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• 氧氟沙星 (Ofloxacin，OFL) 是一种广谱性喹诺酮类抗菌药，广泛用于治疗人和动物泌尿、呼吸道、胃肠系统细菌感染性疾病。食用OFL残留超标的畜禽产品，会对人体产生危害。OFL在动物食品中的残留问题已经引起了广泛重视^[1]，我国《兽药管理条例》规定，自2015年12月起停止在食品动物中使用OFL等4种兽药。动物性食品基质复杂，提取困难，使得其残留量难以准确测定。目前，常采取的提取动物食品中残留OFL的方法有液-液微萃取法^[2]、微波辅助提取法^[3]和固相萃取 (SPE) 法^[4]等。其中，SPE法兼具浓缩与净化功能，是一种高效的预处理方法，但传统的SPE材料选择性不强，富集分析物的同时，大量基体和干扰物也被富集，干扰后续分析。因此，制备克服上述缺陷的新型吸附材料十分必要。

  分子印迹聚合物 (Molecularly imprinted polymer，MIP)^[5]是一种对目标分子具有特异识别性能的材料，已被广泛应用在SPE、色谱分离等方面^[6]。郭艳玲等^[7]以OFL为模板分子，3-氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体，十六烷基三甲基溴化铵为致孔剂，采用溶胶凝胶法合成具有磁响应性的分子印迹材料。刘芃岩等^[8]采用本体聚合法制备左氧氟沙星、环丙沙星双模板分子印迹聚合物，并对氟喹诺酮类药物进行在线固相萃取-高效液相色谱-离子阱质谱分析，效果良好。表面印迹^[9]是将有结合位点的MIP接枝到载体表面，与其他传统方法相比，具有目标分子更易接近印迹位点、吸附速度更快等优点^[10]。

  粉煤灰 (Fly ash cenosophere，FACs) 是燃煤电厂排出的一种具有火山灰活性、呈颗粒状的微细工业固体废弃物，其形态多呈球壳结构。与碳纳米管、石墨烯等常用载体相比，其表面有较大孔径且富含大量Si-OH，便于改性，可将其作为表面印迹载体材料。Pan等^[11]以FACs为基质，采用乳液聚合法制备对双酚A具有磁响应性分子印迹材料，并以其作为SPE填料，对蔬菜和水样中的双酚A进行富集。

  本文以KH570修饰的FACs为基质，通过表面印迹法制备OFL MIP，并将其作为SPE填料，建立了MIPSPE-超高效液相色谱 (UPLC) 方法，用于鸡肉、鸡肝等样品中OFL的分离分析，效果良好。

  1   实验部分

  1.1   仪器与试剂

  TU-1901型紫外可见分光度计，北京普析通用仪器有限公司；AS380傅立叶变换红外光谱仪，美国尼高力公司；ACQUITY超高效液相色谱仪，Waters科技有限公司；S-4300扫描电子显微镜，Hitachi公司；SHB-3循环水多用真空泵，郑州杜甫仪器厂；DK-98-1电热恒温水浴锅，北京泰克仪器有限公司；氮吹仪，Organomation公司。

  FACs，淄博玉蒙耐火材料有限公司；OFL、麻保沙星 (Marbofloxacin，MBF)、恩诺沙星 (Enrofloxacin，ENR)、加替沙星 (Gatifloxacin，GAT，湖北康宝泰精细化工有限公司；α-甲基丙烯酸 (MAA)，天津市科密欧化学试剂中心；乙二醇二甲基丙烯酸酯 (EDMA)，东京化成工业株式会社；偶氮二异丁腈 (AIBN)，北京化工厂；以上试剂均为分析纯级。γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷 (KH-570)，南京普优化工厂；实验所用甲醇和乙腈均为色谱纯级试剂。

  1.2   仪器工作条件

  色谱柱：C18 4.6mm×200mm，5μm；柱温为25℃；流动相为乙腈-0.5%乙酸水溶液 (83 :17，体积比，下同)，流速为0.5mL/min；进样量10μL；紫外检测波长为298nm。

  1.3   FACs微球选种、活化与硅烷化

  选种：称取200g FACs，水选种子法取漂珠，60℃烘干12h，备用。称取100g FACs漂珠置于马弗炉中，煅烧8h，除去碳单质及其他杂质，过100目筛，备用。

  活化：称取上述制备的FACs 10g，加入200mL 3mol/L盐酸水溶液中，回流条件下搅拌6h，除去FACs中少量的无机杂质，并增加表面的羟基数目，用蒸馏水洗至中性，真空干燥备用。

