English

• 1.   引言

  呋喃它酮是硝基呋喃类抗生素的一种，曾被广泛应用于饲料添加剂及家禽、家畜、水产等养殖物传染病的预防与治疗^[1]。但研究表明，呋喃它酮及其代谢物具有潜在的致癌和诱导机体突变的作用，且其代谢产物能与蛋白质结合，形成比原药化合物更稳定的蛋白结合物而在体内富集。但在酸性条件下，代谢物又能从蛋白质中释放出来被人体吸收而引发安全问题^{[2, 3]}。因此，1995年欧盟禁止了硝基呋喃类抗生素在食用动物中使用；我国也于2002年禁止了硝基呋喃类抗生素的使用，并规定在动物性食品中不得检出。尽管如此，因其高效廉价非法使用的情况却时有发生。我国出口欧盟、美国等发达国家的动物源性食品均曾被检测出此类药物残留^{[4, 5]}。因此，开展快速、廉价、灵敏、稳定的呋喃它酮及其代谢物残留检测方法研究，对呋喃它酮违禁使用监控具有重要现实意义。

  呋喃它酮及其代谢物的检测主要是基于液相色谱及液相色谱-质谱大型仪器的确证方法^[6-10]，这些方法具有准确、灵敏等特点，但因其需要昂贵的仪器、耗时、需要专业操作人员等不足，难以在基层普及和应对量大面宽的食品样品检测需求。免疫学方法具有灵敏准确、特异性、高通量、低耗费等优势，适合样品的大量筛查检测，与仪器法高低搭配，形成互补。免疫分析技术应用于AMOZ检测已有相关报道，如酶联免疫分析(ELISA)^[11-13]和化学发光酶联免疫分析(CLEIA)^{[14, 15]}。时间分辨荧光是对荧光物质在不同时间的荧光强度和量子效率发生急剧变化的过程进行扫描，被广泛应用在蛋白质及聚合物等领域^{[16, 17]}。时间分辨免疫分析法(TRFIA)是在此基础上进一步结合高特异性免疫反应发展的一种非放射性微量分析方法，目前已应用于医学诊断、环境监测等领域^[17-19]。该技术与ELISA易受基质干扰及CLEIA发光信号易衰减相比，镧系金属离子螯合标记物荧光持续稳定性好、强度大、Stokes位移宽、使其易通过波长分辨方式区别于背景荧光，提高了方法学的稳定性、特异性和灵敏度^[20]。因此，在前期关于AMOZ的CLEIA方法基础上^[15]，本研究组继续开展了AMOZ的TRFIA检测方法研究。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  Wallac VICOR31420多功能标记分析仪(美国PE公司)；超滤离心管(美国Millipore公司)；Wellwash MK2洗板机(美国Thermo公司)；超低温高速离心机(美国Eppenndorf公司)。呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林、邻硝基苯甲醛、呋喃它酮代谢物邻硝基苯甲醛衍生物NPAMOZ (99.9%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；呋喃它酮代谢物AMOZ(99.9%，Sigma公司)；Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙酸烯三胺四乙酸、增强液(广州市丰华生物工程有限公司)；AMOZA-OVA及其抗体(鼠单抗)由本实验室自制^[11]；其它试剂均为国产分析纯；草鱼购于当地超市。

  2.2.   实验方法

  2.2.1.   铕标二抗的制备

  取10 mg/mL羊抗鼠IgG 0.2 mL至超滤离心管柱中，加入1.5 mL洗脱液(50 mmol/L, pH 8.5, Na₂CO₃-NaHCO₃)，10000 r/min离心5 min，弃滤液；重复上述操作5次。取离心柱中液体200μL与0.5 mg Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙酸烯三胺四乙酸(Eu³⁺-DTTA)混匀，28℃反应48 h。采用Sepharose CL-6B(1×30 cm)层析分离，收集洗脱液，监测流出液的荧光值并收集铕标二抗，4℃下贮藏备用。

  2.2.3.   实际样品预处理^[11]

