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• 水体污染问题已经严重影响了人体健康，制约了社会的持续发展。目前，我国水体污染的特点是复合污染严重，即污染物成分复杂且污染物间存在不可预测的相互作用，因此，有必要加强对水体总毒性的检测和监测。水体总毒性指标能够反映水体复合污染对生物体的直接毒害作用，非常适合用于评估水体复合污染程度和复合污染引起的环境风险。将水体总毒性指标与其它常规指标共同纳入水环境监测网络，不仅能够提升水环境监测网络的数据质量，从而更加准确、全面地衡量水体的复合污染情况，为国家的水污染防治工作提供有价值的水体质量信息，而且还能起到水质安全预警功能，保障居民的用水安全。

  传统的化学和物理检测方法，比如质谱、原子光谱等可以准确地测定水中有机物和离子的种类和含量，但是无法给出相应物质的毒性数据，毒性检测必须依靠生化方法。微生物具有与高等动物类似的毒性响应，且生长周期短，易培养，毒性响应快速，因此以微生物为毒性测试受试体的水体总毒性在线监测和检测方法显示了很好的应用前景，已经成为水体质量分析领域的研究热点。其中，发光细菌法是发展较早且较为成熟的方法^[1-3]，但是光学检测易受水体浊度和色度的影响，因此发光细菌法在实际的水体总毒性在线监测和检测中的应用受到了限制。

  基于媒介体的电化学水体总毒性检测方法是近年来兴起的一种全新的水体总毒性检测方法^[4-6]，该方法通过引入电子媒介体代替氧气，可以降低环境因素变化对检测结果的影响。它以微生物的呼吸抑制作用为毒性响应机理，因此能够使用原位培养的微生物作为毒性检测受试体，进而更加有效地反映目标水体总毒性的变化。此外，电化学检测技术具有检测灵敏度高、操作简单、测试成本低、仪器易于小型化和微型化等优点，便于开发廉价小型便携及在线设备。同时，电化学检测方法可以克服水体浊度和色度的干扰。因此，基于媒介体的电化学水体总毒性检测方法更加适合实际水体的检测。

  1.   基于媒介体的电化学水体总毒性检测方法的研究现状

  1.1   毒性检测原理

  基于媒介体的电化学水体总毒性检测方法的毒性响应为毒性物质对微生物的呼吸抑制作用，具体如图 1所示^[7]。在微生物的呼吸过程中，氧化态媒介体可以代替氧气接受微生物呼吸过程中产生的电子，从而生成还原态媒介体。因此，通过电化学方法检测微生物呼吸过程中产生的还原态媒介体的量，就可以实现对微生物呼吸活性的检测，进而实现对水体总毒性的检测，即当有毒性物质存在时，微生物的呼吸作用受到抑制，从而导致单位时间内生成的还原态媒介体的量减少。

  图 1

  

  图 1.  水体总毒性检测原理示意图(略有修改)^[7]

  Figure 1.  Schematic illustration of the detection mechanism of water total toxicity(with slight modification)^[7]

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  1.2   媒介体分子

  媒介体是一类具有电化学活性的分子，它利用自身的氧化还原过程实现微生物和电极之间的电荷传递，从而将微生物活性信息转换为可识别的电化学信号。使用媒介体的时候要考虑到其毒性。比如，铁氰化钾在水中具有很高的溶解度，虽然可以通过增加铁氰化钾的浓度提高检测信号强度，但是超出一定浓度后，铁氰化钾就会展现出生物毒性^[8]。此外，媒介体在检测体系中的电荷传递效率是选择媒介体分子的关键因素。当使用革兰氏阴性菌作为毒性检测受试体的时候，使用单一的媒介体，比如铁氰化钾或者对苯醌，就可以实现微生物和电极之间的有效电荷传递^[9-11]。对于革兰氏阳性菌或者真核微生物(比如酵母菌)，通常需要同时使用脂溶性和水溶性的二元媒介体才能获得满意的电荷传递效率^[12-15]。一方面，水溶性媒介体分子虽然在水中的溶解度高，但是水溶性媒介体分子与革兰氏阳性菌和真核微生物的电荷传递效率低；另一方面，脂溶性电子媒介体分子与革兰氏阳性菌和真核微生物具有很好的电荷传输效率，但是其在水溶液中的溶解度很低。当同时使用脂溶性和水溶性的电子媒体时，脂溶性媒介体分子将电子由微生物传递给水溶性媒介体分子，水溶性媒介体分子再将电子传递给电极，从而提高微生物和电极之间的传递效率。

