English

• 1.   引言

  在生命科学、食品科学以及临床医学等领域，生物分子的氧化过程以及生物抗氧化剂(AOs)的作用是研究较为广泛的课题。氧分子在线粒体中的呼吸链反应过程提供生物系统的主要能源，并且对细胞的生存至关重要。在这些代谢过程中产生的活性氧(ROS)和其它自由基可能导致人体内的氧化损害^[1]。抗氧化保护系统包括内源保护酶(例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶)、内源性AOs分子(例如谷胱甘肽)或外源性AOs物质(例如维生素C、E)。当人体内产生的自由基或ROS的量超过AOs，这些过剩的氧化物质就会破坏生物组织以及细胞功能。因此，研究人体氧化应激状态以及生物抗氧化剂的作用具有重要意义。

  根据相关的反应机理，AOs可以被氢原子受体(例如超氧自由基)或电子受体(例如Fe³⁺)氧化。文献提出了各种自由基反应的方法研究AOs的抗氧化特性，其中使用的自由基通过加热引发产生，通过吸光度或荧光强度分析AOs的抗氧化性能^{[1, 2]}。这些方法包括总自由基捕获抗氧化参数方法(TRAP)^[3]、氧自由基吸收能力方法(ORAC)^[4]、2, 2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)自由基清除方法^[5]。这些方法使用自由基引发剂和UV或荧光分子探针以监测反应动力学过程，得到相应的抗氧化反应动力学参数，UV或荧光分子探针的浓度通常小于AOs浓度。另外，应用较多的还有维生E等效总抗氧化能力方法(TEAC)^[6]、Fe³⁺还原抗氧化能力方法(FRAP)^[7]。

  文献相继报道了OH^·淬灭^[8]、H₂O₂^[9]、H₂O₂和OH^·混合淬灭^[10]等电化学传感器检测AOs的方法，并推导了不同的反应动力学模型。最近，Ma等相继开发了光催化ROS物种(包括正电空穴和自由基)淬灭检测AOs的光电流电化学传感器方法^[11~13]。在此基础上，本研究尝试建立AOs淬灭光催化产生氧化物质检测方法的反应动力学模型。

  生物学研究中，OH^·是当H₂O₂与Fe的反应(Fenton反应)产生的^{[14, 15]}。然而，在ROS淬灭检测AOs的方法中使用的Fenton反应混合物产生ROS存在一些问题，如AOs与Fe螯合，从而改变相应金属螯合剂的活性；AOs在高浓度下会起到促氧化剂作用产生更多ROS^[16]。这些因素使AOs清除ROS能力的反应机理很复杂。相比之下，在AOs研究中使用纳米TiO₂光催化解离水是一个清洁、简单的连续产生OH^·的方法^[17]。具体反应过程如下:

  TiO₂纳米结构材料在太阳能光电转换、水分解以及环境净化等领域得到广泛应用^[18~22]。TiO₂的电子结构包括价带(VB)和导带(CB)，两者之间的带隙(E_g)为3.2 eV^[19]。当吸收一个光子的能量与E_g相匹配时，电子激发从VB进入CB，VB中形成空穴。在溶液中电子供体和受体同时存在时，抑制电子和空穴之间的重组反应。如图 1所示，TiO₂在纯水中光解，水分子溶剂化的纳米颗粒和溶解的氧气可以与空穴和电子分别反应生成OH^·。TiO₂的这种光催化反应已经运用到基于双链DNA修饰的TiO₂电极的电化学抗氧化剂传感器上^[8]。DNA吸附于沉积在ITO电极的TiO₂涂层上，在紫外光照射下，所产生的OH^·氧化破坏吸附的DNA。

  图 1

  

  图 1  羟基自由基清除能力反应示意图

  Figure 1.  Schematic diagram of OH radicals scavenging capacity assay

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  本研究提出了一个以对苯二甲酸(TA)为氧化探针，基于TA与AOs竞争TiO₂光催化产生氧化物质反应的动力学模型，其中反应过程中形成的具有荧光活性的2-羟基对苯二甲酸(HTA)作为荧光探针，标定AOs的抗氧化动力学性质。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  HTA的荧光光谱(由TA的与羟基自由基反应产生)测定采用Perkin-Elmer LS-50B荧光光谱仪(美国PerkinElmer公司)。一定浓度的AOs溶液与25μg/mL TiO₂、0.1 mmol/L TA混合，在UV灯(波长360 nm)照射一定时间后，测量荧光, 激发波长(λ_ex)为315 nm，发射波长(λ_em)为425 nm。

  PBS缓冲溶液(pH 7.4)由50 mmol/L磷酸盐(Na₂HPO₄/NaH₂PO₄)和10 mmol/L NaCl组成。使用的AOs包括谷胱甘肽(GSH，Sigma)、没食子酸(GA，Acros)、维生素C(Vc, Riedel-deHan)、尿酸(UA, Fluka)、trolox(Fluka)、胆红素(Fluka)、硫辛酸(Degussa)均溶解于PBS缓冲液，维生素E(Ve，DL-α-tocopherolacetate, Sigma)溶解在0.1%Triton X-100中，AOs储备液浓度均为10 mmol/L。TiO₂纳米颗粒(Degussa，P25)直径为21nm，比表面积50 m²/g，充分研磨后分散在水中(0.5 mg/mL)。TA(Fluka)溶解在2 mmol/L NaOH溶液中，浓度为1 mmol/L。