  取1 g均质好的鱼肉样品，分别加入4 mL H₂O、0.5 mL 1 mol/L HCl和100μL 10 mmol/L 2-硝基苯甲醛，振荡5 min，置于37℃过夜。然后分别加入1 mL 0.1 mol/L K₂HPO₄、0.4 mL 1 mol/L NaOH和6 mL乙酸乙酯，剧烈振荡5 min，4000 r/min离心10 min。乙酸乙酯层N₂吹干，以1 mL磷酸盐缓冲液(PBS)复溶，再加3 mL正己烷混匀，4000 r/min离心10 min，取下层液体用于检测。

  2.2.2.   ic-TRFIA方法的建立

  用碳酸盐缓冲液CB(0.01 mol/mL，pH 9.6)将包被原AMOZA-OVA稀释至一定浓度，以100μL/孔加入酶标板孔中，在37℃孵育过夜。用洗涤液洗板2次，每孔加入封闭液120μL，37℃封闭3 h，甩干孔中液体，于37℃烘箱烘干1 h。每孔加50μL稀释至一定浓度的标准品(或样品提取液)，对照孔加50μL标准品稀释液，同时加50μL稀释后的抗体，37℃反应，洗板5次；每孔加入100μL稀释的Eu³⁺-二抗，37℃反应，洗板5次；加200μL/孔的增强液振荡5 min，用TRFIA仪器进行荧光测定。基本原理如图 1所示。

  图 1

  

  图 1  间接竞争时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)基本原理

  Figure 1.  Schematic diagram of indirect competitive-time resolved fluorimmunoassay (ic-TRFIA)

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  3.   结果与讨论

  3.1.   Eu³⁺-羊抗鼠IgG标记物纯化

  采用Sepharose CL-6B对铕标记物分离纯化，因Eu³⁺-DTTA-Ab分子量较大，在层析柱流经路径较短而先出峰^[21]。取5μL标记物，加入200μL增强液，振荡反应5 min，用多功能标记分析仪测定荧光强度，结果显示(图 2)，有两个色谱峰值，第一个为Eu³⁺-IgG，第二个为游离的Eu³⁺-DTTA，收集第一个峰值液体，得Eu³⁺-IgG产物，4℃保存备用。

  图 2

  

  图 2  Eu³⁺-羊抗鼠IgG标记物分离纯化

  Figure 2.  Purification of Eu³⁺-goat anti mouse IgG

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  3.2.   ic-TRFIA检测AMOZ条件优化

  3.3.   AMOZ-ic-TRFIA标准曲线的建立

  基于上述优化条件，建立标准曲线(图 3)，其IC₅₀为0.26 ng/mL，检出限(IC₁₀)为0.01 ng/mL，线性范围(IC₂₀～IC₈₀)为0.025～2.83 ng/mL，与本实验室前期CLEIA检测结果^[15]相当。

  图 3

  

  图 3  AMOZ-ic-TRFIA标准曲线(n=3)

  Figure 3.  Standard curve of ic-TRFIA for 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone (AMOZ)(n=3)

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  3.4.   AMOZ-ic-TRFIA方法评价

  不同批次包被抗原AMOZA-OVA对检测结果的影响

  考察了不同批次包被原AMOZA-OVA条件下检测结果的重复性及稳定性。结果表明，对不同浓度标准品检测结果RSD在1.5%~5.2%之间，说明不同批次对检测结果影响小，稳定性良好。

  3.2.3.   竞争反应时间的优化^[15]

  竞争反应时间分别设为30, 40, 50和60 min，ic-TRFIA测定最佳反应时间。当反应50 min时，CPS_max/IC₅₀最大，IC₅₀较低，故最佳竞争反应时间为50 min。

  3.2.1.   包被抗原浓度的优化^[15]

  固定抗体浓度为1：3×10⁴，Eu³⁺-IgG浓度为1：200，用CB液依次稀释包被抗原至0.5, 0.4, 0.3和0.2μg/mL，100μL/孔加入酶标板孔中，ic-TRFIA测定最佳包被抗原浓度。包被浓度为0.25μg/mL时IC₅₀最小，荧光计数最大值(CPS_max)与半抑制浓度(IC₅₀)的比值(CPS_max/IC₅₀)最大，故选择0.25μg/mL为最佳包被浓度。

