English

• 1.   引言

  非蛋白氮指除蛋白质以外的含氮化合物的总称，包括游离氨基酸、酰胺类、蛋白质降解的含氮化合物、氨以及铵盐等简单含氮化合物等。2008年，我国发生的乳制品中三聚氰胺事件，对消费者健康造成了伤害，并导致了6人死亡，也给我国的乳品企业带来毁灭性打击。2013年1月，新西兰牛奶及奶制品中被检测出低含量的双氰胺。虽然三聚氰胺、双氰胺等非蛋白氮化合物是低毒性的，但是这些非蛋白氮类化合物都会给人体带来伤害，尤其是对以配方乳粉为主食的婴幼儿。

  现行测定食品中蛋白质含量的经典方法为凯氏定氮法^[1]，该方法测定的是样品中氮含量，而不是直接测定蛋白质含量。一些不法商贩可能通过添加含氮化合物以增加乳及乳制品的表观蛋白质含量，从而提高蛋白质含量的测定值。目前，我国涉及非蛋白氮的检测方法^{[2, 3]}，均是采用沉淀蛋白后对非蛋白氮化合物中的氮含量进行测定，方法灵敏度较差，而且检测过程容易受到蛋白质沉淀不完全等因素的干扰，对结果的准确性产生影响。采用气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法等仪器方法对非蛋白氮化合物进行检测的报道，多集中在三聚氰胺、三聚氰酸、L-羟脯氨酸、双氰胺、尿素、缩二脲、灭蝇胺或其中的几种^[4~16]，而对多种非蛋白氮化合物同时筛查的报道较少。Abernethy等^[17]建立了鲜牛奶中非法添加物的检测方法，可对鲜牛奶中23种非蛋白氮化合物进行筛查，但是对基质组成更为复杂的婴幼儿配方乳粉中多种非蛋白化合物同时筛查的方法未见报道。

  目前针对非蛋白氮化合物，仅对三聚氰胺制定了相关临时管制限量，其中限量要求最低的为中国台湾地区，为50μg/kg。对于三聚氰酸，现在仅有美国FDA相关内部检测方法^[18-19]对三聚氰酸的测定低限为50μg/kg，我国对三聚氰酸的测定低限为25μg/kg^[20]，而对于其余非蛋白氮化合物，我国还没有出台法律法规，建立相配套的快速、简便的非蛋白氮类化合物检测方法。

  本研究建立了基质分散固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定婴幼儿配方乳粉中的的三聚氰胺、灭蝇胺、脒脲、氨基三嗪、3-氨基三唑、4-氨基三唑、三聚氰酸、双氰胺、硫脲、氨基脲、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-精氨酸、L-羟脯氨酸、三聚氰胺一酰胺、三聚氰胺二酰胺、胍、尿囊素、L-茶氨酸等19种非蛋白氮化合物的方法，采用基质分散固相萃取法进行前处理，高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)同时测定，电喷雾离子化正模式(ESI⁺)和负模式(ESI⁺)同时扫描，方法操作简单、快速，可同时对多种非蛋白氮化合物快速筛查，满足目前快速、简便、高通量的需要。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  API5500串联质谱仪(美国AB公司，配有ESI源)；Agilent 1290液相色谱仪(美国Agilent公司)；分析天平(德国Sartorius公司)；离心机(美国Backman公司)；超声波发生装置(德国Elma公司)。

  乙腈、三氯甲烷(HPLC级，Promptar公司)；甲酸、乙酸铵(HPLC级，美国Sigma公司)；三乙胺(中国医药上海化学试剂公司)；无水MgSO₄(天津迪马公司)；C₁₈(天津迪马公司)。0.22μm有机相滤膜(上海安谱公司)。

  标准品：三聚氰胺、灭蝇胺、脒脲、氨基三嗪、3-氨基三唑、4-氨基三唑、三聚氰酸、双氰胺、硫脲、氨基脲、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-精氨酸、L-羟脯氨酸、三聚氰胺一酰胺、三聚氰胺二酰胺、胍、尿囊素、L-茶氨酸(纯度≥95%，美国Sigma公司)。三聚氰酸-¹³C₃、三聚氰胺-¹³C₃内标标准品(纯度≥95%，加拿大CDN公司)。标准品配制:分别称取0.01 g上述标准品(精确到0.0001 g)，三聚氰酸、三聚氰胺一酰胺、三聚氰胺二酰胺、¹³C₃-三聚氰酸标准品用200μL三乙胺溶解，以乙腈稀释，并定容至10 mL，终浓度为1.0 mg/mL；L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-精氨酸、L-羟脯氨酸、L-茶氨酸用1.0 mL水溶解，以乙腈稀释并定容至10 mL，终浓度为1.0 mg/mL；其余标准品直接用乙腈溶解稀释，并定容至10 mL，终浓度为1.0 mg/mL；上述标准品于-18℃避光保存。

