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显微荧光光谱原位测定红树植物根表面微区中的蒽

谭华东 ,  李锐龙 ,  朱亚先 ,  张勇

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引用本文: 谭华东,  李锐龙,  朱亚先,  张勇. 显微荧光光谱原位测定红树植物根表面微区中的蒽[J]. 分析化学, 2016, 44(8): 1281-1285. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.160049 shu
Citation:  TAN Hua-Dong,  LI Rui-Long,  ZHU Ya-Xian,  ZHANG Yong. In situ Determination of Anthracene Adsorbed onto Mangrove Root Surface Micro-zone Using Microscopic Fluorescence Spectrometric Analysis System[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2016, 44(8): 1281-1285. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.160049 shu

显微荧光光谱原位测定红树植物根表面微区中的蒽

  • 1.

    厦门大学环境与生态学院, 近海海洋环境科学国家重点实验室, 厦门 361102;

  • 2.

    厦门大学化学与化工学院, 厦门 361005

  • 基金项目:

    本文系国家自然科学基金（Nos.21577110，21177102），高等学校博士学科点专项科研基金（No.20130121130005）项目资助

摘要: 自行搭建显微荧光光谱分析（Microscopic fluorescence spectrometric analysis，MFSA）系统，并将其用于吸附于红树植物秋茄（Kandelia obovata，K.obovata）和白骨壤（Avicennia marina，A.marina）根表面微区中蒽（Anthrancene，Ant）的原位测定。在同步扫描模式下，以波长差为60 nm，吸附于K.obovata和A.marina根表面微区中Ant（5.3 pg/μm2）的荧光信号有最大信噪比（5.5和6.8）。所建方法的线性范围分别为5.3～63.2 pg/μm2和10.5～52.6 pg/μm2，检出限分别为1.1和5.5 pg/μm2，相对标准偏差均小于12.5%（n=9），加标回收率分别为98.1%～117.0%和81.2%～110.9%。结果表明，搭建的MFSA系统具备原位获取植物根表面微区Ant荧光光谱定量信息和荧光图像信息的能力。

English

  • 1.   引言

    多环芳烃(PAHs)是一类环境中普遍存在的持久性有机污染物，具有“三致”效应和内分泌干扰作用[1]。研究表明，沉积物/土壤中的PAHs多经间隙水迁移、扩散至植物根系表面，再经根表吸收进入植物中[2, 3]。这成为PAHs进入食物链，进而危及人类和其他生物健康的重要途径之一。因此，探讨植物根系表面吸收PAHs的过程，对准确评价植物污染及其对人体健康暴露具有重要意义。

    环境微界面是影响PAHs迁移、转化的基本要素之一[4]。PAHs在植物-环境微界面上的环境行为对PAHs进入植物有着重要的影响[5]。现有分析植物中PAHs的方法，如：气相色谱、液相色谱和高效液相色谱等，虽灵敏度高、选择性好，但传统的前处理方法破坏了PAHs在样品中的原始赋存状态[6]。鉴于此，Wang等构建了固体表面荧光光谱法(Solid surface fluorimetry, SSF)，原位测定红树叶片表面吸附的蒽[7]；Li等采用激光诱导时间纳秒分辨荧光法原位测定红树植物根表面的菲、芘和苯并[a]芘[8, 9]。然而，植物表面是一个非均匀的体系，其各组织、器官有不同的微结构，这使得PAHs的宏观平均含量无法指示植物表面PAHs的微观吸收行为[7, 10]。

    荧光显微技术可原位观察PAHs微区环境行为。Wang等利用荧光显微技术，实现了PAHs在植物叶片表层和内部的迁移和分布过程追踪[11]；Wild等采用激光共聚焦荧光显微技术，原位观测PAHs在植物中的迁移、存储、转化和归趋[10, 12]。若将荧光光谱技术与荧光显微技术联用，将为原位定量探讨植物表面微区中PAHs的环境行为提供可能。

    本研究利用FLS920荧光光谱仪和Olympus IX 73倒置荧光显微镜(Inverted fluorescence microscopy, IFM)搭建显微荧光光谱分析(Microscopic fluorescence spectrometric analysis, MFSA)系统，以水、土壤/沉积物中广泛分布的典型PAHs蒽为目标物[13, 14]，新鲜的红树植物秋茄(Kandelia obovata, K. obovata)和白骨壤(Avicennia marina, A. marina)根为基质，利用根表面微区中Ant的显微荧光光谱进行原位测定。

