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• 血栓性疾病是由血栓形成和血栓栓塞两种病理过程引起的，其可引起多种临床综合症，如脑卒中、心肌梗塞和冠状动脉粥样硬化等外周动脉疾病。不仅如此，血栓性疾病还有逐年增长之势，因此防止血栓形成也就成了心血管疾病领域最为热门的研究课题之一^{[1, 2]}。

  血小板是血液中的有效成分，在止血、伤口愈合、血栓形成及器官移植等生理和病理过程中发挥着重要作用^[3]。血小板的粘附、聚集、释放反应是导致血栓形成的主要因素，所以抗血小板药物是预防和治疗血栓性疾病的重要手段之一^[4]。目前临床应用较广的抗血小板药物为噻吩并吡啶类二磷酸腺苷(ADP)受体拮抗剂，如噻氯吡啶、氯吡格雷和普拉格雷，此类药物与血小板膜表面ADP受体结合后，阻止ADP与血小板P2Y12受体的结合，抑制了ADP介导的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体的活化，从而使继发的纤维蛋白原与糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体的结合受阻，发挥抗血小板聚集的作用。但是，氯吡格雷存在血栓性血小板减少性紫癜、骨髓再生不良及“氯吡格雷抵抗”等问题^[5]；普拉格雷虽然个体差异小，体内抗血小板活性比氯吡格雷强10倍，但也存在严重的出血倾向^[6]。因此，研究人员又设计合成了大量新型的ADP受体拮抗类化合物^[7~11]，以期找到疗效更好、安全性更高的新型噻吩并吡啶类ADP受体拮抗剂。

  川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)化学名为四甲基吡嗪，是从伞形科中药川芎(Rhizoma Chuanxiong)的根部块茎中分离得到的有效生物碱单体。近年来，有诸多研究证实川芎嗪具有抗血栓、抗血小板聚集、抗缺血再灌注损伤、改善微循环和抗氧化等多方面的药理作用^{[12, 13]}。但由于其代谢快、半衰期短和药效不强等原因，临床使用为保持有效浓度需频繁给药，易致蓄积中毒^[14]。因此，为了寻找新型的抗血小板聚集药物，本文根据生物电子等排原理将噻吩并吡啶类抗血小板聚集药物结构中的噻吩环替换成川芎嗪环(如图式 1)，以2, 3-二氨基吡啶和2, 3-丁二酮为起始原料，设计、合成了一系列哌啶并[2, 3-b]哌嗪类衍生物(3a~3j，图式 2)，并对其体外抗血小板聚集活性进行了研究。

  图式 1

  

  图式 1.  三种噻吩并吡啶类药物及本文目标化合物的结构

  Scheme 1.  Structures of three thienopyridine drugs and the target compounds in this article

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  图式 2

  

  图式 2.  目标化合物的合成路线

  Scheme 2.  Synthetic route of target compounds

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  1.   实验部分

  1.1   仪器与试剂

  Tektronix XY-4型显微熔点测定仪(温度计未校正，北京泰克仪器有限公司)；Varian Mercury-400型核磁共振谱仪(美国Varian公司)；UPLC-QTOF型高分辨质谱仪(美国沃特世公司)；ZF-2型三用紫外分析仪(上海安亭电子仪器厂)；半自动血小板分析仪(北京中勤世帝生物科技技术有限责任公司)。

  川芎嗪(98%，上海萨恩化学技术有限公司)；ADP(南京建成生物试剂公司)。其他试剂与溶剂均为分析纯级；柱层析硅胶为200~300目(青岛海洋化工厂)。

  1.2   合成方法及步骤

  2, 3-二甲基吡啶并[2, 3-b]吡嗪(1)的合成：于100mL圆底烧瓶中加入4.0g(36.68mmol)2, 3-二氨基吡啶、20mL乙醇和4mL乙酸，搅拌下滴加3.8g(44.17mmol)2, 3-丁二酮，升温至70℃反应16h。TLC检测反应完全后，蒸除溶剂，加入50mL水，二氯甲烷萃取(3×50mL)，合并有机相，饱和NaCl洗涤，无水Na₂SO₄干燥，减压除去溶剂，硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯体积比1∶1)得白色固体5.24g，产率89.8%。¹H NMR (400MHz，CDCl₃)δ：9.05~9.07(m，1H)，8.32~8.35(m，1H)，7.62~7.63(m，1H)，2.82(d，J=1.2Hz，3H)，2.78 (d，J=1.2Hz，3H)；HRMS (ESI)，m/z：C₉H₁₀N₃ [M+H]⁺，理论值160.0870，实测值160.0869。