  2.2.   样品处理与检测

  2.2.2.   色谱/质谱条件

  Merck ZIC-HILIC色谱柱(150 mm×2.1 mm，5μm, 20 nm); 流动相A: 10 mmol/L乙酸铵溶液，流动相B:含0.1%甲酸的乙腈; 流速: 0.3 mL/min; 进样量: 10μL; 柱温: 35℃; 梯度洗脱程序: 0~6 min，0% A; 6~8 min，0%~5% A; 8~10 min，5%~10% A; 10~12 min，10%~12% A; 12~15 min，12%~15% A; 15~18 min，15% A; 18~19.5 min，15~30% A; 19.5~24.5 min，30%A; 24.5~25 min，0%A。

  电喷雾电压(IS):正模式: 5500 V，负模式:-4500 V; 雾化气压力(GS1): 380 kPa(50 psi); 气帘气压力(CUR): 172 kPa(25 psi); 辅助气流速(GS2): 310 kPa(45 psi); 离子源温度(TEM): 500℃。监测离子对、碰撞电压(CE)、去簇电压(DP)如表 1所示。

  表 1

  

  表 1  19种非蛋白氮化合物的多反应检测离子对、质谱相关参数表

  Table 1.  Multiple reaction monitoring transition, mass spectrometric information of 19 kinds of nonprotein nitrogen compounds

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  编号No.	化合物Compound	分子式Moecularformula	检测模式Mode	母离子Precursorion(Q1)	子离子Production(Q3)	碰撞能Collisionenergy(eV)	去簇电压Declusteringpotential(V)	保留时间Retentiontime(min)
  1	氨基三嗪 Aminotriazine	C3H4N4	ESI+	96.9	70.1* 42.1	21 28	45	2.52
  2	4-氨基三唑 4-Aminotriazole	C2H4N4	ESI+	84.9	58.0* 43.0	20 41	57	10.91
  3	双氰胺 Dicyandiamide	C2H4N4	ESI+	85.0	68.0* 43.0	20.5 22	60	11.31
  4	硫脲 Thiourea	CH4N2S	ESI+	77.0	60.1* 43.0	23 49	39	11.10
  5	3-氨基三唑 3-Aminotriazole	C2H4N4	ESI+	84.9	57.1* 43.0	23 36	61	12.99
  6	灭蝇胺 Cyromazine	C6H10N6	ESI+	167.2	85.0* 125.2	25 23	65	13.67
  7	氨基脲 Semicarbazide	CH5N3O	ESI+	76.1	59.0* 76.1	16 5	42	13.80
  8	三聚氰胺 Melamine	C3H6N6	ESI+	127.1	85.5* 68.4	27 43	71	17.20
  9	L-亮氨酸 L-Leucine	C6H13NO2	ESI+	132.1	86.2* 132.1	19 5	50	16.33
  10	L-异亮氨酸 L-Isoleucine	C6H13NO2	ESI+	132.1	86.2* 132.1	19 5	50	16.87
  11	三聚氰胺一酰胺 Ammelide	C3H4N4O2	ESI+	129.0	87.0* 43.0	23 40	70	15.48
  12	脒脲 Amidinourea	C2H6N4O	ESI+	102.9	60.0* 85.9	36 13.5	39	19.24
  13	三聚氰胺二酰胺 Ammeline	C3H5N5O	ESI+	128.0	86.0* 43.0	23 40	72	19.51
  14	L-茶氨酸 L-Theanine	C7H14N2O3	ESI+	175.1	158.1* 130.0	16 21	61	19.40
  15	胍 Guanidine	CH5N3	ESI+	60.0	43.0* 60.0	50 5	103	20.66
  16	L-羟脯氨酸 L-Hydroxyproline	C5H9NO3	ESI+	132.1	86.2 68.3*	19 30	50	21.38
  17	L-精氨酸 L-Arginine	C6H14N4O2	ESI+	175.1	158.1* 115.9	16 21	61	21.73
  18	三聚氰酸 Cyanuric acid	C3H3N3O3	ESI-	127.9	42.0* 85.0	28 14	-50	10.84
  19	尿囊素 Allantoin	C4H6O3N4	ESI-	156.9	113.7* 97.0	-18 -23	-52	14.31
  20	13C3-三聚氰胺 13C3-Melamine		ESI+	130.1	87.4	27	61	17.37
  21	13C3-三聚氰酸 13C3-Cyanuric acid		ESI-	130.9	43.0	30	-45	10.82
  *:定量离子对(The symbol“*”represents the quantitative transition)。