    2.   实验部分

    2.1.   仪器、试剂与材料

    Olympus IX 73 IMF(日本Olympus公司)；FLS 920荧光光谱仪(英国Edingburgh Instrument公司)；液体光纤(美国Newport公司)；5 mL移液管(上海申立玻璃仪器有限公司)；50μL平口微量进样器(上海医疗激光仪器厂)；Ant(纯度>99%，美国Aldrich公司)；丙酮(分析纯，广东西陇化工有限股份公司)。

    蒽储备液：称取0.1005 g蒽，用丙酮溶液配制100 mL 1.00 g/L的储备液，于4℃储存备用。实验时，采用逐级稀释法配制不同浓度蒽的工作液。

    样品准备：于福建省漳江口红树林国家级自然保护区(23°55′N, 117°25′E)采集K. obovata、A. marina两种红树胚轴，沙培种植8个月后摘取成熟度相近、大小长度近似的新鲜根，备用。

    2.2.   MFSA系统的搭建

    如图 1所示，实验室自行搭建的MFSA系统主要包括3个部分：荧光光谱系统(FLS920荧光光谱仪)；微区定位、观测和成像系统(Olympus IX 73 IMF)；光纤连接系统(Newport液体光纤)。氙灯提供的激发光经光路系统、光纤导至Olympus IX 73 IMF的分光系统中，再经物镜照射至待测样品；样品反射目标物的荧光至Olympus IX 73 IMF的分光系统中，相关信号导入CCD成像，获取微区中目标物的分布信息。切换Olympus IX 73 IMF的分光装置至使用状态，荧光信号经光纤导至FLS920荧光光谱的检测系统(PMT检测器)，获取同一微区中目标物的光谱信息。

    图 1

    图 1  显微荧光光谱分析系统装置示意图
    Figure 1.  Schematic diagram of microscopic fluorescence spectrometric analysis (MFSA) system
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    2.3.   实验方法

    新鲜的K. obovata和A. marina根先后用自来水、Milli-Q水各冲洗5次，用滤纸拭干表面的水分。按文献[8]所述实验方法，将系列浓度蒽的丙酮溶液均匀涂覆于根表面，暴露后将新鲜根固定。采用MFSA系统测定根表面一定数量(n=9)微区的荧光强度，每个微区测定3次，取平均值；切换分光装置，获取同一微区显微图像。实验时，MFSA系统的基本工作参数见表 1。

    表 1

    表 1  显微荧光光谱分析系统相关工作参数
    Table 1.  Operating parameters of MFSA system
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    FLS 920荧光光谱仪FLS 920 fluorescence spectrometer Olympus IX 73荧光显微镜Olympus IX 73fluorescence microscope
    工作参数Working parameters 数值Value 工作参数Working parameters 数值Value
    扫描模式Scanning mode 同步光谱Synchronous spectra 物镜Objective 10倍/数值孔径0.310X/0.30
    波长差Wavelength offset (nm) 60 滤色镜转盘Filter wheel (Ex): 360~410 nm，(Em)：420~495 nmAT-DAPI/hoechst/AlexaFluor350
    扫描范围Scanning range (nm) 360~420 图片分辨率Image resolution (px) 2160×2560
    激发/发射狭缝Emission/excitation slit (nm) 19 曝光时间Exposure time (s) 0.6 s
    氙灯光源Xenon lamp (W) 450 汞灯光源Mercury lamp 关闭off

    3.   结果与讨论

    3.1.   吸附于K. obovata和A. marina表面微区中蒽的同步荧光光谱

    研究表明，红树根表面会产生强烈的自发荧光和散射光[8]，会影响微区中蒽的荧光信号测定(如图 2a)。同步荧光法可在一定程度上降低背景荧光和散射光信号的干扰[15]。每隔5 nm，考察Δλ=35～70 nm波长范围内对吸附于K. obovata根表面微区中蒽的最大荧光强度的影响(图 2b)，当Δλ=60 nm，所测荧光信号的信噪比可提高至5.5。在Δλ=60 nm条件下，扫描吸附于K. obovata根表面微区中蒽的同步荧光光谱(图 3)，蒽的最大峰值位于383 nm。因A. marina结果与之类似(最大峰值位于382 nm)，故未列出。

