English

• 1.   引言

  前列腺癌(Prostate cancer，PCa)是男性最常见的肿瘤之一，近年来其发病率呈明显的上升趋势^[1~3]。早期诊断和治疗对控制PCa尤为重要。前列腺特异抗原(Prostate specific antigen，PSA)是目前临床广泛采用的PCa检测标志物^[4~10]。PSA在精液里以游离态(Free-PSA，F-PSA)存在，血液中通常为结合态(Complexed-PSA，C-PSA)，正常男性血液中可检测到的PSA(T-PSA)一般低于4 ng/mL。当T-PSA>10 ng/mL时，患者患前列腺癌的几率极高，但T-PSA含量为4~10 ng/mL时，PSA检测的特异性仅为59.2%，假阴性率即漏诊率可达38%~48%^[11]。因为PSA不具有肿瘤特异性，除PCa外，良性前列腺增生、炎性病变和梗死等前列腺病变，甚至年龄的增长，都能引起T-PSA含量的升高，因此，T-PSA含量4~10 ng/mL成为了临床诊断灰区。

  研究者提出了不同的PSA指数，用于校正T-PSA检测值，提高PSA检测的准确率。目前，临床上应用最多的是采用测定F-PSA水平并计算F-PSA/T-PSA(F/T)比值的方法进行进一步筛查^[12~14]。但是，F-PSA在血清中不稳定，且F/T比值在诊断前列腺癌时缺乏统一标准，亦难以根据这一范围内的PSA筛查和诊断PCa^[15]。

  血清中C-PSA主要以前列腺特异抗原-α1-抗胰凝乳蛋白酶(PSA-α1-antichymotrypsin complex，PSA-ACT)的形式存在。研究表明，以血清中PSA-ACT含量作为检测指标，可提高对PCa早期诊断的特异性和准确性^[16~19]。与同时检测T-PSA和F-PSA相比，PSA-ACT检测具有稳定、简单、成本低、不受年龄因素影响等优势，其敏感性和特异性均优于T-PSA检测，且可以降低PCa的筛查成本^{[15, 20~22]}。

  PSA-ACT的检测方法与F-PSA及T-PSA类似，酶联免疫分析法(ELISA)是最常用的方法^{[23, 24]}，但目前还没有检测PSA-ACT的商业化试剂盒。

  与ELISA法相比，化学发光酶免疫分析法(CLEIA)具有灵敏度高、线性范围宽、操作简单且易于实现高通量检测等特点^{[25, 26]}。本研究制备了抗PSA-ACT单克隆抗体(单抗)，采用辣根过氧化物酶(HRP)催化鲁米诺(lumino)-H₂O₂化学发光体系，建立了双抗体夹心化学发光酶免疫分析方法，用于PSA-ACT的高灵敏度检测，为开发可用于临床检验的PSA-ACT试剂盒奠定了实验基础。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  BHP 9540微孔板发光分析仪(北京滨松光子技术有限公司)；MX-F型固定式混匀仪(上海大龙医疗器械有限公司)；WZ-2A型微量振荡器(北京海淀电子医疗仪器厂) Sp2/0骨髓瘤细胞(国家生物医学分析中心病毒安全检测实验室提供)；6~8周龄的雌性Balb/c小鼠(军事科学院实验动物中心)；RPMI 1640培养基、牛血清蛋白(BSA)(美国Gibco公司)；PSA-ACT Antigen(加拿大Biospacific公司)；PSA Antigen F-PSA Ag protein(英国Biorbyt公司)；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和HAT/HT培养基(美国Sigma公司)；单克隆抗体分型试剂盒(Southern Biotech公司)；rProtein A蛋白纯化试剂盒(美国GE公司)；BCA蛋白浓度试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所)；辣根过氧化物酶(HRP，美国MP Biomedicals公司)；鲁米诺化学发光底物液(苏州贝尔达生物医药科技有限公司)；其它试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