  2.2.1.   样品提取与净化

  称取0.5 g试样于10 mL塑料离心管中，加入2 mL水溶解混匀，加入适量内标溶液、200μL甲酸和2 mL三氯甲烷，涡旋混合5 min，超声处理10 min，10000 r/min离心10 min，收集上清液，取100μL上清液，加入1 mL 20%(V/V)甲酸-乙腈，涡旋混合30 s，待净化。

  将待净化液转移至2 mL离心管内，加入50 mg无水MgSO₄，50 mg C₁₈，涡旋混合30 s，10000 r/min离心1 min，上清液过0.22μm微孔滤膜，进行HPLC-MS/MS分析。

  3.   结果与讨论

  3.1.   液相色谱和质谱条件的优化

  3.2.   前处理条件的优化

  本研究中非蛋白氮化合物大部分为碱性化合物，如带氨基的三聚氰胺等，也有小部分酸性化合物，如带羧基的三聚氰酸等。在提取前，采用甲酸沉淀蛋白，用三氯甲烷除去待测化合物中的脂肪。非蛋白氮化合物极性较强，因此采用有机溶剂提取非蛋白氮化合物。考察了乙腈、甲醇等有机溶剂对上述化合物的提取效率，与甲醇相比，乙腈对上述大部分化合物的提取效率较高。本方法采用乙腈提取上述19种非蛋白氮类化合物。

  本研究涉及的非蛋白氮化合物种类多、差异性大，考察了常规的固相萃取柱C₁₈、HLB对上述化合物的净化效果，由于化合物的极性较大，部分化合物在上述固相萃取柱上没有保留，回收较差，因此改用基质分散固相萃取方法对上述化合物进行净化。基质分散固相萃取(QuEChERS)具有快速、简便、环保等诸多优点，近年来已稳定应用于农、兽药物残留的检测^[21~24]。考察了C₁₈、GCB、PSA等多种净化剂对非蛋白氮化合物的净化效果，结果表明，与C₁₈相比，GCB、PSA对非蛋白氮类化合物的吸附较大，方法选择C₁₈对上述化合物进行净化(图 3); 考察了C₁₈的用量(0, 50和100 mg)对测定结果的影响，综合考虑净化效果和C₁₈对非蛋白氮化合物吸附的影响，选择添加50 mg C₁₈对非蛋白氮化合物进行净化(图 4)。由于本方法采用HILIC色谱柱对化合物进行分离，样品中残留的水分易造成化合物保留时间漂移，因此在QuEChERS粉末配制时加入50 mg MgSO₄，除去残留在提取液中的部分水分。

  图 3

  

  图 3  不同QuCHERS粉末对19种非蛋白氮化合物回收率的影响

  Figure 3.  Effect of different kinds of QuCHERS on the recovery of 19 kinds of nonprotein nitrogen compounds

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  图 4

  

  图 4  C₁₈用量对19种非蛋白氮化合物回收率的影响

  Figure 4.  Effect of C₁₈ quantities on the recovery of 19 kinds of nonprotein nitrogen compounds

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  3.3.   方法学验证

  3.4.   实际样品测定

  采用本方法对30批婴幼儿奶粉中的非蛋白氮化合物进行筛查，奶粉中均含有L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-羟脯氨酸、和L-精氨酸，含量在0.47~2.54 mg/kg之间，上述化合物为常见氨基酸，奶中本身就含有少量上述氨基酸; 尿囊素来源于动物体内，含量在0.23~6.15 mg/kg之间; 三聚氰胺含量在0.02~0.04 mg/kg之间，来源于包装材料的污染，未发现有非法添加非蛋白氮化合物的现象。