    图 2

    图 2  吸附于秋茄根表面微区中蒽的荧光光谱(a：荧光发射光谱；b：同步荧光光谱波长差条件优化)
    Figure 2.  Fluorescence spectra of anthracene (Ant) adsorbed on K. obovata root surface micro-zone (a: emission spectra; b: optimization of wavelength offset of synchronous fluorescence spectra)
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    图 3

    图 3  吸附于K. obovata根表面微区中蒽的同步荧光光谱(Δλ=60 nm; 0:空白, 1: 5.3, 2: 10.5, 3: 21.0, 4: 31.6, 5: 42.1, 6: 52.6, 7: 63.1 pg/μm2)
    Figure 3.  Synchronous fluorescence spectra of Ant adsorbed on K. obovata root surface micro-zone (Δλ=60 nm; 0: blank, 1: 5.3, 2: 10.5, 3: 21.0, 4: 31.6, 5: 42.1, 6: 52.6, 7: 63.1 pg/μm2)
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    文献[10, 16]表明，吸附于植物根表面PAHs主要分布于在根表皮细胞间隙中。图 4为K. obovata表面微区中的蒽吸附量为21.04 pg/μm2时的MFSA显微图像，微区中目标物的亮度明显增加。如图 4b所示，吸附于根表面微区中的蒽部分以聚集态形式分布于根表皮(如黄色箭头所示)。

    图 4

    图 4  吸附于K. obovata根表面微区中蒽的荧光显微图像(a：空白, b：21.04 pg/μm2)
    Figure 4.  MFSA images of Ant directly adsorbed on K. obovata root surface micro-zone (a: blank, b: 21.04 pg/μm2)
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    3.2.   工作曲线、线性范围和检出限

    为实现原位定量测定吸附于K. obovata和A. marina根表面微区中的蒽，配制系列浓度的蒽-丙酮溶液，按照2.3节所述方法，分别测定根表面微区中不同浓度蒽的相对荧光强度(图 3)。随着根表微区中蒽浓度的增加，其荧光强度呈线性增加(R2=0.9660)；A. marina的结果与其类似；相关数据见表 2。这表明本方法在一定浓度范围具备定量分析性能。

    表 2

    表 2  MFSA方法的分析特性(n=9)
    Table 2.  Analytical performance of MFSA (n=9)
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    根Root 校正曲线方程Equation ofcalibration curve 线性范围Linear range(pg/μm2) 相关系数Correlation coefficient 检测限Detection limit(pg/μm2)
    秋茄K. obovata y=2764.3x+24696 5.3～63 0.9660 1.1
    白骨壤A. marina y=3150.2x+13384 10～52 0.9825 5.5
    x:吸附于根表面微区中蒽的浓度(pg/μm2)；y:相对荧光强度。x: The concentration of Ant adsorbed onto root surface micro-zone (pg/μm2); y: Relative fluorescence intensity.

    3.3.   回收率实验和精密度实验

    为验证MFSA法原位测定K. obovata和A. marina根表面微区中蒽的分析特性，参考文献[11]中加标回收率的计算方法，采用2.2节所述方法作加标回收率实验。由表 3可知，K. obovata和A. marina根表微区蒽测定方法的准确度可满足实验要求。

    表 3

    表 3  两种红树根表面微区中蒽的加标回收率(n=9)
    Table 3.  Recoveries for Ant adsorbed onto root micro-zone of two kinds of mangrove plant (n=9)
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    根Root 初始值Original(pg/μm2) 添加值Added(pg/μm2) 总测量值Total(pg/μm2) 测量值Measured(pg/μm2) 回收率Recovery(%) 相对标准偏差RSD(%, n=9)
    秋茄K. obovata 15.8 10.5 25.2 12.3 117.0 7.6
    21.0 15.8 34.7 15.5 98.1 6.4
    31.6 21.0 47.7 22.4 106.6 3.8
    白骨壤A. marina 15.8 10.5 25.7 11.7 110.9 6.9
    21.0 15.8 35.6 12.8 81.2 8.7
    31.6 21.0 49.5 20.1 95.5 9.2

    采用2.3节所述的实验方法测定吸附于K. obovata和A. marina根表面微区中36.8 pg/μm2蒽，测定9个不同微区，每个微区分别测定3次。由表 4可知，方法的重复性和精密度满足实验要求。

    表 4

    表 4  MFSA方法的精密度(n=9)
    Table 4.  Precision of MFSA method (n=9)
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    根Root 平均含量Average content(pg/μm 2) 标准偏差SD(pg/μm 2) 相对标准偏差RSD(%)
    秋茄K. obovata 36.4 4.4 12.2
    白骨壤A. marina 34.6 2.5 7.1