  2.2.   动物免疫和细胞融合

  采用免疫原PSA-ACT对6~8周龄的雌性Balb/c鼠进行背部皮下免疫，初次免疫剂量为20μg/只；15日后进行初次加强免疫(10μg/只)，此后每隔28天进行一次加强免疫。第4次加强免疫10天后断尾取血，以1μg/mL PSA为包被原，采用间接ELISA法^[20]检测血清中抗PSA抗体的效价。取抗血清效价大于1：8000的小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，采用HAT培养基对杂交瘤细胞进行培养，去除未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞。

  2.3.   杂交瘤细胞株的筛选及培养

  2.4.   单克隆抗体的制备

  对可分泌单一抗PSA-ACT抗体的细胞株进行扩大培养，用体内诱生法制备腹水。选取10周龄的雌性小鼠，接种杂交瘤细胞前7天注射石蜡油，抑制自身免疫功能。将阳性杂交瘤细胞稀释后注入小鼠腹腔，7天后收集小鼠腹水，以间接ELISA法测定腹水效价。利用rProtein A亲和柱法纯化腹水，得到的纯化抗体用PBS透析3次，-20℃保存。

  2.5.   单克隆抗体的鉴定

  采用SDS-PAGE测定抗体的纯度，采用BCA法测定抗体的浓度。以甲胎蛋白(Alpha Fetoprotein，AFP)、癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)、广谱肿瘤标志物(Carbohydrate antigen 50，CA50)、卵巢癌相关抗原(Carbohydrate antigen 125，CA125)、乳腺癌相关抗原(Carbohydrate antigen 153，CA153)、F-PSA等为包被原，采用间接ELISA进行交叉反应检测。采用间接ELISA相加实验，分析抗体针对的抗原表面决定簇。以1μg/mL PSA包被酶标板，先分别加入所有单抗，测定450和630 nm处的吸光度比值(OD₄₅₀/OD₆₃₀)^[27]，再将所有单抗两两配对加入，测定OD₄₅₀/OD₆₃₀，比较前后吸光度值的变化，进而对单抗按作用位点进行分类。

  2.6.   单克隆抗体配对

  在单克隆抗体分类的基础上，选择针对抗原上不同决定簇的两个单抗进一步配对分析，分别用一个抗体作为包被抗体，另一个作为酶标抗体，PSA-ACT抗原稀释梯度0，5，10，20，40和60 ng/mL，采用间接ELISA检测，每组抗体对均要进行正配与反配，挑选具有高灵敏度和良好线性的一对抗体，建立化学发光酶免疫分析法。

  2.7.   PSA-ACT化学发光酶免疫分析方法的建立

  用包被缓冲液将纯化后的PSA-ACT单抗稀释至适当的浓度，加入96孔板中，100μL/孔，4℃包被过夜。PBS洗涤3次，每孔加入300μL含1% BSA的磷酸盐-吐温缓冲溶液(PBST)，室温封闭3 h，弃封闭液，干燥，4℃密封保存^[21]。采用改良的过碘酸盐氧化法^[28]制备HRP标记的抗体(HRP-IgG)，加入等体积甘油，密封冷冻保存。以质控血清作为标准品基质，按比例将适量的PSA-ACT加入到基质血清中，得到浓度分别为0 (S₀)，5 (S₁)，10 (S₂)，20 (S₃)，40 (S₄)和60 ng/mL(S₅)的系列标准品，4℃保存。

  在包被抗体板每孔中加入50μL样品或标准品、50μL酶标抗体，振荡混匀，37℃温育1 h，洗涤5次，按化学发光底物试剂盒说明书加入适量发光底物，避光反应一定时间后，测定各孔的相对发光强度(Relative light unit，RLU)，绘制PSA-ACT浓度和对应RLU值间的双对数标准曲线。

  2.3.1.   抗体亚类鉴定

  按Southern Biotech单克隆抗体分型试剂盒说明书，以浓度为1μg/mL PSA抗原包被酶标板，依次加入细胞培养上清(100μL/孔)和1：500稀释的HRP标记二抗进行反应。根据OD450值最高的孔所对应的酶标二抗确定该孔抗体的亚类。