  3.2.2.   一抗稀释倍数的优化^[15]

  将一抗用PBST(含0.01%吐温-20的PBS)稀释不同倍数，Eu³⁺-IgG浓度为1：200，ic-TRFIA测定最佳一抗稀释倍数。当一抗稀释倍数为5×10⁴时，IC₅₀较小、CPS_max/IC₅₀最大。因此最佳一抗稀释倍数为5×10⁴。

  3.4.2.   特异性

  选择呋喃它酮及其代谢物结构与功能类似物进行测定并计算交叉反应率(表 1)，结果表明：AMOZ抗体除与呋喃它酮有较高交叉反应外，与其它结构类似物均没有明显交叉反应，说明其特异性好，不易出现假阳性，可用于实际样品中AMOZ残留的筛查检测。

  表 1

  

  表 1  交叉反应

  Table 1.  Cross-reactivity with furaltadone analogues

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  标准品Standard samples	半抑制浓度IC50(μg/L)	交叉反应率*Cross-reactivity(%)
  呋喃它酮代谢物3-Amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone, AMOZ	90.52	0.28
  呋喃西林代谢物Semicarbazide, SEM	> 3000	< 0.01
  呋喃唑酮代谢物3-Amino-2-oxazolidinone, AOZ	> 3000	< 0.01
  呋喃妥因代谢物1-Aminohydantoin, AHD	> 3000	< 0.01
  呋喃它酮Furaltadone	0.91	28.57
  呋喃妥因Nitrofurantoin	> 3000	< 0.01
  呋喃西林Nitrofurazone	> 3000	< 0.01
  呋喃唑酮Furazolidone	> 3000	< 0.01
  邻硝基苯甲醛2-Nitrobenzaldehyde, NP	> 3000	< 0.01
  呋喃它酮代谢物邻硝基苯甲醛衍生物NPAMOZ	0.26	100
  呋喃妥因代谢物邻硝基苯甲醛衍生物NPAHD	> 3000	< 0.01
  呋喃唑酮代谢物邻硝基苯甲醛衍生物NPAOZ	> 3000	< 0.01
  呋喃西林代谢物邻硝基苯甲醛衍生物NPSEM	> 3000
  *注(Notes)：AMOZ的IC50与功能类似的IG50的比值(Percentage of IC50 of AMOZ to IC50 of functional analogue)。

  3.4.3.   样品基质效应消除

  按2.2.3节进行样品预处理。用PBS将空白样品预处理所得提取液分别稀释2，4，6倍，作为标准品NPAMOZ稀释液，绘制标准曲线，考察基质效应^[15]。当提取液稀释6倍时，所得标准曲线与用标准稀释液所得标准曲线趋势一致，且IC₅₀及线性范围相接近(图 4)，故鱼样提取液采用PBS稀释6倍。

  图 4

  

  图 4  鱼样基质曲线与标准曲线的比较(n=3)。(a)标准稀释液PBS；(b)稀释2倍；(c)稀释4倍；(d)稀释6倍

  Figure 4.  Analysis of matrix effect by dilution fish sample with PBS buffer at different ratios(n=3). (a) diluted solution PBS; (b) diluted by 2 folds; (c) diluted by 4 folds; (d) diluted by 6 folds

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  3.4.4.   实际样品检测

  选取检测范围内3个浓度，在阴性样(草鱼)基质中添加AMOZ标准品，按2.2.3节进行样品预处理，进行ic-TRFIA测定，并计算样品添加回收率；同时与HPLC-MS/MS检测结果比对^[22]。结果表明(表 2，图 5)，样品的ic-TRFIA检测平均回收率在78%～86%之间，RSD小于15%；与HPLC-MS/MS结果相关性良好(R²=0.9647)，说明建立的ic-TRFIA方法准确可靠，可用于实际样品中AMOZ检测。

  图 5

  

  图 5  鱼样中AMOZ的ic-TFRIA与HPLC-MS/MS检测结果相关性

  Figure 5.  Correlation of AMOZ assay between ic-TFRIA and HPLC-MS/MS

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  表 2

  