  硅烷化：称取2.0g活化FACs，加入120mL无水甲苯，磁力搅拌下用恒压滴液漏斗逐滴滴加适量的KH570，充氮排氧，70℃水浴搅拌加热24h，产物依次经甲苯、丙酮、乙醚、甲醇洗涤，真空干燥，得到表面修饰有双键的FACs。

  1.4   MIP的制备

  将0.1852g (0.5mmol) 模板分子OFL和0.1722g (2mmol) 功能单体MAA溶于50mL甲醇-甲苯溶液 (9 :1)，超声，静置过夜。加入700mg硅烷化FACs、1.9829g (10mmol) 交联剂EDMA和30mg AIBN。充氮排氧数次后将反应器密封，60℃水浴磁力搅拌反应24h。抽滤后用甲醇-乙酸 (9 :1) 混合溶剂索氏提取24h，再用甲醇除去残留的乙酸，70℃真空干燥，得到FACs MIP (MIP_FACs)。将硅烷化FACs换为硅基化硅胶，其余步骤同上，制备得到MIP_SiO2。

  非印迹聚合物 (NIP_FACs、NIP_SiO2) 的制备除不加模板分子外，其余步骤同上。

  1.5   MIP的吸附性能研究

  1.6   固相萃取

  1.5.2   MIP选择性吸附性能的研究

  取MIP和NIP各20mg，分别加入0.07mg/mL OFL、恩诺沙星、加替沙星、麻保沙星标准溶液，静置12h，根据UPLC中各化合物的峰面积计算吸附量。

  1.5.1   MIP吸附等温线的研究

  称取20mg MIP和NIP各10份，分别加入一系列不同浓度 (0.01~0.1mg/mL) 的标准溶液，静置12h。利用UPLC测定溶液中吸附前后OFL浓度，平行测定3次，计算聚合物对OFL的吸附量。

  1.6.2   固相萃取小柱的制备

  取100mg MIP，湿法均匀装填入商品SPE柱中，加筛板压实，制成MIPSPE柱。依次用3mL水和5mL甲醇活化，用上述上清液上样，然后用3mL水淋洗，最后用10mL甲醇-乙酸 (8 :2) 作为洗脱液进行洗脱，用N₂将洗脱液吹至1mL，浓缩液经UPLC检测。

  UPLC检测使用ACQUITY UPLC BEH C18 (1.7μm，2.1×100mm) 色谱柱，柱温为25℃；流动相为乙腈-0.5%乙酸水溶液 (83 :17)，流速为0.5mL/min；进样量10μL；紫外检测波长298nm。

  1.6.1   样品前处理

  分别取鸡胗、鸡心、鸡肉及鸡肝样品各5.0g，绞碎后置于离心管中，样品中加入一定量的标准溶液，避光静置20min。加10mL甲醇，超声提取30min，3000r/min离心15min，取上清液，残渣中再次加入10mL甲醇重复提取一次，合并上清液，用正己烷脱脂萃取2次。

  2   结果与讨论

  2.1   功能单体的选择

  模板分子与功能单体的结合力大小决定着MIP选择识别性能和亲和性能，因此，选择与模板分子作用力强的单体是印迹成功的第一步。图 1为模板及模板与三种功能单体MAA、丙烯酰胺 (AM)、2-乙烯基吡啶 (2-VP) 预聚作用后的紫外吸收谱线。由图可见，与模板相比，三种预聚体系的吸光度均明显减小，说明三种功能单体与模板分子之间均发生相互作用。对比三条曲线，模板与MAA形成的预聚体系吸光度变化最大，说明MAA与模板作用力最强。这是因为，模板分子结构中叔胺基具有一定的弱碱性，易与酸性功能单体MAA通过氢键、离子键作用形成可逆复合物，而中性单体2-VP、AM与模板作用相对较弱。因此，选择MAA为印迹单体。

  图 1  OFL与功能单体复合物的紫外光谱 Figure 1.  Ultraviolet spectra of OFL and functional monomers