  3.1.1.   质谱条件的优化

  分别在电喷雾正离子以及负离子检测模式下，上述非蛋白氮化合物标准溶液用蠕动泵以0.1μg/mL流动注射进行母离子扫描，分别确定其目标母离子，再对母离子施加一定的碰撞能量，使其产生特定的子离子，然后优化化合物的二级质谱的碰撞能量，选取丰度强且干扰较少的两对子离子，以MRM模式优化各质谱参数，其中三聚氰胺、灭蝇胺、脒脲、氨基三嗪、3-氨基三唑、4-氨基三唑、双氰胺、硫脲、氨基脲、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-精氨酸、L-羟脯氨酸、三聚氰胺一酰胺、三聚氰胺二酰胺、L-茶氨酸、胍形成[M+H]⁺的加和离子，以多反应监测(MRM)正模式检测，尿囊素、三聚氰酸形成[M－H]⁺的加和离子，以多反应监测(MRM)负模式检测。

  3.1.2.   液相色谱条件的优化

  非蛋白氮化合物极性较强，采用普通的C₁₈柱不能全部保留，参考文献[17]，本研究选择亲水相互作用色谱(HILIC)柱对上述化合物进行分离。方法考察了19种非蛋白氮化合物在Water以及Merck等HILIC色谱柱上的保留情况，最终选择Merck的ZIC HILIC色谱柱对上述19种化合物进行分离(图 1)。

  图 1

  

  图 1  19种非蛋白氮化合物TIC图谱(a)正离子模式(b)负离子模式

  Figure 1.  TIC chromatogram of 19 kinds of nonprotein nitrogen compounds (a) ESI⁺ mode; (b) ESI⁺ mode

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  采用HILIC模式对19种非蛋白氮化合物进行分离，分别改变流动相中盐的浓度(乙酸铵和甲酸缓冲盐)和pH值等参数; 在无盐条件下，L-羟脯氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸等非蛋白氮化合物峰形差，当提高乙酸铵浓度至100 mmol/L，上述L-羟脯氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸等非蛋白氮化合物峰峰形非常好，但是高盐浓度影响其它非蛋白氮化合物的灵敏度，综合考虑两方面因素，调整水相中乙酸铵浓度为10 mmol/L。在此色谱柱和流动相条件下，19种非蛋白氮化合物中3对互为同分异构体的化合物，3-氨基三唑、4-氨基三唑、双氰胺; L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-羟脯氨酸以及L-茶氨酸、L-精氨酸均能达到基线分离(图 2)。

  图 2

  

  图 2  3对同分异构体的多反应检测色谱图(a) 3-氨基三唑, 4-氨基三唑, 双氰胺; (b) L-羟脯氨酸, L-羟脯氨酸以及L-茶氨酸, C L-茶氨酸, L-精氨酸)

  Figure 2.  MRM chromatograms of 3 groups of isomers(a) 3-aminotriazole, 4-aminotriazole and dicyandiamide; (b) L-leucine, L-isoleucine and L-hydroxyproline; (c) L-theanine and L-arginine)

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  3.3.1.   线性方程、线性相关系数、检出限及定量限

  在空白奶粉基质溶液中添加目标化合物，以特征离子色谱峰的信噪比(S/N)=10为定量限(LOQ)，S/N=3为检出限(LOD)。在本方法所确定的实验条件下，分别以0、0.5倍定量限(LOQ)、1倍LOQ、2倍LOQ、4倍LOQ配制基质标准溶液进行测定，以定量离子的响应峰面积比值(Y轴)对相应的质量浓度比值(X轴)作图; 在0~4倍LOQ范围内，定量离子的响应峰面积和样品浓度之间有良好的线性关系相，关系数(r)均大于0.99。19种非蛋白氮化合物的检出限和定量限见表 2。

  表 2

  

  表 2  19种非蛋白氮化合物的线性方程、线性相关系数、检出限及定量限

  Table 2.  Linear equation, linear correlation, limit of determination (LOD) and limit of quantitation (LOQ) of 19 kinds of nonprotein nitrogen compounds