  2, 3-二甲基-哌啶并[2, 3-b]吡嗪(2)的合成：取1.00g(6.29mmol)化合物1置于50mL反应瓶中，加入20mL乙醇，再加入665mg(0.63mmol)10% Pd/C，氢气氛下室温反应过夜，反应完毕后抽滤，减压除去溶剂，硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯体积比1∶1)纯化得349mg棕黄色固体，收率34.0%。¹H NMR (400MHz，CDCl₃)δ：4.71(s，1H)，3.37~3.41(m，2H)，2.85~2.89(m，2H)，2.35(s，3H)，2.30(s，3H)，1.99~2.01(m，2H)；HRMS (ESI)，m/z：C₉H₁₄N₃ [M+H]⁺，理论值164.1188，实测值164.1190。

  2, 3-二甲基-哌啶并[2, 3-b]吡嗪衍生物(3a~3j)的合成：将200mg(1.23mmol)化合物2溶于5mL干燥乙腈中，加入取代苄溴(1.47mmol)和K₂CO₃(203mg，1.47mmol)，回流12h，反应液冷却至室温，抽滤，减压除去溶剂，硅胶柱层析纯化得目标化合物3a~3j。

  5-(2-氯苄基)-2, 3-二甲基-哌啶并[2, 3-b]吡嗪(3a)：无色油状物，收率71.0%。¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆) δ：7.50~7.41(m，1H)，7.31~7.23(m，2H)，7.22~7.15(m, 1H)，4.80(s，2H)，3.35(m，2H)，2.83(t，J=6.3Hz，2H)，2.24(s，3H)，2.18(s，3H)，2.03~1.89(m，2H)；¹³C NMR (126MHz，DMSO-d₆) δ：149.2，145.4，136.18，135.6，135.4，132.3，129.3，128.3，128.1，127.2，48.3，47.1，29.7，21.1，20.6，19.8；HRMS(ESI)，m/z：C₁₆H₁₉ClN₃ [M+H]⁺，理论值288.1268，实测值288.1268。

  5-(4-硝基苄基)-2, 3-二甲基-哌啶并[2, 3-b]吡嗪(3b)：淡黄色固体，收率75.4%。熔点115~117℃。¹H NMR (400MHz，CDCl₃)δ：8.16(m，2H)，7.43(d，J=8.8Hz，2H)，4.89(s，2H)，3.32(m，2H)，2.92(t，J=6.4Hz，2H)，2.35(s，3H)，2.30(s，3H)，2.04(m，2H)；¹³C NMR (101MHz，CDCl₃)δ：150.0，146.7，141.4，137.1，135.6，134.5，129.8，128.1，127.3，126.2，50.6，47.2，30.6，21.7，21.4，20.5；HRMS(ESI)，m/z：C₁₆H₁₈N₄O₂ [M+H]⁺，理论值299.1508，实测值299.1512。

  5-(4-氟苄基)-2, 3-二甲基-哌啶并[2, 3-b]吡嗪(3c)：无色油状物，收率67.2%。¹H NMR (600MHz，DMSO-d₆)δ：7.34~7.23(m，2H)，7.16~6.99(m，2H)，4.72(s，2H)，3.29~3.23(m，2H)，2.76(t，J=6.4Hz，2H)，2.24(s，3H)，2.24(s，3H)，1.92~1.86(m，2H)；¹³C NMR (151MHz，DMSO-d₆) δ：162.0，149.3，145.3，136.0，135.4，134.8，129.5，115.2，49.3，46.5，29.7，21.2，20.6，19.9；HRMS (ESI)，m/z：C₁₆H₁₉FN₃ [M+H]⁺，理论值272.1563，实测值272.1565。

  5-(4-甲基苄基)-2, 3-二甲基-哌啶并[2, 3-b]吡嗪(3d)：无色油状物，收率69.1%。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ：7.13 (d，J=8.0Hz，2H)，7.09(d，J=8.0Hz，2H)，4.69(s，2H)，3.27~3.19(m，2H)，2.75(t，J=6.4Hz，2H)，2.25(s，3H)，2.24(s，3H)，2.23(s，3H)，1.92~1.82(m，2H)；¹³C NMR (151MHz，DMSO-d₆) δ：149.9，145.7，136.2，136.1，136.0，135.7，129.3，127.9，50.0，46.8，30.2，21.6，21.1，21.0，20.3；HRMS(ESI)，m/z：C₁₇H₂₂N₃ [M+H]⁺，理论值268.1813，实测值268.1814。