  2.3.2.   抗体特异性筛选

  分别以T-PSA，F-PSA，PSA-ACT为抗原进行包被，采用间接ELISA法对杂交瘤细胞进行筛选，随后对阳性细胞株进行克隆。多次筛选、克隆后，获得可分泌单一抗PSA-ACT抗体的细胞株。

  3.   结果与讨论

  3.1.   单克隆抗体制备

  3.2.   PSA-ACT化学发光酶免疫分析方法建立

  3.3.   实际血清中的回收率

  在3份临床采集的人血清样品中，分别加入5，10和20 ng/mL PSA-ACT标准品，在最佳实验条件下测定，计算回收率。结果见表 3。与已报道的采用免疫技术原理检测PSA-ACT的方法^[19]相比，本方法灵敏度稍低，稳定性和重现性好，用于实际样品检测，结果令人满意。本研究结果为进一步开发检测PSA-ACT的CLIA试剂盒奠定了基础。

  表 3

  

  表 3  血清样品中PSA-ACT回收率测定(n=3)

  Table 3.  Recovery of PSA-ACT spiked in human serum samples (n=3)

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  血清样品Serum sample	本底值Found (ng/mL)	加标量Added (ng/mL)	测定值Total found (ng/mL)	回收率Recoveries (%)
  样品1 Sample1	1.53	5.0	6.74±0.07	104.2
  		10	11.48±0.26	100.4
  		20	21.09±0.31	97.8
  样品2 Sample 2	3.67	5.0	8.71±0.12	100.8
  		10	13.21±0.45	95.4
  		20	23.56±0.25	99.5
  样品3 Sample 3	17.46	5.0	22.25±0.18	95.8
  		10	27.36±0.29	99.0
  		20	37.77±0.35	101.5

  3.1.2.   单克隆抗体亚类鉴定及效价测定

  8株杂交瘤细胞的培养上清间接ELISA检测结果显示，2株属于IgG1类，2株属于IgG2a类，4株属于IgG2b类，无IgG3及IgM类。轻链均为κ类。杂交瘤细胞扩大培养，制备腹水后，以ELISA法检测腹水效价。抗体亚类及腹水效价见表 1。

  表 1

  

  表 1  单克隆抗体亚类及腹水效价

  Table 1.  Subtypes, light chain types and ascites titer of 8 monoclonal antibodies (mAb)

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  抗体编号Number	亚类/型Subtype	效价Ascites titer
  PSA2	Ig G2b/κ	1：256000
  PSA9	Ig G1/κ	1：256000
  PSA13	Ig G1/κ	1：512000
  PSA17	Ig G2b/κ	1：512000
  PSA21	Ig G2b/κ	1：512000
  PSA28	Ig G2b/κ	1：256000
  PSA36	Ig G2a/κ	1：512000
  PSA44	Ig G2a/κ	1：512000
  PSA：前列腺特异抗原(Prostate specific antigen)。

  3.1.1.   杂交瘤细胞株筛选

  共进行6次细胞融合，细胞融合率在78%~92%之间。初次筛选得到17株阳性细胞株，经过多次克隆，共得到8株能稳定分泌PSA-ACT单抗的细胞株，分别为PSA2，PSA9，PSA13，PSA17，PSA21，PSA28，PSA36和PSA44。

  3.1.5.   单克隆抗体配对

  8组备选抗体对配对实验结果显示，PSA17/PSA28线性良好(R=0.991)，灵敏度高，所以选择这对抗体建立化学发光酶免疫分析法。

  3.1.3.   单克隆抗体浓度及纯度

  腹水经rProtein A纯化后，用BCA法测得8个单克隆抗体蛋白浓度为1.25~5.00 mg/mL，SDS-PAGE电泳检测结果(图 1)表明，抗体PSA17和PSA28的纯度较高。

  图 1

  

  图 1  前列腺特异抗原-α1-抗胰凝乳蛋白酶(PSA-ACT)单克隆抗体PSA17和PSA28的SDS-PAGE电泳图

  Figure 1.  SDS-PAGE map of human prostate specific antigen-α1-antichymotrypsin complex (PSA-ACT) specific monoclonal antibodies PSA17 and PSA28