  表 2  HPLC-MS/MS与ic-TRFIA的样品添加回收对比

  Table 2.  Recoveries of AMOZ from spiked food samples by ic-TRFIA and HPLC-MS/MS

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  添加浓度Spiked(ng/g)	ic-TRFIA				HPLC-MS/MS
  	检测值Found(ng/mL)	回收率Recovery(%)	RSD(%, n=3)		检测值Found(ng/mL)	回收率Recovery(%)	RSD(%, n=3)
  1	0.94±0.073	94.4	7.8		0.78±0.09	78.0	11.5
  3	3.24±0.45	107.9	13.9		2.58±0.23	86.0	8.9
  9	9.2±1.6	101.7	17.7		7.63±1.0	84.8	13.8

• 1. [1]

     Vass M,Hruska K,Franek M.Vet.Medi.,2008,53(9):469-500

  2. [2]

     Bartel L C,Montalto de M M,Castro J A.Food Chem.Toxicol.,2009,47(1):140-144

  3. [3]

     O'Mahony J,Moloney M,McConnell R I,Benchikh E O,Lowry P,Furey A,Danaher M.Biosens.Bioelectron.,2011,26(10):4076-4081

  4. [4]

     ZOU Long,LIU Shi-Wen,XU Yang.Sci.Technol.Food Ind.,2011,32(9):464-471邹龙,刘师文,许杨.食品工业科技,2011,32(9):464-471

  5. [5]

     CHEN Wei-Feng,CHEN Jing-Xin.Meat Research, 2011,25(12):53-57陈威风,陈敬鑫.肉类研究,2011,25(12):53-57

  6. [6]

     Barbosa J,Moura S,Barbosa R,Ramos F,da Silveira M I N.Anal.Chim.Acta,2007,586(1-2):359-365

  7. [7]

     Noonan G O,Warner C R,Hsu W,Begley T H,Perfetti G A,Diachenko G W.J.Agr.Food Chem.,2005,53(12):4680-4685

  8. [8]

     Leston S,Nunes M,Freitas A,Barbosa J,Ramos F,Pardal M A.J.Chromatogr.B,2011,879(32):3832-3836

  9. [9]

     Barbosa J,Freitas A,Moura S,Mourao JL,da Silveira M I N,Ramos F.J.Agr.Food Chem.,2011,59(22):11927-11934

  10. [10]

      Barbosa J,Freitas A,Mourao JL,da Silveira M I N,Ramos F.J.Agr.Food Chem.,2012,60(17):4227-4234

  11. [11]

      Shen Y D,Xu Z L,Zhang S W,Wang H,Yang J Y,Lei H T,Xiao Z L,Sun Y M.J.Agr.Food Chem.,2012,60(44):10991-10997

  12. [12]

      Xu Z L,Shen Y D,Sun Y M,Campbell K,Tian Y X,Zhang S W,Lei H T,Jiang Y M.Talanta,2013,103:306-313

  13. [13]

      Jester ELE,Abraham A,Wang Y S,El Said K R,Plakas S M.Food Chem.,2014,145:593-598

  14. [14]

      Liu Y C,Jiang W,Chen Y J,Xiao Y,Shi J L,Qiao Y B,Zhang H J,Li T,Wang Q.J.Immunol.Methods, 2013,395(1-2):29-36

  15. [15]

      DAI Jin-Bo,XU Zhen-Lin,LIU Feng-Yin,YANG Jin-Yi,SUN Yuan-Ming,WANG Hong,LEI Hong-Tao,SHEN Yu-Dong.Chinese J.Anal.Chem.,2015,43(6):871-875戴尽波,徐振林,刘凤银,杨金易,孙远明,王弘,雷红涛,沈玉栋.分析化学,2015,43(6):871-875

  16. [16]

      QIAO Zi-Wen,WANG Hai-Yu,WANG Lei.Chinese J.Lumin.,2014,35(7):791-794乔自文,王海宇,王雷.发光学报,2014,35(7):791-794

  17. [17]

      HU Li-Hua,ZHOU Di,ZHU Jian,HUANG Zhi-Bin.Chemical Research and Application,2010,22(8):969-974胡丽华,周弟,朱健,黄志斌.化学研究与应用.2010,22(8):969-974

  18. [18]