  1.3   微生物的选择

  基于媒介体的电化学水体总毒性检测方法使用微生物作为毒性检测的受试体，因此该方法对毒性物质的最低响应浓度、灵敏度等均依赖于使用的微生物。实验结果表明，不同微生物对毒性物质的响应不同，例如荧光假单胞菌对4.0 mg/L的3, 5-二氯苯酚可以展示出显著的毒性响应(呼吸抑制率接近50%)，然而粪产碱菌对同样浓度的3, 5-二氯苯酚则不会有毒性响应(实际上其呼吸活性反而增强，即“毒物兴奋效应”)^[16]。由于水体总毒性检测属于容量测试，并不针对某一种或者一类具体的毒性物质进行检测，而是检测水中所有物质对微生物呼吸活性的综合抑制作用。因此，在实际检测中，使用混合微生物作为毒性检测受试体，可以避免使用单一微生物带来的对毒性物质的选择性。

  1.4   毒性检测结果的干扰因素

  毒性检测结果是相对值，即对测试样品和参考样品中微生物活性进行比较(如图 1)。微生物表现出的活性与水体的温度、pH值、溶解氧、生物可降解有机物含量(或者称为水体的BOD)等有关^[17-18]，因此这些因素均会对毒性检测结果产生干扰。通常情况下，这些干扰因素在实验室研究过程中造成的影响较小，甚至可以忽略不计，因为参考水样和测试水样的来源一致^[19]。但是，在实际水体测试中，当参考水样和测试水样的来源不一致时，这些因素对检测结果的影响就会变得非常明显。因此，在实际水体进行检测过程中，应尽量减少参考水样和测试水样在上述几个方面的差异，从而提高检测结果的准确性和可靠性。

  1.5   微生物修饰电极的制备

  虽然基于媒介体的电化学水体总毒性检测方法的样品测试时长一般不超过2 h，但是作为受试体的微生物的培养过程通常超过12 h。因此，为了缩短样品的测试周期以满足现场快速检测的需求，人们尝试通过空间位置限制的方式将预先培养好的微生物固定在电极表面制备微生物修饰电极。例如，2013年同济大学的王学江等^[10]将微生物滴在印刷电极表面，随后用聚碳酸酯膜覆盖的方法将微生物固定在电极表面。实验结果显示，固定的微生物在4 ℃条件下存放超过60 d后，仍然可以用于毒性检测。2014年，只金芳课题组^[20]利用琼脂糖凝胶和聚3-氨丙基三甲氧基硅烷将媒介体对苯醌及微生物同时固定在电极表面，该电极在测试过程中无需外加媒介体分子，简化了测试过程。此外，虽然直接在电极表面生长微生物膜的操作更加简单，但是生物膜中的胞外聚合物会保护膜内的微生物免受毒性物质的伤害，从而降低微生物膜对毒性物质的响应能力^[21-22]。

  1.6   毒性检测

  在水体总毒性测试过程中，微生物、媒介体分子需要在水体中反应一段时间，以使毒性物质能够与微生物发生作用并获得强度足够的检测信号。水体总毒性的强弱用呼吸抑制率表示(Inhibition ratio)，其计算方法如式(1)所示：

  $ {\rm{Inbittion}}\;{\rm{ratio}} = (1 - \frac{{{i_{\rm{{tox}}}}}}{{{i_{\rm{{nor}}}}}}) \times 100\% $

  (1)

  式中，i_tox和i_nor分别是测试样品和参考样品中微生物呼吸过程产生的亚铁氰化钾的氧化电流值。需要注意的是，使用式(1)进行毒性结果分析的前提是使用的媒介体分子中没有还原态，否则需要在相应的测试电流值中减去试剂中原本存在的还原态媒介体分子产生的电流值。为了研究该方法对不同毒性物质的响应能力，通常定义呼吸抑制率为50%所需的浓度为半数呼吸抑制量(IC₅₀)，并与其它方法的半数浓度(比如，发光细菌法的EC₅₀值)进行比较。