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  编号No.	化合物Compound	线性方程Linear equation	相关系数Correlation coefficient(r)	检出限LOD(mg/kg)	定量限LOQ(mg/kg)
  1	氨基三嗪Aminotriazine	y=0.0307x+0.364	0.9928	0.15	0.5
  2	4-氨基三唑4-Aminotriazole	y=0.139x+0.504	0.9978	0.015	0.05
  3	双氰胺Dicyandiamide	y=9.84×10-6x+0.000157	0.9983	0.3	1.0
  4	硫脲Thiourea	y=4.24×107x+0.000170	0.9915	1.5	5.0
  5	3-氨基三唑3-Aminotriazole	y=0.218x+10.5	0.9975	0.015	0.05
  6	灭蝇胺Cyromazine	y=0.0124x+0.687	0.9959	0.015	0.05
  7	氨基脲Semicarbazide	y=0.000614x+7.17	0.9905	0.3	1.0
  8	三聚氰胺Melamine	y=0.0586x+0.334	0.9942	0.015	0.05
  9	L-亮氨酸L-leucine	y=0.00027x+4.29	0.9913	0.3	1.0
  10	L-异亮氨酸L-Isoleucine	y=0.00245x+0.355	0.9921	0.3	1.0
  11	三聚氰胺一酰胺Ammelide	y=0.00068x+0.0133	0.9918	0.3	1.0
  12	脒脲Amidinourea	y=0.709x+7.67	0.9953	0.015	0.05
  13	三聚氰胺二酰胺Ammeline	y=0.0326x+0.732	0.9965	0.075	0.25
  14	L-茶氨酸L-Theanine	y=0.0027x+8.64×10-9	0.9954	0.3	1.0
  15	胍Guanidine	y=0.181x+5.96	0.9938	0.015	0.05
  16	L-羟脯氨酸L-Hydroxyproline	y=0.329x+8.6	0.9992	0.015	0.05
  17	L-精氨酸L-arginine	y=3.24×10-6x+4.23	0.9902	1.5	5.0
  18	三聚氰酸Cyanuric acid	y=0.0142x+0.0814	0.9913	0.075	0.25
  19	尿囊素Allantoin	y=7.98x+1.47×105	0.9916	1.5	5.0
  20	13C3-三聚氰胺13C3-Melamine
  21	13C3-三聚氰酸13C3-Cyanuric acid

  3.3.2.   回收率和精密度

  采用空白的配方奶粉按表中所述水平添加，按2.2节中测定步骤操作，其中尿囊素以外标法定量，其余18种非蛋白氮化合物以内标法定量，计算每个样品中19种非蛋白氮化合物的含量，回收率结果见表 3。

  表 3

  

  表 3  空白配方奶粉中添加19种非蛋白氮化合物的回收率范围和精密度(n=6)

  Table 3.  Recovery range and precision (RSD) of 19 kinds of nonprotein nitrogen compounds in powdered formulas (n=6)