  5-(3-甲氧基苄基)-2, 3-二甲基-哌啶并[2, 3-b]吡嗪(3e)：无色油状物，收率66.3%。¹H NMR (400MHz，CDCl₃)δ：7.22(t，J=7.9Hz，1H)，6.86(d，J=7.1Hz，2H)，6.80~6.76(m，1H)，4.80(s，2H)，3.77(s，3H)，3.31~3.25(m，2H)，2.88(t，J=6.5Hz，2H)，2.34(s，3H)，2.32(s，3H)，1.98(m，2H)；¹³C NMR (101MHz，CDCl₃)δ：159.7，150.0，146.3，140.6，136.5，135.3，129.3，120.2，113.5，112.0，55.1，50.6，46.8，30.4，21.5，21.2，20.2；HRMS(ESI)，m/zC₁₇H₂₁N₃O [M+H]⁺，理论值284.1763，实测值284.1776。

  5-(4-氯苄基)-2, 3-二甲基-哌啶并[2, 3-b]吡嗪(3f)：白色固体，收率60.8%，熔点59~61℃。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：7.26(m，2H)，7.21(m，2H)，4.77(s，2H)，3.26(m，2H)，2.88(t，J=6.5Hz，2H)，2.35(s，3H)，2.32(s，3H)，1.98(m，2H)；¹³C NMR(101MHz，CDCl₃) δ：150.1，146.6，139.6，137.0，135.6，132.8，129.4，128.7，50.4，47.1，30.6，21.7，21.4，20.5；HRMS(ESI)，m/zC₁₆H₁₈N₃Cl [M+H]⁺，理论值288.1268，实测值288.1264。

  5-(2-氰基苄基)-2, 3-二甲基-哌啶并[2, 3-b]吡嗪(3g)：白色固体，收率为58.8%。熔点106~108℃。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：7.65(dd，J=7.7、1.0 Hz，1H)，7.51(m，1H)，7.44(dd，J=7.8、0.6 Hz，1H)，7.33(m，1H)，5.01(s，2H)，3.39(m，2H)，2.91(t，J=6.5Hz，2H)，2.35(s，3H)，2.30(s，3H)，2.05(m，2H)；¹³C NMR (101MHz，CDCl₃)δ：149.9，146.7，143.5，137.7，135.7，133.0，133.0，128.7，127.5，118.0，112.0，49.7，47.9，30.4，21.6，21.5，20.5。

  5-(苄基)-2, 3-二甲基-哌啶并[2, 3-b]吡嗪(3h)：无色油状物，收率77.2%，¹H NMR (600MHz，DMSO-d₆) δ：7.30 (t，J=7.4Hz，2H)，7.23(dd，J=16.4、7.5 Hz，3H)，4.75(s，2H)，3.30~3.25(m，2H)，2.77(t，J=6.4Hz，2H)，2.25(s，3H)，2.23(s，3H)，1.94~1.87(m，2H)；¹³C NMR (151MHz，DMSO-d₆) δ：149.9，145.8，139.1，136.2，135.7，128.8，127.9，127.1，50.4，47.0，30.2，21.3，21.0，20.3；HRMS (ESI)，m/zC₁₆H₂₀N₃ [M+H]⁺，理论值254.1657，实测值254.1658。

  5-(3-氯-4-氟苄基)-2, 3-二甲基-哌啶并[2, 3-b]吡嗪(3i)：浅紫色油状物，收率57.6%。¹H NMR (400 MHz，CDCl₃) δ：7.33 (dd，J=7.1、2.1 Hz，1H)，7.05(t，J=8.7Hz，1H)，4.74(s，2H)，3.31~3.24(m，2H)，2.88(t，J=6.5Hz，2H)，2.35(s，1H)，2.32(s，1H)，2.04~1.95 (m，2H)；¹³C NMR (101MHz，CDCl₃) δ：158.3，149.7，146.4，137.0，136.1，135.4，129.9，127.5，120.8，116.5，49.9，46.9，30.3，21.5，21.2，20.2；HRMS(ESI)，m/zC₁₆H₁₇N₃ClF [M+H]⁺，理论值306.1173，实测值306.1180。

  5-(3-氟苄基)-2, 3-二甲基-哌啶并[2, 3-b]吡嗪(3j)：无色油状物，收率为60.3%。¹H NMR (400 MHz，CDCl₃)δ：7.29~7.22(m，1H)，7.05(d，J=7.7Hz，1H)，6.99(dd，J=9.8、2.2 Hz，1H)，6.92(m，1H)，4.81(s，2H)，3.32~3.19(m，2H)，2.89(t，J=6.5Hz，2H)，2.35(s，3H)，2.32(s，3H)，2.05~1.94(m，2H)；¹³C NMR (101MHz，CDCl₃) δ：164.2，149.8，146.5，141.8，136.8，135.3，129.8，123.3，114.7，113.8，50.4，46.9，30.3，21.5，21.2，20.2；HRMS(ESI)，m/zC₁₆H₁₈N₃F [M+H]⁺，理论值272.1563，实测值272.1565。

  1.3   抗血小板聚集活性评价^[15]