  3, 5-二氯苯酚(DCP)常被用作模型毒性物质以考察方法对毒性物质的响应，其IC₅₀值通常在5~10 mg/L。这一结果与“经济合作与发展组织测试指南”中关于污泥活性抑制测试的结果^[21]一致(OECD209:Activated Sludge, Respiration Inhibition Test)。此外，基于媒介体的电化学水体总毒性检测方法对一些典型的重金属离子、有机污染物及农药等污染物的也具有毒性响应^[11](如表 1所示)。该方法还对联合毒性有响应^[22]，对联合毒性的响应能力是该方法可以用于水体总毒性检测的前提，因为毒性物质的生物毒性与其所处的环境有关。

  表 1

  

  表 1  不同条件下的毒性检测结果

  Table 1.  The results of toxicity detection in different cases

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  Microorganism	Toxin	IC50/(mg·L-1)	Mediator	Reference
  E.coli S.cerevisiae(pretreated)	DCP	8.7 9.83	Ferricyanide Ferricyanide	[19] [25]
  E.coli	Cr6+	22.78	Ferricyanide	[19]
  E.coli	Hg2+	39.36 11.69 1.1	Ferricyanide p-Benzoquinone p-Benzoquinone	[19] [9] [26]
  E.coli E.coli Psychrobacter sp	Cd2+	93.35 7.8 47.3	Ferricyanide Ferricyanide p-Benzoquinone	[19] [27] [10]
  E.coli E.coli Psychrobacter sp.	Cu2+	0.95 6.5 2.6	p-Benzoquinone p-Benzoquinone p-Benzoquinone	[9] [26] [10]
  E.coli	Endosulfan	5.7	Ferricyanide	[28]
  E.coli	Fenamiphos	22	Ferricyanide	[28]
  E.coli S.cerevisiae(pretreated)	Ametryn	6.5 22	Ferricyanide Ferricyanide	[28] [25]

  2.   结论与展望

  随着社会生产的发展，越来越多的化学物质被合成并进入到水环境中，从而导致水体污染物种类日益增多。这些污染物之间的相互作用复杂，难以预测，因此水体总毒性的检测和监测在未来水体环境治理、监测等领域的应用价值、科学意义日益显著。基于媒介体的水体总毒性电化学监测方法具有检测快速、灵敏、成本低等优点。此外，该方法可以使用原位培养微生物为毒性监测受试体，因此环境的适应性更好，从而能够更加准确地反映目标水体的总毒性变化。虽然该方法近年来发展迅速，但是其存在的问题仍然不能忽视^[29]。比如，尚未形成以该方法为基础的水体总毒性检测标准。因此，在未来的工作中，应该针对具体种类的目标水体，开展相应的检测方法研究。

  另外，自动化在线监测仪器是实现我国“水质监测天网”的关键。今年，国家将建设2050个水质自动监测站点，而市场上还缺少可以满足使用需求的水体总毒性在线检测仪器。因此，随着社会对水体总毒性检测结果的科学价值、社会意义的理解的提高，未来水体总毒性检测设备将具有很强的市场需求。电化学监测设备具有可小型化、低成本、高灵敏度等优点，且监测结果不受水体浊度和色度的干扰。因此，为了满足市场和社会的需求，有必要开发以基于媒介体的水体总毒性电化学监测方法为技术核心的水体总毒性在线监测仪器。

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  图 1  水体总毒性检测原理示意图(略有修改)^[7]

  Figure 1  Schematic illustration of the detection mechanism of water total toxicity(with slight modification)^[7]

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  表 1  不同条件下的毒性检测结果

  Table 1.  The results of toxicity detection in different cases

  Microorganism	Toxin	IC50/(mg·L-1)	Mediator	Reference
  E.coli S.cerevisiae(pretreated)	DCP	8.7 9.83	Ferricyanide Ferricyanide	[19] [25]
  E.coli	Cr6+	22.78	Ferricyanide	[19]
  E.coli	Hg2+	39.36 11.69 1.1	Ferricyanide p-Benzoquinone p-Benzoquinone	[19] [9] [26]
  E.coli E.coli Psychrobacter sp	Cd2+	93.35 7.8 47.3	Ferricyanide Ferricyanide p-Benzoquinone	[19] [27] [10]
  E.coli E.coli Psychrobacter sp.	Cu2+	0.95 6.5 2.6	p-Benzoquinone p-Benzoquinone p-Benzoquinone	[9] [26] [10]
  E.coli	Endosulfan	5.7	Ferricyanide	[28]
  E.coli	Fenamiphos	22	Ferricyanide	[28]
  E.coli S.cerevisiae(pretreated)	Ametryn	6.5 22	Ferricyanide Ferricyanide	[28] [25]

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