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  化合物Compound	本底值Back-ground(mg/kg)	添加水平Spiked(mg/kg)	回收率Recovery(%)	RSD(%)
  三聚氰胺Melamine	0.0393	0.05	82.4~109	12.2
  		0.25	90.8~108	7.2
  		2.5	94.8~109	5.6
  灭蝇胺Cyrom-azine	nd	0.05	82.2~110	11.2
  		0.25	98.8~109	4.5
  		2.5	95.2~104	3.4
  脒脲Amidin-ourea	nd	0.05	82.4~108	10.2
  		0.25	90.0~107	6.0
  		2.5	94.0~108	5.7
  氨基三嗪Aminotr-iazine	nd	0.5	90.0~104	6.4
  		1	96.1~103	2.9
  		2.5	92.0~103	4.8
  3-氨三唑3-Aminotr-iazole	nd	0.05	84.2~106	9.6
  		0.25	91.6~107	6.1
  		2.5	94.0~100	2.3
  4-氨基三唑4-aminotr-iazole	nd	0.05	86.4~109	9.5
  		0.25	90.0~102	4.8
  		2.5	93.6~107	4.6
  双氰胺Dicyandi-amide	nd	0.05	84.2~109	10.3
  		0.25	92.0~108	5.8
  		2.5	94.0~108	4.6
  L-羟脯氨酸L-Isoleu-cine	0.943	1	90.3~105	5.7
  		1.5	91.3~106	5.9
  		2.5	94.0~104	3.7
  L-精氨酸L-Arginine	nd	1	89.8~107	7.0
  		1.5	90.4~110	6.6
  		2.5	98.0~104	2.2
  L-羟脯氨酸L-Hydroxy-proline	1.16	5	85.8~109	8.94
  		7.5	94.0~109	5.7
  		10	94.4~104	3.8
  L-茶氨酸L-Theanine	nd	1	90.3~109	7.2
  		1.5	99.3~115	5.6
  		2.5	95.2~102	3.4
  三聚氰胺二酰胺Ammeline	nd	0.05	87.6~110	9.8
  		0.25	91.2~104	5.3
  		2.5	94.8~107	4.6
  三聚氰胺一酰胺Ammelide	6.15	0.25	88.0~109	10.1
  		1	95.2~108	4.5
  		2.5	92.8~104	4.0
  尿囊素Allantoin	nd	5	85.6~102	6.2
  		7.5	97.6~108	3.4
  		10	94.9~99.8	2.2
  硫脲Thiourea	nd	0.05	82.2~110	11.4
  		0.25	91.2~109	7.8
  		2.5	90.0~98.0	4.0
  氨基脲Semicar-bazide	nd	5	90.8~109	7.0
  		7.5	97.7~107	3.0
  		10	94.0~103	3.0
  L-亮氨酸L-leucine	0.915	1	90.1~109	7.9
  		1.5	96.0~107	4.2
  		2.5	97.6~106	3.4
  三聚氰酸Cyanuric acid	nd	0.25	84.4~109	10.1
  		1	91.6~110	6.6
  		2.5	94.8~107	5.6
  胍Guanidine	nd	1	90.5~101	5.1
  		1.5	104~115	4.2
  		2.5	94.0~104	3.4
  nd:未检出(not dectected)。

  4.   结论

  本方法采用基质分散固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定婴幼儿配方乳粉中的19种非蛋白氮化合物。方法采用基质分散固相萃取法进行前处理，高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)同时测定，电喷雾离子化正模式(ESI⁺)和负模式(ESI^-)同时扫描，方法操作简单、快速，可同时对三聚氰胺、灭蝇胺、脒脲、氨基三嗪、3-氨基三唑、4-氨基三唑、三聚氰酸、双氰胺、硫脲、氨基脲、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-精氨酸、L-羟脯氨酸、三聚氰胺一酰胺、三聚氰胺二酰胺、胍、尿囊素、L-茶氨酸等多种非蛋白氮化合物快速筛查，满足现行法规的需要。

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• 

  Figure 1  TIC chromatogram of 19 kinds of nonprotein nitrogen compounds (a) ESI⁺ mode; (b) ESI⁺ mode

  1. Aminotriazine; 2. 4-Aminotriazole; 3. Dicyandiamide; 4. Thiourea; 5. 3-Aminotriazole; 6. Cyromazine; 7. Semicarbazide; 8. Ammelide; 9. L-Leucine; 10. L-Isoleucine; 11. Melamine; 12. Amidinourea; 13. Ammeline; 14. L-Theanine; 15. Guanidine; 16. L-Hydroxyproline; 17. L-Arginine; 18. Cyanuric acid; 19. Allantoin.

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  Figure 2  MRM chromatograms of 3 groups of isomers(a) 3-aminotriazole, 4-aminotriazole and dicyandiamide; (b) L-leucine, L-isoleucine and L-hydroxyproline; (c) L-theanine and L-arginine)

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  Figure 3  Effect of different kinds of QuCHERS on the recovery of 19 kinds of nonprotein nitrogen compounds

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  Figure 4  Effect of C₁₈ quantities on the recovery of 19 kinds of nonprotein nitrogen compounds

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  Table 1.  Multiple reaction monitoring transition, mass spectrometric information of 19 kinds of nonprotein nitrogen compounds