  2.2.   荧光寿命测试

  荧光寿命衰减测量采用时间相关单光子计数(TCSPC)技术。飞秒激光脉冲从锁模钛宝石激光器(Spectra Physics, Tsunami，美国); Nd∶YVO4泵浦固体激光器(Spectra Physics, MillenniaXs，美国)，被定向到一个脉冲拾取器和倍频器(Spectra Physics, model 3980，美国)。重复频率设定为400 kHz。激发光束是使用偏振器产生的s-偏振光。该荧光通过透镜聚焦放置在90°角从激发光束到单色器(JobinYvon, H-10，法国)的入口狭缝，检测由一个冷却微通道板式光电倍增管(MCP-PM, Hamamatsu, R3809U-50，日本)进行。MCP-PM壳体的温度设定为-20℃，降低暗电流。在MCP-PM的输出后用放大器(Becker & Hickl GmbH，英国)进一步放大，并通过一个单光子计数模块(Edinburgh Instruments, TCC900，英国)分析。恒定比例辨识器(CFD)的参数通过T900软件获得优化的标准分子的荧光寿命。Ludox激发光通过样品池并记录散射光，得到仪器响应最大半宽值约为90 ps。整个过程荧光检测波长为425 nm。荧光光子的数量相对向起动脉冲的光子数量保持在较低的水平(1%或更少)。

  3.   结果与讨论

  3.1.   荧光测量

  TA与OH^·发生加成反应生成HTA，荧光光谱是记录的HTA的信号^[23]。在AOs存在时，可与TA竞争与自由基的反应，因此AOs淬灭光催化产生OH^·并抑制形成HTA。所以根据HTA的荧光可以分析测定AOs的抗氧化能力。检测方法的示意图如图 1所示。

  UV光照射后，在425nm处记录TA与TiO₂溶液生成的HTA的荧光强度随光照时间延长而增加(图略)，显示在一定的TA的浓度下，该波长处的发光强度与光照时间成正比(图 2)。TA会吸附在TiO₂颗粒表面，结合常数是10^5[24]。然而，无论是表面结合的TA或者HTA，都不具有荧光特征，因为发色基团结合到TiO₂表面使荧光特征消失。为了验证这一点，通过离心从溶液中分离纳米颗粒，并测量溶液的荧光光谱和再分散于水中的TiO₂颗粒的光谱。可观察到表面结合HTA没有产生明显的荧光。图 3显示HTA在325 nm激发后，425 nm波长发射的荧光衰减特性。HTA的衰减，可以用双指数模型表示：

  1

  图 2

  

  图 2  不同浓度的TA与TiO₂(25μg/mL)混合的荧光强度。插图，k¹ vs [TA]_tot

  Figure 2.  Fluorescence intensity of TA at different concentrations, mixed with TiO₂(25μg/mL). Inset, k¹ vs [TA]_tot

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  图 3

  

  图 3  HTA荧光信号衰减拟合。激发和检测波长分别为325 nm和425 nm。在PBS缓冲溶液中[HTA]≤100μm

  Figure 3.  HTA fluorescence decay including the instrument response, fitted function (A) and residuals for double exponential fit (B). The excitation and observation wavelength were 325 nm and 425 nm respectively. [HTA]≤100μmol/L in PBS buffer solution

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  其中，τ₁, τ₂分别是长的和短的寿命参数，由表 1中给出。

  表 1

  

  表 1  HTA在溶液中的荧光衰减拟合参数

  Table 1.  Fluorescence decay fit parameters of HTA in PBS solution

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  τ1	1.048±0.025ns	A1	0.107
  τ2	12.183±0.257ns	A2	0.668
  y0	0.0013	x2	1.038

  由此可以判断体系中记录的荧光信号来源于游离的HTA分子的荧光发射，这与文献[25]报道的现象一致。文献[25]通过比较由4-羧基-2, 2, 6, 6-四甲基哌啶-1-氧基(CTMPO)自旋探针法和HTA荧光法得到的羟基自由基量子效率，认为溶液中游离的HTA与OH^·反应。

  3.2.   反应动力学分析

  对苯二甲酸和抗氧化剂的存在下TiO₂在水中的光催化反应过程如下：

  在AOs存在下，HTA的产率降低，这是因为溶液中的AOs可淬灭OH^·。根据上述反应过程，可以建立一个动力学模型，用于量化反应中的AOs淬灭OH^·的能力，其中k是通过水氧化产生OH^·反应的准一级速率常数，k₀是通过光生空穴直接氧化AOs的速率常数，k₁, k₂分别是TA氧化和AOs被OH^·氧化反应的速率常数。最后反应是水溶液中的OH^·的寿命，是一个准一级(τ^-1)反应过程。光电转化效率(IPCE)是溶液吸光度A、空穴-电子产生效率、入射光强度的函数，即：

