. 162~164 ℃; ¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 7.98 (d, J＝7.4 Hz, 0.14H), 7.90 (d, J＝7.8 Hz, 0.37H), 7.84 (d, J＝7.8 Hz, 0.50H), 7.56 (dt, J＝36.0, 7.8 Hz, 1.07H), 7.31 (tdd, J＝24.7, 16.8, 7.6 Hz, 3.53H), 7.10~6.89 (m, 3.11H), 4.71 (d, J＝10.0 Hz, 0.14H), 4.26 (dd, J＝6.8, 3.3 Hz, 0.37H), 4.22~4.12 (m, 0.60H), 3.86 (dd, J＝19.0, 9.9 Hz, 0.16H), 3.50 (s, 0.55H), 3.32 (d, J＝19.4 Hz, 0.19H), 3.23 (s, 0.39H), 2.50 (ddd, J＝13.6, 8.2, 5.4 Hz, 0.92H), 2.43 (dd, J＝14.2, 7.2 Hz, 0.44H), 2.32 (s, 0.32H), 2.02~1.95 (m, 0.57H), 1.76 (s, 1.60H), 1.72 (s, 1.28H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃)δ: 162.0, 161.2, 159.0, 153.0, 153.0, 132.1, 131.7, 130.3, 130.3, 130.0, 130.0, 124.0, 123.7, 123.0, 122.8, 122.7, 116.7, 116.6, 116.2, 115.8, 114.5, 114.3, 113.9, 113.9, 113.8, 113.5, 113.4, 103.7, 100.3, 99.0, 77.2, 77.0, 76.8, 50.8, 42.3, 40.0, 35.2, 34.5, 30.0, 28.2, 27.7.

  4-羟基-3-[1-(4-氟苯基)-3-氧代丁基]-苯并吡喃-2-酮(3j)^{[4, 13]}:得140 mg, 产率86%.白色粉末, m.p. 171~172℃; ¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 9.54 (s, 0.13H), 7.97 (d, J＝7.9 Hz, 0.14H), 7.90 (d, J＝7.8 Hz, 0.33H), 7.83 (d, J＝7.6 Hz, 0.50H), 7.60~7.49 (m, 1.01H), 7.37~7.17 (m, 4.41H), 7.03~6.95 (m, 1.95H), 4.69 (d, J＝9.8 Hz, 0.13H), 4.23 (s, 0.33H), 4.20~4.12 (m, 0.74H), 3.87 (dd, J＝19.4, 10.3 Hz, 0.19H), 3.59 (s, 0.49H), 3.31 (s, 0.09H), 3.27 (d, J＝6.3 Hz, 0.40H), 2.47 (dd, J＝13.9, 6.6 Hz, 0.82H), 2.41 (dd, J＝14.0, 6.9 Hz, 0.39H), 2.31 (s, 0.38H), 2.02~1.95 (m, 0.55H), 1.75 (s, 1.56H), 1.71 (s, 1.27H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 161.2, 160.7 (d, ¹J_C-F＝73.4 Hz), 159.6, 158.8 (d, ¹J_C-F＝118.0 Hz), 153.0, 153.0, 138.8, 132.0, 131.8, 131.6, 129.6, 129.6, 128.8, 128.7, 128.6, 128.5, 123.9, 123.9, 123.7, 123.0, 122.7, 116.7, 116.5, 116.2, 115.8, 115.8, 115.6, 115.6, 115.5, 115.3, 115.0, 114.8, 104.1, 101.5, 100.4, 99.0, 45.5, 42.6, 40.1, 34.7, 34.4, 34.0, 30.0, 28.2, 27.7.

  4-羟基-3-(2-萘-3-氧代丁基)-苯并吡喃-2-酮(3k)^[13]:得177 mg, 产率99%.白色粉末, m.p. 117~119 ℃; ¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 7.95~7.64 (m, 4.71H), 7.57~7.17 (m, 5.96H), 4.41 (s, 0.95H), 2.78~2.24 (m, 1.84H), 1.70 (s, 3.00H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 153.0, 133.6, 132.5, 131.8, 127.8, 127.6, 126.1, 125.6, 123.8, 123.1, 116.6, 26.9.

  辅助材料(Supporting Information) 化合物3a~3k的核磁共振氢谱和核磁共振碳谱.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

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• 表 1  溶剂对蚯蚓粗提物催化Michael反应的影响^a

  Table 1.  Influence of solvents on the crude earthwarm extract catalyzed-Michael reaction

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  表 2  蚯蚓粗提物的量对Michael反应的影响^a

  Table 2.  Effects of amount of crude earthwarm extract on the Michael reaction ^a

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  表 3  含水量对蚯蚓粗提物催化的Michael反应的影响^a

  Table 3.  Effects of water content on the crude earthwarm extract catalyzed-Michael reaction

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  表 4  底物投料比对蚯蚓粗提物催化的Michael反应的影响^a

  Table 4.  Influence of mole ratio of substrates on the crude earthwarm extract catalyzed-Michael reaction ^a

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  表 5  温度对蚯蚓粗提物催化的Michael反应的影响^a

  Table 5.  Effects of temperature on the crude earthwarm extract catalyzed-Michael reaction ^a

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  表 6  对照实验^a

  Table 6.  Control experiments

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  表 7  蚯蚓粗提物催化的Michael反应的底物扩展^a

  Table 7.  Substrate scope of the crude earthwarm extract catalyzed-Michael reaction ^a

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