  编号No.	化合物Compound	分子式Moecularformula	检测模式Mode	母离子Precursorion(Q1)	子离子Production(Q3)	碰撞能Collisionenergy(eV)	去簇电压Declusteringpotential(V)	保留时间Retentiontime(min)
  1	氨基三嗪 Aminotriazine	C3H4N4	ESI+	96.9	70.1* 42.1	21 28	45	2.52
  2	4-氨基三唑 4-Aminotriazole	C2H4N4	ESI+	84.9	58.0* 43.0	20 41	57	10.91
  3	双氰胺 Dicyandiamide	C2H4N4	ESI+	85.0	68.0* 43.0	20.5 22	60	11.31
  4	硫脲 Thiourea	CH4N2S	ESI+	77.0	60.1* 43.0	23 49	39	11.10
  5	3-氨基三唑 3-Aminotriazole	C2H4N4	ESI+	84.9	57.1* 43.0	23 36	61	12.99
  6	灭蝇胺 Cyromazine	C6H10N6	ESI+	167.2	85.0* 125.2	25 23	65	13.67
  7	氨基脲 Semicarbazide	CH5N3O	ESI+	76.1	59.0* 76.1	16 5	42	13.80
  8	三聚氰胺 Melamine	C3H6N6	ESI+	127.1	85.5* 68.4	27 43	71	17.20
  9	L-亮氨酸 L-Leucine	C6H13NO2	ESI+	132.1	86.2* 132.1	19 5	50	16.33
  10	L-异亮氨酸 L-Isoleucine	C6H13NO2	ESI+	132.1	86.2* 132.1	19 5	50	16.87
  11	三聚氰胺一酰胺 Ammelide	C3H4N4O2	ESI+	129.0	87.0* 43.0	23 40	70	15.48
  12	脒脲 Amidinourea	C2H6N4O	ESI+	102.9	60.0* 85.9	36 13.5	39	19.24
  13	三聚氰胺二酰胺 Ammeline	C3H5N5O	ESI+	128.0	86.0* 43.0	23 40	72	19.51
  14	L-茶氨酸 L-Theanine	C7H14N2O3	ESI+	175.1	158.1* 130.0	16 21	61	19.40
  15	胍 Guanidine	CH5N3	ESI+	60.0	43.0* 60.0	50 5	103	20.66
  16	L-羟脯氨酸 L-Hydroxyproline	C5H9NO3	ESI+	132.1	86.2 68.3*	19 30	50	21.38
  17	L-精氨酸 L-Arginine	C6H14N4O2	ESI+	175.1	158.1* 115.9	16 21	61	21.73
  18	三聚氰酸 Cyanuric acid	C3H3N3O3	ESI-	127.9	42.0* 85.0	28 14	-50	10.84
  19	尿囊素 Allantoin	C4H6O3N4	ESI-	156.9	113.7* 97.0	-18 -23	-52	14.31
  20	13C3-三聚氰胺 13C3-Melamine		ESI+	130.1	87.4	27	61	17.37
  21	13C3-三聚氰酸 13C3-Cyanuric acid		ESI-	130.9	43.0	30	-45	10.82
  *:定量离子对(The symbol“*”represents the quantitative transition)。

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  Table 2.  Linear equation, linear correlation, limit of determination (LOD) and limit of quantitation (LOQ) of 19 kinds of nonprotein nitrogen compounds

  编号No.	化合物Compound	线性方程Linear equation	相关系数Correlation coefficient(r)	检出限LOD(mg/kg)	定量限LOQ(mg/kg)
  1	氨基三嗪Aminotriazine	y=0.0307x+0.364	0.9928	0.15	0.5
  2	4-氨基三唑4-Aminotriazole	y=0.139x+0.504	0.9978	0.015	0.05
  3	双氰胺Dicyandiamide	y=9.84×10-6x+0.000157	0.9983	0.3	1.0
  4	硫脲Thiourea	y=4.24×107x+0.000170	0.9915	1.5	5.0
  5	3-氨基三唑3-Aminotriazole	y=0.218x+10.5	0.9975	0.015	0.05
  6	灭蝇胺Cyromazine	y=0.0124x+0.687	0.9959	0.015	0.05
  7	氨基脲Semicarbazide	y=0.000614x+7.17	0.9905	0.3	1.0
  8	三聚氰胺Melamine	y=0.0586x+0.334	0.9942	0.015	0.05
  9	L-亮氨酸L-leucine	y=0.00027x+4.29	0.9913	0.3	1.0
  10	L-异亮氨酸L-Isoleucine	y=0.00245x+0.355	0.9921	0.3	1.0
  11	三聚氰胺一酰胺Ammelide	y=0.00068x+0.0133	0.9918	0.3	1.0
  12	脒脲Amidinourea	y=0.709x+7.67	0.9953	0.015	0.05
  13	三聚氰胺二酰胺Ammeline	y=0.0326x+0.732	0.9965	0.075	0.25
  14	L-茶氨酸L-Theanine	y=0.0027x+8.64×10-9	0.9954	0.3	1.0
  15	胍Guanidine	y=0.181x+5.96	0.9938	0.015	0.05
  16	L-羟脯氨酸L-Hydroxyproline	y=0.329x+8.6	0.9992	0.015	0.05
  17	L-精氨酸L-arginine	y=3.24×10-6x+4.23	0.9902	1.5	5.0
  18	三聚氰酸Cyanuric acid	y=0.0142x+0.0814	0.9913	0.075	0.25
  19	尿囊素Allantoin	y=7.98x+1.47×105	0.9916	1.5	5.0
  20	13C3-三聚氰胺13C3-Melamine
  21	13C3-三聚氰酸13C3-Cyanuric acid