  家兔(3~5 kg)心脏取血，以质量分数为3.8%的枸橼酸钠溶液抗凝，1000r/min离心15min，吸取上清液即得富血小板血浆(PRP)。剩余部分以3000r/min离心10min，即得贫血小板血浆(PPP)，按照Born比浊法进行血小板聚集实验。取250μL PPP于测试杯中，用于调零。于另一测试杯中加入238μL PRP，加入待测化合物2μL(化合物用DMSO配制成终浓度为1.6、1.2、0.8、0.4、0.2 mmol/L溶液，空白组加入2μL DMSO)，充分混匀，放置预温通道预温3min后转移至测试通道，加入磁珠，搅拌下加入10μL ADP(终浓度为10μmol/L)，开始测试。待测试完成后记录5min内最大血小板聚集率，并计算出目标化合物对血小板聚集的抑制率(Aggregation inhibition rate，AIR)，实验重复6次，阳性对照为川芎嗪、阿司匹林，并用Graphpad Prism 8软件计算出各目标化合物抗血小板聚集活性的IC₅₀值。

  $ {\rm{AIR}} = \frac{{空白组聚集率 - 给药组聚集率}}{{空白组聚集率}} $

  (1)

  当血管内皮损伤和动脉粥样硬化斑块破裂后，血小板会被激活，血小板发生一系列的级联反应，分泌各种因子如ADP和TXA2等，从而进一步促进血小板聚集。本实验采用ADP诱导血小板聚集来测试目标化合物的抗血小板聚集活性。由表 1可见，在所制备的10个哌啶并[2, 3-b]吡嗪类化合物中，化合物3a、3c、3d、3e、3f、3g、3h、3j对ADP诱导的血小板凝集抑制活性优于母体化合物川芎嗪，其中化合物3h(IC₅₀=1.24mmol/L)的活性最佳，显著高于先导化合物川芎嗪(IC₅₀=3.96mmol/L)，约为阿司匹林(IC₅₀=2.41mmol/L)的两倍。初步构效关系分析表明，当目标化合物苯环上具有强吸电子的硝基(3b)和多卤取代(3i)时，导致其活性丧失；苯环连有供电子基团的化合物(3d、3e)优于含吸电子基的化合物；苯环上无取代基(3h)时活性最佳。据文献报道，噻吩并吡啶类化合物与活性位点主要存在三个较强的相互作用，即芳香环的疏水作用、氢键作用和电性作用^{[16, 17]}。在所设计的化合物中，芳环上无取代基时活性最佳，推测为当芳环上无取代时，更有利于化合物与活性位点的疏水腔紧密结合，从而发挥疏水作用。

  表 1

  

  表 1  化合物3a~3j体外抗ADP诱导的血小板聚集活性(IC₅₀)

  Table 1.  Compound 3a~3j anti-ADP-induced platelet aggregation activity in vitro (IC₅₀)

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  化合物	IC50/(mmol/L)	化合物	IC50/(mmol/L)
  川芎嗪	3.96	3e	1.56
  阿司匹林	2.41	3f	2.86
  3a	2.60	3g	1.80
  3b	-	3h	1.24
  3c	2.48	3i	-
  3d	1.53	3j	2.03

  2.   结论

  本文以2, 3-二氨基吡啶和2, 3-丁二酮为起始原料，依次经环化、催化氢化得到关键中间体哌啶并[2, 3-b]吡嗪，再与取代苄溴经过亲核取代反应得到10个哌啶并[2, 3-b]哌嗪类衍生物。采用Born比浊法初步测试了化合物对ADP诱导的血小板聚集的抑制活性，结果表明，部分化合物具有一定的抗血小板聚集活性，其中3h(IC₅₀=1.24mmol/L)的活性最佳，显著优于母体化合物川芎嗪(IC₅₀=3.96mmol/L)和阳性对照药阿司匹林(IC₅₀=2.41mmol/L)。本文结果可为后续抗血小板聚集活性药物的设计和开发提供参考。

  
  
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  图式 1  三种噻吩并吡啶类药物及本文目标化合物的结构

  Scheme 1  Structures of three thienopyridine drugs and the target compounds in this article

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  图式 2  目标化合物的合成路线

  Scheme 2  Synthetic route of target compounds

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  表 1  化合物3a~3j体外抗ADP诱导的血小板聚集活性(IC₅₀)

  Table 1.  Compound 3a~3j anti-ADP-induced platelet aggregation activity in vitro (IC₅₀)

  化合物	IC50/(mmol/L)	化合物	IC50/(mmol/L)
  川芎嗪	3.96	3e	1.56
  阿司匹林	2.41	3f	2.86
  3a	2.60	3g	1.80
  3b	-	3h	1.24
  3c	2.48	3i	-
  3d	1.53	3j	2.03

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