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  3.1.4.   单克隆抗体特异性

  (1) 交叉反应8株单抗的交叉反应实验结果如表 2所示。8株单抗与所测试的肿瘤标记物的反应很微弱，可以认为没有交叉反应。(2) 抗原结合位点分析用相加系数(Additivity value，AV)评价位点分析结果。AV=[(OD_McAb1+2)/(OD_McAb1+OD_McAb2)]×100%。当AV＜50%时，认为两种抗体针对抗原的同一位点，或两种抗体结合不同位点但相互抑制；当AV>50%时，认为两种抗体针对抗原的不同位点。

  表 2

  

  表 2  8株抗体交叉反应结果

  Table 2.  Cross-reactivity t of 8 mAb

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  抗原Number	PSA2	PSA9	PSA13	PSA17	PSA21	PSA28	PSA36	PSA44	阳性Positivecontrol	阴性Negativecontrol
  甲胎蛋白Alpha fetoprotein, AEP	-	-	-	-	-	--	-	-	+	--
  癌胚抗原Carcinoembryonic antigen, CEA	--	-	-	--	-	-	-	--	+	--
  广谱肿瘤标志物Carbohydrate antigen 50, CA50	-	-	-	-	-	-	-	--	+	--
  卵巢癌相关抗原Carbohydrate antigen 125, CA125	-	--	-	-	-	--	-	-	+	--
  乳腺癌相关抗原Carbohydrate antigen 153, CA153	-	--	-	-	-	-	-	-	+	--
  游离前列腺特异抗原Free-prostate specific antigen, F-PSA	-	-	--	-	-	-	-	-	+	--
  前列腺特异抗原Prostate specific antigen, PSA	+	+	+	+	+	+	+	+	+	--
  前列腺特异抗原PSA背景Background	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--
  注：PSA(背景)是背景值，加相同体积的封闭液代替抗体溶液，其它条件完全相同。 Note: PSA(background), Adding the same volume of blocking solution instead of antibody, other conditions are identical (+) represents OD450/630 > 1.0；(-)represents 0.02 < OD450/630 < 1；(--) represents OD450/630 < 0.02.

  实验结果表明，PSA2与PSA13、PSA17识别不同的抗原位点，PSA9与PSA13、PSA17识别不同的抗原位点，PSA13与PSA21、PSA28识别不同的抗原位点，PSA17与PSA28、PSA44识别不同的抗原位点。因此，共得到8对识别不同的PSA-ACT位点的单抗细胞株PSA2-PSA13，PSA2-PSA17，PSA9-PSA13，PSA-9-PSA17，PSA13-PSA21，PSA13-28，PSA17-PSA28和PSA17-PSA44。

  3.2.1.   实验条件的优化

  本实验选择的最佳实验条件为：0.06 mol/L柠檬酸缓冲液(pH 7.4)作为包被缓冲液；抗体包被浓度5μg/mL，37℃包被120 min；酶标抗体稀释度1：500，37℃恒温不振荡温育1 h；加入发光底物10 min后测量。

  3.2.3.   方法的分析性能

  在最佳反应条件下，以化学发光酶免疫分析法测定PSA-ACT浓度，标准曲线如图 2所示。相对发光强度的对数和PSA-ACT浓度的对数在PSA-ACT浓度5~40 ng/mL范围内线性关系良好(R²=0.9943)，线性方程为y=2.2504x+2.5142，以(x+2SD)对应的浓度值为方法的检出限^[29]，测得检出限为0.53 ng/mL。

  图 2

  

  图 2  化学发光酶免疫分析法测定PSA-ACT的标准曲线

  Figure 2.  Standard curve of chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA) for determination of PSA-ACT

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  以含低(5.0 ng/mL)、中(9.0 ng/mL)、高(40 ng/mL) 3种浓度PSA-ACT的血清进行8孔平行测定，重复3次，测得批内相对标准偏差(RSD)为4.6%~6.6%，批间RSD为5.7%~8.0%。