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  Table 3.  Recovery range and precision (RSD) of 19 kinds of nonprotein nitrogen compounds in powdered formulas (n=6)

  化合物Compound	本底值Back-ground(mg/kg)	添加水平Spiked(mg/kg)	回收率Recovery(%)	RSD(%)
  三聚氰胺Melamine	0.0393	0.05	82.4~109	12.2
  		0.25	90.8~108	7.2
  		2.5	94.8~109	5.6
  灭蝇胺Cyrom-azine	nd	0.05	82.2~110	11.2
  		0.25	98.8~109	4.5
  		2.5	95.2~104	3.4
  脒脲Amidin-ourea	nd	0.05	82.4~108	10.2
  		0.25	90.0~107	6.0
  		2.5	94.0~108	5.7
  氨基三嗪Aminotr-iazine	nd	0.5	90.0~104	6.4
  		1	96.1~103	2.9
  		2.5	92.0~103	4.8
  3-氨三唑3-Aminotr-iazole	nd	0.05	84.2~106	9.6
  		0.25	91.6~107	6.1
  		2.5	94.0~100	2.3
  4-氨基三唑4-aminotr-iazole	nd	0.05	86.4~109	9.5
  		0.25	90.0~102	4.8
  		2.5	93.6~107	4.6
  双氰胺Dicyandi-amide	nd	0.05	84.2~109	10.3
  		0.25	92.0~108	5.8
  		2.5	94.0~108	4.6
  L-羟脯氨酸L-Isoleu-cine	0.943	1	90.3~105	5.7
  		1.5	91.3~106	5.9
  		2.5	94.0~104	3.7
  L-精氨酸L-Arginine	nd	1	89.8~107	7.0
  		1.5	90.4~110	6.6
  		2.5	98.0~104	2.2
  L-羟脯氨酸L-Hydroxy-proline	1.16	5	85.8~109	8.94
  		7.5	94.0~109	5.7
  		10	94.4~104	3.8
  L-茶氨酸L-Theanine	nd	1	90.3~109	7.2
  		1.5	99.3~115	5.6
  		2.5	95.2~102	3.4
  三聚氰胺二酰胺Ammeline	nd	0.05	87.6~110	9.8
  		0.25	91.2~104	5.3
  		2.5	94.8~107	4.6
  三聚氰胺一酰胺Ammelide	6.15	0.25	88.0~109	10.1
  		1	95.2~108	4.5
  		2.5	92.8~104	4.0
  尿囊素Allantoin	nd	5	85.6~102	6.2
  		7.5	97.6~108	3.4
  		10	94.9~99.8	2.2
  硫脲Thiourea	nd	0.05	82.2~110	11.4
  		0.25	91.2~109	7.8
  		2.5	90.0~98.0	4.0
  氨基脲Semicar-bazide	nd	5	90.8~109	7.0
  		7.5	97.7~107	3.0
  		10	94.0~103	3.0
  L-亮氨酸L-leucine	0.915	1	90.1~109	7.9
  		1.5	96.0~107	4.2
  		2.5	97.6~106	3.4
  三聚氰酸Cyanuric acid	nd	0.25	84.4~109	10.1
  		1	91.6~110	6.6
  		2.5	94.8~107	5.6
  胍Guanidine	nd	1	90.5~101	5.1
  		1.5	104~115	4.2
  		2.5	94.0~104	3.4
  nd:未检出(not dectected)。

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