    4.   结论

    上述结果表明，所建MFSA系统具备原位获取红树根表面微区目标物荧光光谱和荧光图像信息的能力。为在实验室模拟生态条件下原位探讨植物根部微区中PAHs的环境行为提供了新方法。然而，较采用LITRF法原位测定红树植物根系表面(非微区)单组分PAHs和两组分混合PAHs的检出限[8, 9]相比，本方法仍有很大的提升空间。文献[8, 17]中所分别采用自行设计的多用途荧光比色皿和固体样品架，为进一步提升本方法的分析性能提供了研发思路。

    1. [1]

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      LI Rui-Long,ZHU Ya-Xian,ZHANG Yong.Chinese J.Anal.Chem.,2015,43(6):914-918李锐龙,朱亚先,张勇.分析化学,2015,43(6):914-918

  • Figure 1  Schematic diagram of microscopic fluorescence spectrometric analysis (MFSA) system

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    Figure 2  Fluorescence spectra of anthracene (Ant) adsorbed on K. obovata root surface micro-zone (a: emission spectra; b: optimization of wavelength offset of synchronous fluorescence spectra)

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    Figure 3  Synchronous fluorescence spectra of Ant adsorbed on K. obovata root surface micro-zone (Δλ=60 nm; 0: blank, 1: 5.3, 2: 10.5, 3: 21.0, 4: 31.6, 5: 42.1, 6: 52.6, 7: 63.1 pg/μm2)

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    Figure 4  MFSA images of Ant directly adsorbed on K. obovata root surface micro-zone (a: blank, b: 21.04 pg/μm2)

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    Table 1.  Operating parameters of MFSA system

    FLS 920荧光光谱仪FLS 920 fluorescence spectrometer Olympus IX 73荧光显微镜Olympus IX 73fluorescence microscope
    工作参数Working parameters 数值Value 工作参数Working parameters 数值Value
    扫描模式Scanning mode 同步光谱Synchronous spectra 物镜Objective 10倍/数值孔径0.310X/0.30
    波长差Wavelength offset (nm) 60 滤色镜转盘Filter wheel (Ex): 360~410 nm，(Em)：420~495 nmAT-DAPI/hoechst/AlexaFluor350
    扫描范围Scanning range (nm) 360~420 图片分辨率Image resolution (px) 2160×2560
    激发/发射狭缝Emission/excitation slit (nm) 19 曝光时间Exposure time (s) 0.6 s
    氙灯光源Xenon lamp (W) 450 汞灯光源Mercury lamp 关闭off
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    Table 2.  Analytical performance of MFSA (n=9)

    根Root 校正曲线方程Equation ofcalibration curve 线性范围Linear range(pg/μm2) 相关系数Correlation coefficient 检测限Detection limit(pg/μm2)
    秋茄K. obovata y=2764.3x+24696 5.3～63 0.9660 1.1
    白骨壤A. marina y=3150.2x+13384 10～52 0.9825 5.5
    x:吸附于根表面微区中蒽的浓度(pg/μm2)；y:相对荧光强度。x: The concentration of Ant adsorbed onto root surface micro-zone (pg/μm2); y: Relative fluorescence intensity.
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    Table 3.  Recoveries for Ant adsorbed onto root micro-zone of two kinds of mangrove plant (n=9)

    根Root 初始值Original(pg/μm2) 添加值Added(pg/μm2) 总测量值Total(pg/μm2) 测量值Measured(pg/μm2) 回收率Recovery(%) 相对标准偏差RSD(%, n=9)
    秋茄K. obovata 15.8 10.5 25.2 12.3 117.0 7.6
    21.0 15.8 34.7 15.5 98.1 6.4
    31.6 21.0 47.7 22.4 106.6 3.8
    白骨壤A. marina 15.8 10.5 25.7 11.7 110.9 6.9
    21.0 15.8 35.6 12.8 81.2 8.7
    31.6 21.0 49.5 20.1 95.5 9.2
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    Table 4.  Precision of MFSA method (n=9)

    根Root 平均含量Average content(pg/μm 2) 标准偏差SD(pg/μm 2) 相对标准偏差RSD(%)
    秋茄K. obovata 36.4 4.4 12.2
    白骨壤A. marina 34.6 2.5 7.1
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  • 收稿日期:  2016-01-18
  • 修回日期:  2016-04-19
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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