      Chen J,Liu T,Chen Z,HouJ,Wu Y.J.Med.Virol.,2015,87(11):1940-1945

  19. [19]

      Zhang Z,Liu J F,Feng T T,Yao Y,Gao L H,Jiang G B.Environ.Sci.Technol.,2013,47(1):454-462

  20. [20]

      Shi H Y,Sheng E Z,Feng L,Zhou L L,Hua X D,Wang M H.Environ.Sci.Pollut.R.,2015,22(19):14882-14890

  21. [21]

      JIN Jing,LAI Wei-Hua,TU Zu-Xin,LI Peng.Food Sci.,2006,27(12):886-889金晶,赖卫华,涂祖新,李鹏.食品科学,2006,27(12):886-889

  22. [22]

      Zhang J,Gao L,Zhou B,Zhu L,Zhang Y,Huang B A.J.Agr.Food Chem.,2011,91(2):193-197

  23. [23]

      GB/T 18932.24-2005,Method for the Determination of the Metabolite Residues of Furaltadon,Nitrofurazone,Nitrofurantoin and furazolidone in Honey-Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Method.National Standards of the People's Republic of China蜂蜜中吠喃它酮、吠喃西林、吠喃妥因和吠喃哇酮代谢物残留量的测定方法液相色谱-串联质谱法.中华人民共和国国家标准.GB/T 18932.24-2005

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  Figure 1  Schematic diagram of indirect competitive-time resolved fluorimmunoassay (ic-TRFIA)

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  Figure 2  Purification of Eu³⁺-goat anti mouse IgG

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  Figure 3  Standard curve of ic-TRFIA for 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone (AMOZ)(n=3)

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  Figure 4  Analysis of matrix effect by dilution fish sample with PBS buffer at different ratios(n=3). (a) diluted solution PBS; (b) diluted by 2 folds; (c) diluted by 4 folds; (d) diluted by 6 folds

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  Figure 5  Correlation of AMOZ assay between ic-TFRIA and HPLC-MS/MS

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  Table 1.  Cross-reactivity with furaltadone analogues

  标准品Standard samples	半抑制浓度IC50(μg/L)	交叉反应率*Cross-reactivity(%)
  呋喃它酮代谢物3-Amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone, AMOZ	90.52	0.28
  呋喃西林代谢物Semicarbazide, SEM	> 3000	< 0.01
  呋喃唑酮代谢物3-Amino-2-oxazolidinone, AOZ	> 3000	< 0.01
  呋喃妥因代谢物1-Aminohydantoin, AHD	> 3000	< 0.01
  呋喃它酮Furaltadone	0.91	28.57
  呋喃妥因Nitrofurantoin	> 3000	< 0.01
  呋喃西林Nitrofurazone	> 3000	< 0.01
  呋喃唑酮Furazolidone	> 3000	< 0.01
  邻硝基苯甲醛2-Nitrobenzaldehyde, NP	> 3000	< 0.01
  呋喃它酮代谢物邻硝基苯甲醛衍生物NPAMOZ	0.26	100
  呋喃妥因代谢物邻硝基苯甲醛衍生物NPAHD	> 3000	< 0.01
  呋喃唑酮代谢物邻硝基苯甲醛衍生物NPAOZ	> 3000	< 0.01
  呋喃西林代谢物邻硝基苯甲醛衍生物NPSEM	> 3000
  *注(Notes)：AMOZ的IC50与功能类似的IG50的比值(Percentage of IC50 of AMOZ to IC50 of functional analogue)。

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  Table 2.  Recoveries of AMOZ from spiked food samples by ic-TRFIA and HPLC-MS/MS

  添加浓度Spiked(ng/g)	ic-TRFIA				HPLC-MS/MS
  	检测值Found(ng/mL)	回收率Recovery(%)	RSD(%, n=3)		检测值Found(ng/mL)	回收率Recovery(%)	RSD(%, n=3)
  1	0.94±0.073	94.4	7.8		0.78±0.09	78.0	11.5
  3	3.24±0.45	107.9	13.9		2.58±0.23	86.0	8.9
  9	9.2±1.6	101.7	17.7		7.63±1.0	84.8	13.8

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