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  2.2   聚合物的吸附性能研究

  采用静态平衡吸附法考察不同载体 (FACs与SiO₂) 制备聚合物的吸附性能，MIP_FACS、MIP_SiO2和NIP_FACS、NIP_SiO2对OFL的结合等温线见图 2。由图可见，在所考察的浓度范围内，MIP的饱和吸附量均高于相应NIP的吸附量，其主要原因是功能单体与模板分子之间相互作用可形成预聚体，使其在模板分子周围进行定向、有序排列，最终在MIP中留下与模板分子形态、大小相吻合的三维立体孔穴，并带有特异识别性的结合位点，对模板分子具有高度的响应性，可实现对模板分子的专一性识别；而NIP虽然与MIP化学组成相同，但由于不存在有效的印迹位点，因此与模板分子之间的作用明显减弱，吸附量较小。另外，MIP_FACs的吸附量明显高于MIP_SiO2，这主要是FACs本身的疏松多孔、比表面积大等特点，有利于吸附，从而提高了其结合能力。

  图 2  聚合物的吸附等温线 Figure 2.  Adsorption isotherm of the polymer

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  2.3   结构表征

  2.4   选择性吸附实验

  为考察MIP对模板分子OFL的特异识别性能，选取与OFL结构类似的3种喹诺酮药物麻保沙星、恩诺沙星、加替沙星作为竞争底物，测定吸附量 (见图 5)，并通过IPB值评价MIP的吸附特异性^[14]，IPB=(Q_MIP-Q_NIP)/Q_NIP。由图可见，MIP对氟喹诺酮药物均有吸附，对模板OFL吸附量 (IPB值为3.15) 明显高于3种类似物 (IPB分别为1.85、1.56、1.53)。这是由于印迹材料中含有OFL留下的印迹孔穴，与OFL的尺寸和结构十分吻合，而其他3种喹诺酮药物其结构不能与聚合物中印迹空穴的形态吻合，因此MIP对OFL表现出良好的特异性吸附。NIP对底物的吸附量均无明显差异，且均低于MIP上的吸附量，这是因为NIP无特异选择性吸附位点。

  图 5  MIP选择性吸附 Figure 5.  Selective adsorption of the MIP

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  2.5   固相萃取应用

  向空白鸡产品中添加一系列浓度OFL，经MIPSPE-UPLC分析测定，以峰面积 (y) 对浓度 (x) 进行回归分析，在0.01~8 mg/kg范围内，线性方程为y=61.27x+5.29，线性相关系数为0.9985。经MISPE小柱处理后，对鸡肉、鸡心、鸡肝、鸡胗样品中添加不同量的OFL进行加标回收试验。采用外标定量法，平行测定5次，回收率为82.0%~96.7%，方法的检出限 (S/N=3) 为1.03μg/kg。

  利用建立的MISPE-UPLC方法，对从市场所购鸡肉、鸡肝、鸡胗、鸡心等样品进行处理及分析，结果见表 1。在鸡肉、鸡心中未检出OFL，鸡胗、鸡肝样品中OFL的含量为1.08和2.31mg/kg。

  表 1  样品的测定结果及回收率 (n=5) Table 1.  Results of determination and recoveries in samples

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  样品	分析物	测定值/(mg/kg)	加标量/(mg/kg)	平均测定值/(mg/kg)	回收率/%	RSD /%
  			0.50	1.50	84.0	3.9
  鸡胗	OFL	1.08	1.00	1.97	89.0	5.2
  			1.50	2.47	92.7	2.6
  			0.50	2.73	84.0	4.1
  鸡肝	OFL	2.31	1.00	3.24	93.0	3.5
  			1.50	3.76	96.7	2.0
  			0.50	0.42	84.0	5.5
  鸡肉	OFL	未检出	1.00	0.88	88.0	4.0
  			1.50	1.43	95.3	2.3
  			0.50	0.41	82.0	3.7
  鸡心	OFL	未检出	1.00	0.92	92.0	2.5
  			1.50	1.39	92.7	1.7

  分别用MIP柱和C18柱对鸡肝产品进行相同的萃取处理，色谱分析见图 6。鸡肝原样品中的OFL不足以定量分析，经C18柱萃取后，样品中各组分的含量明显增加，但基质效应仍为明显；而经MIP萃取后，OFL得到选择性分离与富集，并有效地去除了基质干扰，可用于定量分析。

  图 6  鸡肝样品经固相萃取前后的色谱图 Figure 6.  UPLC chromatogram of OFL in chicken livers before and after MISPE

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  以上结果表明MIP柱对OFL具有良好的吸附选择性，能够高效净化和富集鸡肝中的OFL。