  采用建立的CLEIA法对5，10，20，40和60 ng/mL的F-PSA进行检测，计算得到F-PSA与PSA-ACT的交叉反应率为0.6%，表明本方法的特异性良好。

  3.2.2.   免疫反应步骤

  在化学发光酶免疫分析测定体系中，可选择一步法和两步法免疫反应步骤，所建立方法的灵敏度和操作时间会有差别。一步法的基本操作程序如2.7所述；两步法是指将样品或标准品与酶标抗体分别温育，即在包被抗体板孔中加入50μL样品或标准品，37℃温育1 h，洗板后加入50μL酶标抗体，37℃温育1 h。其它步骤与一步法相同。

  本实验中两种方法分析的灵敏度基本一致，线性关系良好，但两步法耗时150 min，一步法耗时90 min，所以最终选择一步法进行测定。

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• 

  Figure 1  SDS-PAGE map of human prostate specific antigen-α1-antichymotrypsin complex (PSA-ACT) specific monoclonal antibodies PSA17 and PSA28

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  Figure 2  Standard curve of chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA) for determination of PSA-ACT

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  Table 1.  Subtypes, light chain types and ascites titer of 8 monoclonal antibodies (mAb)

  抗体编号Number	亚类/型Subtype	效价Ascites titer
  PSA2	Ig G2b/κ	1：256000
  PSA9	Ig G1/κ	1：256000
  PSA13	Ig G1/κ	1：512000
  PSA17	Ig G2b/κ	1：512000
  PSA21	Ig G2b/κ	1：512000
  PSA28	Ig G2b/κ	1：256000
  PSA36	Ig G2a/κ	1：512000
  PSA44	Ig G2a/κ	1：512000
  PSA：前列腺特异抗原(Prostate specific antigen)。

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  Table 2.  Cross-reactivity t of 8 mAb

  抗原Number	PSA2	PSA9	PSA13	PSA17	PSA21	PSA28	PSA36	PSA44	阳性Positivecontrol	阴性Negativecontrol
  甲胎蛋白Alpha fetoprotein, AEP	-	-	-	-	-	--	-	-	+	--
  癌胚抗原Carcinoembryonic antigen, CEA	--	-	-	--	-	-	-	--	+	--
  广谱肿瘤标志物Carbohydrate antigen 50, CA50	-	-	-	-	-	-	-	--	+	--
  卵巢癌相关抗原Carbohydrate antigen 125, CA125	-	--	-	-	-	--	-	-	+	--
  乳腺癌相关抗原Carbohydrate antigen 153, CA153	-	--	-	-	-	-	-	-	+	--
  游离前列腺特异抗原Free-prostate specific antigen, F-PSA	-	-	--	-	-	-	-	-	+	--
  前列腺特异抗原Prostate specific antigen, PSA	+	+	+	+	+	+	+	+	+	--
  前列腺特异抗原PSA背景Background	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--
  注：PSA(背景)是背景值，加相同体积的封闭液代替抗体溶液，其它条件完全相同。 Note: PSA(background), Adding the same volume of blocking solution instead of antibody, other conditions are identical (+) represents OD450/630 > 1.0；(-)represents 0.02 < OD450/630 < 1；(--) represents OD450/630 < 0.02.

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  Table 3.  Recovery of PSA-ACT spiked in human serum samples (n=3)

  血清样品Serum sample	本底值Found (ng/mL)	加标量Added (ng/mL)	测定值Total found (ng/mL)	回收率Recoveries (%)
  样品1 Sample1	1.53	5.0	6.74±0.07	104.2
  		10	11.48±0.26	100.4
  		20	21.09±0.31	97.8
  样品2 Sample 2	3.67	5.0	8.71±0.12	100.8
  		10	13.21±0.45	95.4
  		20	23.56±0.25	99.5
  样品3 Sample 3	17.46	5.0	22.25±0.18	95.8
  		10	27.36±0.29	99.0
  		20	37.77±0.35	101.5

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