  2

  空穴的量子产率一般为10^-2量级，这是一个光催化反应的典型值^[26]。在水中OH^·的量子产率Φ_ΟΗ^·＝kAΦI。通过检测TA的氧化，发现其值等于7×10^-5[26]。当溶液中只有TA时，通过对空穴和OH^·的稳态近似处理，可以得到：

  3

  其中，[TA]表示TA的浓度。当紫外照射时间很短时，[TA]可以被认为是常数，HTA的产率与UV照射时间成正比。

  4

  其中，k¹表示准一级反应速率常数。当TA过量情况下HTA的荧光强度随着紫外光照时间线性变化。在较短反应时间内，k¹变化也与[TA]呈线性关系，因此方程(4)可以近似表示为:

  5

  这表明大部分OH^·是由溶剂清除。本工作中[TA]固定至100μmol/L，得到准一级常数k¹在此浓度条件下为19.6 min^-1。

  在AOs的存在时，羟基自由基稳态近似处理为：

  6

  并且，对于光生空穴：

  7

  在短时间内，[AOs]也可以被视为一个常数，并且HTA的生成速率为：

  8

  HTA的荧光强度与UV照射时间呈线性关系，并且明显可以看出准一级速率常数随[AO]增加而降低。这些数据验证了上述提出的动力学模型。假设TiO₂上的AOs直接氧化的速率相比在溶液中水的氧化速率小，并假设方程式(4)中k₁[TA] < < τ^-1，则方程式(8)简化为：

  9

  k_AO¹的倒数与[AO]成正比，如图 4所示。从图 4所获得的线性方程参数，可以用于描述不同分子的抗氧化能力，斜率越大显示抗氧化能力越高。所以，参数k₂τ可以量化AOs的抗氧化能力。

  图 4

  

  图 4  由方程(10)，1/k_AO¹对[AO]作图。◆, 硫辛酸(lipoic acid); ○, 没食子酸(gallic acid); △, 谷胱甘肽(glutathione); ▽, 尿酸(uric acid); ●, 维生素C(vitamin C); ◇, 维生素E(vitamin E); ▲, 生育酚(trolox); ▼胆红素(bilirubin). [TA]=0.1 mmol/L

  Figure 4.  Plotting of eq10. (1/k_AO¹ vs [AO]).◆, lipoic acid; ○, gallic acid; △, glutathione; ▽, uric acid; ●, vitamin C; ◇, vitamin E; ▲, trolox; ▼bilirubin. [TA]=0.1 mmol/L.

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  10

  这些数据表明，在水中与浓度为100μmol/L TA的竞争与OH^·的淬灭反应，分别需要114μmol/L硫辛酸，770μmol/L没食子酸，1.2 mmol/L谷胱甘肽，1.3 mmol/L尿酸，1.4 mmol/L维生素C，6.5 mmol/L维生素E，30 mmol/L水溶性维生素E和100 mmol/L胆红素。应当强调的是，上面提出的模型适用于水溶性AOs分子的抗氧化能力分析。不适用于大分子如牛血清白蛋白，因为牛血清白蛋白涂覆在TiO₂纳米颗粒上。

  4.   结论

  研究结果表明，光催化活性材料(如TiO₂纳米颗粒)结合适当的光氧化探针分子，如TA的光催化氧化反应，非常适合于测定在水溶液中小分子的抗氧化性能。相比脉冲辐射技术或者Fenton反应，本研究提供了一种产生OH^·的简单方法。本方法也适合结合微量滴定板和荧光阵列检测器对AOs进行高通量分析。

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• 

  Figure 1  Schematic diagram of OH radicals scavenging capacity assay

  TA，对苯二甲酸; HTA，2-羟基对苯二甲酸; AO，抗氧化剂。

  TA: Terephthalicacid; HTA: 2-Hydroxyterephtahlicacid; AO: Antioxidant.

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  Figure 2  Fluorescence intensity of TA at different concentrations, mixed with TiO₂(25μg/mL). Inset, k¹ vs [TA]_tot

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  Figure 3  HTA fluorescence decay including the instrument response, fitted function (A) and residuals for double exponential fit (B). The excitation and observation wavelength were 325 nm and 425 nm respectively. [HTA]≤100μmol/L in PBS buffer solution

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  Figure 4  Plotting of eq10. (1/k_AO¹ vs [AO]).◆, lipoic acid; ○, gallic acid; △, glutathione; ▽, uric acid; ●, vitamin C; ◇, vitamin E; ▲, trolox; ▼bilirubin. [TA]=0.1 mmol/L.

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  Table 1.  Fluorescence decay fit parameters of HTA in PBS solution

  τ1	1.048±0.025ns	A1	0.107
  τ2	12.183±0.257ns	A2	0.668
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