  2.3.1   红外谱图表征

  利用红外光谱对FACs、FACs-KH570、洗脱前含有模板的FACs-MIP、洗脱后的FACs-MIP进行分析，见图 3。图 3a中，1095.12cm^-1为Si—O—Si伸缩振动峰，3437.19cm^-1为Si—OH伸缩振动吸收峰，说明在活化的FACs表面存在着大量的羟基，为表面接枝改性提供了理论可能。图 3b中，Si—OH伸缩振动峰强度明显减弱，是由于接枝过程中载体表面发生水解缩合反应所致。在2921.38、2848.11 cm^-1出现C—H伸缩振动吸收，1728.62、1631.53 cm^-1处出现C O和C C的伸缩振动吸收峰，说明KH570成功接枝在FACs表面。图 3c中，1452.61cm^-1出现C—N振动吸收峰，属于模板分子OFL的特征峰，表明含有模板分子的MIP已包裹在载体表面。图 3d与3c对比，除OFL峰外，其余特征峰十分吻合，说明OFL成功从印迹层中洗脱下来，且保持原有的印迹层结构^[12]。

  图 3  样品红外光谱分析 Figure 3.  FI-IR analysis of samples

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  2.3.2   扫描电镜和氮气吸附脱附表征

  采用扫描电镜 (SEM) 对FACs和MIP的形貌进行表征。由图 4可见，FACs呈规整的球状结构，颗粒均匀，表面光滑。在其表面包裹印迹层制成MIP后，规整的球状结构未变，只是粒径明显增大，球体表面变得粗糙不平，这是由印迹材料的多孔性造成的。规整的结构与多孔表面对于其吸附等性能均是十分有利的。

  图 4  FACs和MIP的扫描电镜图 Figure 4.  SEM images of FACs and MIP

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  通过氮气吸附-脱附实验测得MIP的比表面积、孔容分别为81.253m²/g、0.217cm³/g，NIP的比表面积、孔容分别为93.186m²/g、0.305cm²/g。MIP与NIP的比表面积及孔容相差不大，但在吸附试验中MIP对OFL的吸附能力远高于NIP，说明MIP和NIP的不同吸附性能不完全归因于形貌上的差异，主要与产生专一性识别位点的印迹过程有关^[13]。

  3   结论

  以接枝双键的FACs为基质制备了OFL MIP，其对OFL的吸附量为49.28mg/g，明显高于以硅胶为载体制备的聚合物。将MIP作为固相萃取填料，用于鸡产品中OFL的分离与富集，结合UPLC法分析，回收率在82.0%~96.7%之间。MIPSPE柱对样品中基质的分离效果和去除能力均优于传统C18柱。本研究为喹诺酮类药物的分离与富集提供了新材料，同时也为FACs产品的高附加值利用提供了新思路。

• 1. [1]

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  图 1  OFL与功能单体复合物的紫外光谱

  Figure 1  Ultraviolet spectra of OFL and functional monomers

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  图 2  聚合物的吸附等温线

  Figure 2  Adsorption isotherm of the polymer

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  图 3  样品红外光谱分析

  Figure 3  FI-IR analysis of samples

  (a)：FACs；(b)：FACs-KH570；(c)：洗脱前含有模板的FACs-MIP；(d)：洗脱后的FACs-MIP

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  图 4  FACs和MIP的扫描电镜图

  Figure 4  SEM images of FACs and MIP

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  图 5  MIP选择性吸附

  Figure 5  Selective adsorption of the MIP

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  图 6  鸡肝样品经固相萃取前后的色谱图

  Figure 6  UPLC chromatogram of OFL in chicken livers before and after MISPE

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  表 1  样品的测定结果及回收率 (n=5)

  Table 1.  Results of determination and recoveries in samples

  样品	分析物	测定值/(mg/kg)	加标量/(mg/kg)	平均测定值/(mg/kg)	回收率/%	RSD /%
  			0.50	1.50	84.0	3.9
  鸡胗	OFL	1.08	1.00	1.97	89.0	5.2
  			1.50	2.47	92.7	2.6
  			0.50	2.73	84.0	4.1
  鸡肝	OFL	2.31	1.00	3.24	93.0	3.5
  			1.50	3.76	96.7	2.0
  			0.50	0.42	84.0	5.5
  鸡肉	OFL	未检出	1.00	0.88	88.0	4.0
  			1.50	1.43	95.3	2.3
  			0.50	0.41	82.0	3.7
  鸡心	OFL	未检出	1.00	0.92	92.0	2.5
  			1.50	1.39	92.7	1.7

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